ICS65.020.20

CCSB21

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2593—2022

冰草組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

Technicalcodeofpracticefortissuecultureofagropyroncristatum

2022-06-24發(fā)布2022-07-24實施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2593—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)和草原局提出并歸口。

本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)。

本文件主要起草人：徐春波、王勇、趙海霞。

I

DB15/T2593—2022

冰草組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了冰草組織培養(yǎng)的術(shù)語與定義、培養(yǎng)基、外植體、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、分化

培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗與移栽等基本內(nèi)容及技術(shù)要求。

本文件適用于冰草組織培養(yǎng)育苗。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T603化學(xué)試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備

NY/T2306-2013花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程

DB15/T1940-2020西部沙櫻組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語和定義

NY/T2306界定的術(shù)語和定義適用于本文件。

冰草agropyroncristatum(L.)gaertn

屬于禾本科（Gramineae）冰草屬（Agropyron）多年生草本植物。

幼穗youngear

生長2至5年、長度1cm～3cm的冰草孕穗。

種子seed

有生活力、飽滿的包含內(nèi)外稃的冰草種子。

成熟胚matureembryo

完熟期冰草種子的胚。

4環(huán)境與器具滅菌

1

DB15/T2593—2022

參照DB15/T1940執(zhí)行。

5培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基、1/2MS、改良MS培養(yǎng)基見附錄A。

母液的配制和保存

5.2.1配制

將常用試劑配制成50～100倍的母液，按照GB/T603規(guī)定方法配制。所用激素均配制濃度為0.5

mg/mL，配制方法詳見附錄B。

5.2.2保存

母液配制好分別貼上標(biāo)簽，注明溶液名稱、配制倍數(shù)、配制日期、配制者。母液貯存在4℃的冰箱

中。貯藏時間在3個月之內(nèi)，有霉菌和沉淀產(chǎn)生，則不得使用。

培養(yǎng)基的配制

5.3.1配制

配置1L培養(yǎng)基時，先加蒸餾水600ml～700ml，再加入7.5g瓊脂，加熱攪拌瓊脂融化后加入25g

蔗糖，攪拌溶解后再分別加入母液，攪拌均勻，加蒸餾水定容至1L。

5.3.2pH值調(diào)節(jié)

用1mol/L的NaOH將配制好的培養(yǎng)基調(diào)到pH值5.8～6.0，用酸度計或精密pH試紙測定。

5.3.3分裝和滅菌

配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝。分裝量以占培養(yǎng)容器的1/4～1/3為宜。切勿將培養(yǎng)基沾到瓶口和外壁上，

以免招致雜菌污染。分裝后立即加蓋，不同的處理做好標(biāo)記。分裝后進(jìn)行滅菌，121℃狀態(tài)下保持20min。

6外植體

外植體選擇

幼穗或成熟胚。

外植體制備

6.2.1幼穗

在超凈臺上用75%酒精脫脂棉球擦洗葉鞘表面消毒，剝出幼穗，切成0.3cm～0.5cm的小段。

6.2.2成熟胚

2

DB15/T2593—2022

種子用水浸泡2h～4h后，剝?nèi)?nèi)外稃，置于濕濾紙上吸脹4h。在超凈工作臺上75%酒精消毒30s，

無菌水沖洗至少3次后用0.2%升汞消毒5min，再用無菌水沖洗數(shù)次至少3次。置于鋪有濕無菌濾紙的培

養(yǎng)皿中，用解剖針從盾片處挑出胚。

7愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

幼穗

7.1.1培養(yǎng)基

幼穗愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良MS+2.0mg/L2，4-D。

7.1.2接種

將幼穗段接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每2.5cm2～3cm2接種1個，均勻擺放，封好皿口，標(biāo)明名

稱和日期。

7.1.3培養(yǎng)條件

24℃～26℃暗培養(yǎng)。

7.1.4培養(yǎng)時間

培養(yǎng)20d～30d。

成熟胚

7.2.1培養(yǎng)基

成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋0.2mol/L甘露醇+2.0mg/L2，4-D。

7.2.2接種

將成熟胚接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每1.5cm2～2cm2接種1個，均勻擺放，封好皿口，標(biāo)明名

稱和日期。

7.2.3培養(yǎng)條件

見本文件7.1.3。

7.2.4培養(yǎng)時間

培養(yǎng)14d～20d。

8增殖培養(yǎng)

幼穗

8.1.1培養(yǎng)基

幼穗增殖培養(yǎng)基為改良MS+2.0mg/L2，4-D+0.2mg/L6BA。

8.1.2接種

3

DB15/T2593—2022

在超凈工作臺上，將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基上，每4cm2～5cm2接種1個，均勻擺放，封

好皿口，標(biāo)明名稱和日期。

8.1.3培養(yǎng)條件

見7.1.3。

8.1.4培養(yǎng)時間

培養(yǎng)40d～50d；每20d換1次培養(yǎng)基。

成熟胚

8.2.1培養(yǎng)基

成熟胚增殖培養(yǎng)基為MS＋0.2mol/L甘露醇+2.0mg/L2，4-D+0.3mg/LABA。

8.2.2接種

在超凈工作臺上，將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基上，每3cm2～4cm2接種1個，均勻擺放，封

好皿口，標(biāo)明名稱和日期。

8.2.3培養(yǎng)條件

見7.1.3。

8.2.4培養(yǎng)時間

培養(yǎng)40d～60d；每20d換1次培養(yǎng)基。

9分化培養(yǎng)

幼穗

9.1.1培養(yǎng)基

幼穗分化培養(yǎng)基為MS+3.0mg/LKT+0.5mg/LNAA。

9.1.2接種

在超凈工作臺上，挑選狀態(tài)較好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，每5cm2～6cm2接種1個，均勻擺

放，封好瓶口，標(biāo)明名稱和日期。

9.1.3培養(yǎng)條件

24℃～26℃，全天光照培養(yǎng)，光照強度3000Lux～4000Lux。

9.1.4培養(yǎng)時間

培養(yǎng)40d～60d；每20d換1次培養(yǎng)基。

成熟胚

9.2.1培養(yǎng)基

4

DB15/T2593—2022

成熟胚分化培養(yǎng)基為MS＋3.0mg/LKT＋1.0mg/LNAA。

9.2.2接種

在超凈工作臺上，挑選狀態(tài)較好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，每5cm2～6cm2接種1個，均勻

擺放，封好瓶口，標(biāo)明名稱和日期。

9.2.3培養(yǎng)條件

24℃～26℃，每天光照時間16h，光照強度3000Lux～4000Lux。

9.2.4培養(yǎng)時間

培養(yǎng)60d～90d；每20d換1次培養(yǎng)基。

10生根培養(yǎng)

幼穗

10.1.1培養(yǎng)基

幼穗生根培養(yǎng)基為改良1/2MS+0.1mg/LNAA。

10.1.2接種

在超凈工作臺上，將長至3cm～4cm的小苗逐一轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，每器皿接種1苗，封好瓶口，標(biāo)

明名稱和日期。

10.1.3培養(yǎng)條件

見9.1.3。

10.1.4培養(yǎng)時間

培養(yǎng)20d～30d。

成熟胚

10.2.1培養(yǎng)基

成熟胚生根培養(yǎng)基為1/2MS＋0.5mg/LNAA。

10.2.2接種

在超凈工作臺上，將長至3cm～4cm的小苗逐一轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，每器皿接種1苗，封好瓶口，

標(biāo)明名稱和日期。

10.2.3培養(yǎng)條件

見9.2.3。

10.2.4培養(yǎng)時間

培養(yǎng)20d～30d。

5

DB15/T2593—2022

11煉苗與移栽

煉苗

選擇生長健壯的組培苗，打開封口膜，放在自然光、室溫下2d～3d。

基質(zhì)

營養(yǎng)土與蛭石1:1混合。經(jīng)高壓滅菌后裝入花盆備用。

移栽

取出組培苗，洗掉培養(yǎng)基，栽入花盆，澆水，放入溫室，套上帶孔的塑料袋保濕，一周后取掉，適

當(dāng)保溫，常規(guī)管理。待苗長至20cm～30cm移栽至大田。

6

DB15/T2593—2022

A

A

附錄A

（規(guī)范性）

基本培養(yǎng)基成分

基本培養(yǎng)基成分見表A.1。

表A.1基本培養(yǎng)基成分

類型組分MS培養(yǎng)基改良MS培養(yǎng)基

KNO31900.01900.0

NH4NO31650.0956.0

大量元素MgSO4·7H2O370.0370.0

KH2PO4170.01160.0

CaCl2·2H2O440.096.0

MnSO4·4H2O22.3022.30

ZnSO4·7H2O8.6008.600

H3BO36.2006.200

微量元素KI0.8300.830

Na2MoO4·6H2O0.2500.250

CuSO4.5H2O40.0250.025

CoCl2.6H2O0.0250.025

Na2-EDTA37.3037.30

鐵鹽

FeSO4.7H2O27.8027.80

甘氨酸2.0002.000

鹽酸吡哆辛0.5000.500

鹽酸硫銨素0.1002.000

有機物

煙酸0.5001.000

肌醇100.0100.0

尼克酸--------

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DB15/T2593—2022

B

B

附錄B

（規(guī)范性）

激素的配制

激素配置方法見表B.1。

表B.1激素配置方法

類別名稱配制方法滅菌方式存儲方式

2，4-二氯苯氧乙酸

（2，4-D）用適量無水乙醇溶解后加入去離冷藏