ICS07.080

CCSA40

DB15

內蒙古自治區(qū)地方標準

DB15/T2027—2020

馬源性成分檢測方法

實時熒光PCR法

Real-timePCRMethodforAuthentificationofHorseDerivedMaterials

2020-10-20發(fā)布2020-11-20實施

內蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2027—2020

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

本文件由錫林郭勒職業(yè)學院、錫林郭勒食品藥品檢驗檢測和風險評估中心提出。

本文件由內蒙古自治區(qū)肉乳標準化技術委員會（SAM/TC39）歸口。

本文件起草單位：錫林郭勒職業(yè)學院、錫林郭勒食品藥品檢驗檢測和風險評估中心。

本文件主要起草人：郭梁、錢俊平、海小、徐偉良、劉國強、羅建興。

I

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馬源性成分檢測方法實時熒光PCR法

1范圍

本文件描述了動物產品（肉、乳）中馬源性成分的實時熒光PCR檢測方法。

本文件適用于鮮肉、鮮乳、加工肉制品、加工乳制品中馬源性成分的定性檢測。

本文件規(guī)定了鮮肉與加工肉制品的檢出限為0.1%（質量分數）；鮮乳與加工乳制品的檢出限為5%

（質量分數）。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T27403實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

實時熒光PCRrealtimePCR

在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時檢測整個PCR過程，對未知模板進行定性

或定量分析。

3.2

Ct值cyclethreshold

每個反應管內的熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環(huán)數。

3.3

陽性對照positivecontrol

用已知含有馬源性成分的樣品作陽性對照。

3.4

陰性對照negativecontrol

用已知不含有馬源性成分的樣品作陰性對照。

1

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3.5

空白對照blankcontrol

用等體積的滅菌水代替模板DNA作空白對照。

4原理

利用不同熒光基團標記特異性馬探針和質控探針，采用多重實時熒光PCR技術，對提取于鮮肉、鮮

乳、加工肉制品、加工乳制品的DNA進行擴增。在同一反應中對馬特異基因和質控基因同時擴增，兩種

熒光同時檢測。其中，同管質控探針的檢測旨在監(jiān)控擴增反應是否正常進行，避免假陰性結果。通過評

價Ct值判斷動物產品（肉、乳）是否含有馬源性成分。

5試劑和材料

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。實驗用水為符合GB/T6682規(guī)定的一級水。

5.1三氯甲烷。

5.2異戊醇。

5.3異丙醇。

5.495%乙醇。

5.575%乙醇。

5.6CTAB提取液：稱取10gCTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、40.6gNaCl、6.06gTrisbase（三

羥甲基氨基甲烷）、3.94gNa2EDTA（乙二胺四乙酸二鈉），加入800mL的水，在65℃水浴加熱溶解，

用HCl調節(jié)pH至8.0，加水定容至1000mL，在121℃條件下，滅菌30min。使用前加入終濃度為2%

的β-巰基乙醇。

5.7乳化劑：量取20mLTritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚，90%）、125mL乙醇（95%）、855mL

NaCl溶液（0.9g/L），加水定容至1000mL，在121℃條件下，滅菌30min。

5.8PBS緩沖液（磷酸緩沖液）：稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4，加入

800mL水溶解，用HCl調節(jié)pH至7.4，加水定容至1000mL，在121℃條件下，滅菌30min。

5.9實時熒光PCR反應混合液：1U～2U的Taq酶、1×PCR緩沖液、2.5mmol/L～4.0mmol/L的Mg2+、

0.2U～1U的UNG酶、0.2mmol/L的dNTP。也可以使用同等效果的商品試劑盒。

5.10馬源性成分擴增引物和探針詳見表1。

表1引物和探針序列

名稱序列（5’～3’）目標基因/大小

正向引物TTGAATCAGGCCATGAAGC

反向引物CTTACCTTGTTACGACTTGTCTC線粒體12SrRNA基因/121bp

馬特異性探針HEX-TTCATATGTTTGGGTCACGGTTTTATGT-TAMRA

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表1（續(xù)）

名稱序列（5’～3’）目標基因/大小

質控探針ROX-ACACACCGCCCGTCACCCT-BHQ-2

注：用滅菌水分別將上述引物和探針稀釋到10mol/L，探針需避光保存。

6儀器和設備

6.1實時熒光PCR儀：通道數≥3，溫度控制精度＜±0.1℃。

6.2核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。

6.3離心機：離心力≥12000g。

6.4微量移液器：0.5L～10L，10L～100L，20L～200L，100L～1000L。

6.5金屬浴或恒溫水浴鍋：溫度控制精度＜±0.5℃。

6.6pH計：0.01級。

6.7均質器。

6.8攪拌器。

6.9分析天平：感量0.1g和0.0001g。

6.10高壓滅菌鍋。

6.11旋渦混勻器。

7分析步驟

7.1樣品制備

利用均質器將固態(tài)樣品充分混勻，裝入清潔容器中，加封后，注明標記。利用攪拌器將液態(tài)樣品充

分混勻，裝入清潔容器中，加封后，注明標記。-20℃保存。

7.2DNA提取

7.2.1鮮肉及肉乳制品樣品（固態(tài)）

稱取100mg均質固態(tài)樣品于1.5mL滅菌離心管中；加入700LCTAB提取液（5.6），充分混勻，

置于65℃水浴30min，期間每隔5min顛倒混勻一次；13000rpm離心5min，轉移上清液于新離心管中，

加入等體積三氯甲烷和異戊醇混合液（體積比為24:1），旋渦混勻，13000rpm離心5min，取上清液于

新離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻，13000rpm離心5min，棄去上清液，75%乙醇洗滌兩次

（13000rpm離心30s棄去上清液），室溫晾干，加入20L～50L滅菌水溶解，-20℃保存。對陽性

對照和陰性對照進行同法操作。用滅菌水代替樣品進行核酸抽提作為提取空白對照。也可以使用同等效

果的DNA提取試劑盒。

3

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7.2.2鮮乳及乳制品樣品（液態(tài)）

量取50mL均質液態(tài)樣品于50mL滅菌離心管中；在4℃，7500rpm條件下，離心30min，去除離心

管上層乳脂和中間層的液體，保留底部沉淀；向離心管中加入600LPBS緩沖液（5.8），將沉淀懸浮

并全部轉移至1.5mL滅菌離心管中，在4℃，13000rpm條件下，離心10min，棄去上層液體，保留底

部沉淀；向離心管中加入60L乳化劑（5.7）和540LPBS緩沖液（5.8），振蕩至沉淀完全懸浮，置

于40℃恒溫水浴10min，在4℃，13000rpm條件下，離心10min，棄去上清液保留底部沉淀；加入500

LPBS緩沖液（5.8）懸浮沉淀，在4℃，13000rpm條件下，離心10min，棄去上清液保留底部沉淀；

后續(xù)提取步驟按照7.2.1方法進行。用滅菌水代替樣品進行核酸抽提作為提取空白對照。也可以使用同

等效果的DNA提取試劑盒。

7.2.3DNA濃度和純度的測定

分別檢測260nm和280nm處的吸光值A260和A280，按公式（1）計算DNA濃度，判定DNA的純度。當DNA

濃度在10ng/L～100ng/L，A260/A280比值在1.7～2.1之間時，適合實時熒光PCR反應。若濃度大于100

ng/L時，建議用滅菌水稀釋；若濃度小于10ng/L或比值小于1.7時，建議重新進行DNA提取。

c=A×N×50/1000???????????（1）

式中：

c—DNA濃度，單位為微克每微升（g/L）；

A—260nm處的吸光值；

N—核酸稀釋倍數。

7.3實時熒光PCR檢測

7.3.1實時熒光PCR反應體系

設置陽性對照、陰性對照、空白對照以及提取空白對照。所有樣品設置平行反應。實時熒光PCR反

應體系見表2。

表2實時熒光PCR反應體系

單位為微升

試劑體積

2×實時熒光PCR反應混合液10.0

正向引物（10mol/L）1.0

反向引物（10mol/L）1.0

馬特異性探針（10mol/L）0.5

質控探針（10mol/L）0.5

DNA模板（10ng/L～100ng/L）1.0

滅菌水6.0

總體積20.0

注：反應體系根據不同廠家的商品試劑盒或不同型號的實時熒光PCR儀進行調整。

7.3.2實時熒光PCR反應程序

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預變性：94℃30s，1個循環(huán)；94℃5s，60℃31s，40個循環(huán)，在60℃時收集熒光信號。

反應程序根據不同廠家的商品試劑盒或不同型號的實時熒光PCR儀進行調整。

8質量控制

以下條件有一條不滿足時，試驗視為無效：

a)空白對照：所有探針無熒光對數增長或Ct值≥40.0；

b)陰性對照：特異性探針無熒光對數增長或Ct值≥40.0；質控探針有熒光對數增長，Ct值≤

30.0；

c)陽性對照：特異性探針和質控探針均有熒光對數增長，且出現典型的擴增曲線，Ct值≤30.0；

d)平行反應結果不一致，需要重新擴增。

9結果判定與表述

9.1結果判定

在符合第8章的情況下：

a)特異性探針Ct值≤35.0且質控探針Ct值≤35.0，則判定為陽性；

b)特異性探針Ct值≥40.0且質控探針Ct值≤35.0，則判定為陰性；

c)特異性探針35.0＜Ct值＜40.0且質控探針Ct值≤35.0，則需要重復實驗；如再次擴增后特