ICS67.050

CCSX04

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2785—2022

食用向日葵品種純度鑒定SNP標(biāo)記法

Varietalverificationoftheconfectionsunflower(Helianthusannuus

L.)SNPmarkertechnology

2022-08-30發(fā)布2022-09-30實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2785—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC20）歸口。

本文件起草單位：三瑞農(nóng)業(yè)科技股份有限公司、華智生物技術(shù)有限公司、巴彥淖爾市產(chǎn)品質(zhì)量計(jì)量

檢測(cè)中心（巴彥淖爾市天賦河套質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)研究中心）、內(nèi)蒙古自治區(qū)質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化研究院。

本文件主要起草人：JIUHUANFENG（馮九煥）、唐順學(xué)、陳海軍、李昊佼、李新、劉劼、鄔冬梅、

秀芳、侯敏、魏志恒、白君君、王祉諾、賈向春、靳存旺。

I

DB15/T2785—2022

食用向日葵品種純度鑒定SNP標(biāo)記法

1范圍

本文件規(guī)定了利用單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism,SNP）分子標(biāo)記進(jìn)行食用向

日葵（HelianthusannuusL.）品種純度鑒定的術(shù)語(yǔ)定義、原理、儀器設(shè)備及耗材、試劑及溶液配制、

檢測(cè)程序、數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析、鑒定結(jié)果報(bào)告等要求。

本文件適用于食用向日葵品種的純度鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣

GB/T3543.5農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度鑒定

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

品種純度varietalpurity

品種在特征特性或DNA分子標(biāo)記基因型方面一致性的程度。通常用供檢樣品中本品種的個(gè)體數(shù)占檢

測(cè)樣品個(gè)體總數(shù)的百分率表示。

異型個(gè)體off-typeindividual

供檢樣品中，與本品種在DNA標(biāo)記位點(diǎn)或一個(gè)或多個(gè)遺傳性狀上存在差異的個(gè)體。

單核苷酸多態(tài)性singlenucleotidepolymorphism（SNP）

基因組中基于單個(gè)核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性。

推薦標(biāo)記recommendedmarkers

品種純度鑒定中優(yōu)先選用的具有良好基因型分型質(zhì)量的標(biāo)記組合。

1

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競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)kompetitiveallelespecificPCR（KASP）

通過(guò)引物末端特異性堿基競(jìng)爭(zhēng)性匹配DNA模板，實(shí)現(xiàn)SNP基因型分型的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

基因型分型genotyping

通過(guò)檢測(cè)方法確定某品種(或遺傳材料)的基因、DNA區(qū)段或遺傳標(biāo)記的基因型。

4原理

不同向日葵品種的基因組間存在核苷酸序列差異，其中單核苷酸（A、C、G、T）多態(tài)性(SNP)在基

因組內(nèi)分布廣泛、密度高，這種差異可以通過(guò)熒光標(biāo)記的KASP基因型分型等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

利用一套多態(tài)性高、具良好基因型分型質(zhì)量的推薦標(biāo)記，檢測(cè)供檢樣品中不同個(gè)體間的基因型差

異，統(tǒng)計(jì)供檢樣品中異型個(gè)體數(shù)，從而對(duì)供檢樣品整體的遺傳一致性程度進(jìn)行測(cè)算，判定品種的純度。

5儀器設(shè)備及耗材

主要儀器設(shè)備及耗材為：

——實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、全自動(dòng)樣品快速研磨儀、高速離心機(jī)、核酸濃度測(cè)定儀、微孔板離心

機(jī)、微量移液器、恒溫水浴鍋、高壓滅菌鍋、酸度計(jì)、磁力攪拌器、電子天平、冰箱等；

——96孔深孔板、384孔PCR板（白色）、微量離心管、普通槍頭、封板膜、鋼珠等。

6試劑及溶液配制

試劑要求

6.1.1所用試劑至少為分析純或分子生物學(xué)純。試劑配制用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水要求。

6.1.2所需試劑為十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA?2H2O）、三羥甲基氨基甲烷

（Tris-base）、醋酸銨、三氯甲烷、異丙醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、乙

醇、PCRMasterMix等。

溶液配制

6.2.12mol/LTris-HCl溶液（pH8.0）：稱取Tris堿242.8g，溶于850mL水中，加入濃鹽酸調(diào)

pH至8.0，定容至1000mL，高壓滅菌。

6.2.20.25mol/LEDTA溶液（pH8.0）：稱取84.06gNa2EDTA?2H2O，溶于900mL水中，加固體NaOH

（約20g）調(diào)pH至8.0，加水定容至1000mL，高壓滅菌。

6.2.310%SDS溶液：稱取100gSDS，加水定容至1000mL。

6.2.4溶液I：取2mol/LTris-HCl（pH8.0）、0.25mol/LEDTA溶液（pH8.0）、10%SDS各100

mL，加水900mL，調(diào)pH至8.0，定容至1000mL。用時(shí)按2%（M/V）加入聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP-

K30）。

6.2.5溶液Ⅱ：取500g醋酸銨固體，加水定容至860mL，抽濾后放4℃冰箱備用。

6.2.62×KASPMasterMix：包括TaqDNA聚合酶、通用熒光引物、dNTP、鎂離子、ROX內(nèi)參熒光染料。

2

DB15/T2785—2022

6.2.7KASP引物：包括10μMPrimer_AlleleX、10μMPrimer_AlleleY、10μMPrimer_AlleleC。

7檢測(cè)程序

樣品準(zhǔn)備

7.1.1供檢樣品可以為種子或幼葉。

7.1.2除供檢樣品外，必要時(shí)應(yīng)提供對(duì)照品種、其親本或親本之一的樣品。

7.1.3供檢樣品為種子時(shí)，重量應(yīng)不低于500g。

7.1.4從供檢樣品分取規(guī)定數(shù)量的試樣用于檢測(cè)，試樣的分取應(yīng)符合GB/T3543.2的要求。

7.1.5依據(jù)需達(dá)到的品種純度的國(guó)家規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，試樣數(shù)量應(yīng)符合GB/T3543.5的規(guī)定，或通過(guò)

Seedcalc8計(jì)算。比如，在95%置信水平，要達(dá)到96%、98%、99%以上純度質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)樣品需檢測(cè)的

種子數(shù)應(yīng)分別不少于100粒、200粒、400粒。

DNA提取

DNA提取采用下列方法，其它能達(dá)到后續(xù)操作質(zhì)量要求的DNA提取方法均適用于本文件：

——切取向日葵種子約1/3（通常選取非胚芽一端），或剪取葉片0.5cm～1cm大小，放入96

深孔板中，每孔1個(gè)樣品。放入4mm鋼珠，加100μL溶液I，用全自動(dòng)樣品快速研磨儀50

Hz研磨60s，重復(fù)2～3次，使樣品完全破碎；

——于4000rpm離心約3min，小心打開膠蓋（注意避免樣品間污染）。加500μL溶液Ⅰ，蓋

上膠蓋，顛倒搖勻，65℃恒溫水浴30min～50min；

——加300μL溶液II，顛倒搖勻后，于3600rpm離心20min；

——取上清液300μL移入新的96深孔板，加入0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇，蓋上膠蓋，顛倒混

勻，-20℃靜置10min。4000rpm離心15min，棄去上清液(勿使DNA倒掉)；

——加入約300μL70%乙醇，蓋上膠蓋，顛倒搖勻后4000rpm離心15min。70%乙醇重復(fù)洗滌

一次，方法同上；

——室溫放置晾干，待DNA充分干燥后，加200μLddH2O充分溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR檢測(cè)

7.3.1總則

依據(jù)檢測(cè)目的，統(tǒng)籌考慮檢測(cè)規(guī)模和成本，確定適宜的樣品檢測(cè)數(shù)量及標(biāo)記數(shù)量。

配制反應(yīng)體系時(shí)，每板應(yīng)同時(shí)設(shè)置2個(gè)無(wú)DNA模板陰性對(duì)照（NTC）。根據(jù)NTC信號(hào)強(qiáng)弱，判

斷最適擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。若NTC信號(hào)過(guò)高，則應(yīng)降低擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

7.3.2推薦標(biāo)記

推薦標(biāo)記篩選原則及使用要求如下：

——選擇遺傳多態(tài)性高、基因組上分布均勻、基因型分型質(zhì)量好、以及重復(fù)穩(wěn)定性好的標(biāo)記；

——本文件優(yōu)先選用了17個(gè)SNP分子標(biāo)記作為推薦標(biāo)記（見附錄A），用于檢測(cè)所有試樣個(gè)體的

基因型；

——對(duì)于仍處于遺傳分離或不穩(wěn)定的標(biāo)記位點(diǎn)應(yīng)予以剔除。若17個(gè)推薦標(biāo)記中，有3個(gè)以上標(biāo)

記位點(diǎn)出現(xiàn)嚴(yán)重的遺傳分離，可終止該樣品的純度鑒定。

7.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系

3

DB15/T2785—2022

本文件推薦以下反應(yīng)體系，其它兼容KASP的檢測(cè)體系均適用于本文件。依據(jù)PCR緩沖液類

型、微孔板類型及檢測(cè)平臺(tái)，試驗(yàn)條件可做相應(yīng)調(diào)整。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系參照表1進(jìn)行配制，其中2×KASPMasterMix含有dNTP、TaqDNA聚合

酶、通用熒光引物及ROX熒光內(nèi)參。

表1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

成分原濃度終濃度推薦用量（μL）

DNA25ng/μL～50ng/μL7.5ng/μL～15ng/μL1.20

2×KASPMasterMix2×1×2.00

Primer_AlleleX10μM0.15μM0.06

Primer_AlleleY10μM0.15μM0.06

Primer_C10μM0.40μM0.16

ddH2O--0.52

總體積--4.00

7.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序

熒光定量PCR反應(yīng)通常采用下列程序：

——預(yù)變性：94℃預(yù)變性15min；

——梯度PCR：94℃變性20s，65℃退火和延伸60s（每循環(huán)降低0.8℃），10個(gè)循環(huán)；

——擴(kuò)增：94℃變性20s，57℃退火和延伸60s，熒光信號(hào)讀取，30個(gè)循環(huán)。

注：以上為推薦的基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)平臺(tái)的擴(kuò)增程序，其它如GenomicsSNPLine、ArrayTape、微流控

芯片等利用KASP技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因型分型的檢測(cè)平臺(tái)同樣適用于本文件。

8數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析

數(shù)據(jù)采集

8.1.1采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀提供的數(shù)據(jù)分析軟件，對(duì)每一標(biāo)記產(chǎn)生的SNP熒光信號(hào)和基因型分型

值進(jìn)行分析。

8.1.2按照分型明確、NTC(無(wú)樣品陰性對(duì)照)無(wú)特異性擴(kuò)增的原則，保留或剔除該位點(diǎn)的數(shù)據(jù)。若一個(gè)

標(biāo)記的缺失數(shù)據(jù)率大于等于5%，需重做；單一個(gè)體檢測(cè)成功率大于等于98%，若某個(gè)體的缺失標(biāo)記位點(diǎn)

數(shù)大于等于2個(gè)，該個(gè)體數(shù)據(jù)則不予采用。

8.1.3數(shù)據(jù)記錄為X/Y。其中，X、Y為同一位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異，即純合基因型記錄為XX或

YY，雜合基因型記錄為XY；缺失位點(diǎn)記錄為-/-。

結(jié)果分析

8.2.1當(dāng)供檢樣品中某個(gè)體在2個(gè)或2個(gè)以上標(biāo)記位點(diǎn)與本品種標(biāo)準(zhǔn)基因型存在差異時(shí)，判定該個(gè)體

為異型個(gè)體。

8.2.2品種純度按照下列公式計(jì)算：

品種純度(%)=(檢測(cè)個(gè)體總數(shù)-異型個(gè)體數(shù))/檢測(cè)個(gè)體總數(shù)×100%

8.2.3判定雜交種的品種純度是否達(dá)到國(guó)家規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、合同和標(biāo)簽標(biāo)注指標(biāo)要求，使用GB/T

3543.5規(guī)定的容許差距，容許差距按式（1）計(jì)算。

T=1.65√?×?/?……（1）

4

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式中：

T－容許差距；

p－品種純度的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值；

q－100-p；

N－檢測(cè)試樣總數(shù)，單位為個(gè)。

8.2.4判定親本或原種的品種純度是否達(dá)到國(guó)家規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、合同和標(biāo)簽標(biāo)注指標(biāo)要求，可按照

GB/T3543.5的規(guī)定，使用淘汰值判定。淘汰值可以通過(guò)Seedcalc8或如下式（2）計(jì)算：

R=X+1.65√?+1.8……（2）

式中：

R－淘汰值（結(jié)果舍去所有小數(shù)位數(shù)，不采用四舍五入或六入）；

X－標(biāo)準(zhǔn)所換算成的異型個(gè)體數(shù)，單位為個(gè)。

9鑒定結(jié)果報(bào)告

品種純度檢測(cè)結(jié)果可按下列方式填報(bào)：

對(duì)編號(hào)為供檢樣品，采用檢測(cè)平臺(tái)，利用個(gè)推薦標(biāo)記進(jìn)行純度檢測(cè)。

結(jié)果顯示：在份供檢樣品中，份為異型個(gè)體，該供檢樣品的純度為％。

具體檢測(cè)結(jié)果可填入表2。

表2品種純度鑒定結(jié)果

供檢樣品編號(hào)供檢樣品類型推薦標(biāo)記數(shù)供檢樣品數(shù)異型個(gè)體數(shù)純度％

注：供檢樣品存在遺傳不穩(wěn)定或嚴(yán)重分離的標(biāo)記位點(diǎn)為：

5

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

推薦引物序列及基因組位置

17個(gè)推薦標(biāo)記的KASP引物序列及基因組位置信息見表A.1。

表A.1推薦引物序列及基因組信息

標(biāo)記IDLGPrimer_AlleleX/Ya(5’-3’)Primer_AlleleC(5’-3’)基因組位置b

GCACACGCAGAGCACCTACTT

PCP011GCACACGCAGAGCACCTACTCGTGTAAGATGTGGTAGACGCAGCTT144989472

GCATATTAACAGGCAAGAACACTTGT

PCP022GCATATTAACAGGCAAGAACACTTGCGTCTGTAATGATCTTGCAGCTGCGAA144865512

GAAATTCCGGTCCCGCATTCCAT

PCP033AAATTCCGGTCCCGCATTCCACGGACTTTGGTTTTGAGGATCGGTGAA113166971

GGCTTACCATCTTGACATTATGGGTT

PCP044GCTTACCATCTTGACATTATGGGTGTATGGCATCAACGAGGTATCCAGATAATA456506

CAAGGGTTGTATACAACACAAAGGCA

PCP055AAGGGTTGTATACAACACAAAGGCGCAAGCTGCAAGTTTCTTTAGCAAATCCAA154220962

ATGTTGTGTTATGCAAGTGAGAGAGTT

PCP066GTTGTGTTATGCAAGTGAGAGAGTGCACCTTAACGATATTAACCCGATGGTTAT38051242

TACGATGACGTTGTGGAACGACTT

PCP077CGATGACGTTGTGGAACGACTCGCCTGATTTTAGATGGATCGTCTAAGTTT115935118

GAGAGCGAGTTCACCAACATAATGT

PCP088AGAGCGAGTTCACCAACATAATGCCCACGGTTGAACCCTGATACTTGTT48738858

GCATCATCAAAGAATCGAGCTAGCA

PCP099CATCATCAAAGAATCGAGCTAGCGAATTAAATTTCATTATGCTAGCTGACT137888783

CAAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGAAT

PCP1010AAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGAACCGAAACCTTGTGAAACTTGTTGGTTACTA27896920

ATCTTTGACACCACCAAACTCTAGTAT

PCP1111CTTTGACACCACCAAACTCTAGTACGTACATCCAA