ICS65.020.30

CCSB43

53

云南省地方標準

DB53/T447.5—2022

代替DB53/T447.5-2012

云嶺牛第5部分：體外胚胎生產

2022-05-20發(fā)布2022-08-20實施

云南省市場監(jiān)督管理局??發(fā)布

DB53/T447.5—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件為DB53/T447—2022《云嶺?！返牡?部分。DB53/T447已經發(fā)布了以下部分：

——第1部分：品種；

——第2部分：養(yǎng)殖場建設規(guī)范；

——第3部分：人工授精；

——第4部分：胚胎移植；

——第5部分：體外胚胎生產；

——第6部分：飼養(yǎng)管理；

——第7部分：飼草加工與調制技術；

——第8部分：育肥技術；

——第9部分：疫病防治；

——第10部分：檔案管理；

——第11部分：胴體生產、評定及分割技術。

本文件代替DB53/T447.5-2012《BMY牛第5部分：體外胚胎生產》，與DB53/T447.5-2012相

比，除結構調整和編輯性改動以外，主要技術變化如下：

a)更改標準名稱為“云嶺牛；

b)更改全文“BMY?！睘椤霸茙X牛”；

c)“術語”中增加了英文名稱（見第3章）；

d)更改了“主要器具、耗材”中部分表述（見4.3）；

e)更改了“采卵裝置和器具”中部分表述（見6.1.1.1），刪除“酒精棉球”（見2012版

6.1.1.1）；

f)更改了“采卵”中部分表述（見6.1.2）；

g)更改了“采卵頻率”中部分表述（見6.1.3）；

h)更改了“主要材料”表述順序（見6.2.1）；

i)更改了“卵巢的收集”中部分表述（見6.2.3）；

j)更改了“卵母細胞的檢出”中部分表述（7.1）；

k)更改了“卵母細胞的分級”中部分表述（見7.2.1）；

l)更改了“受精卵的清洗和體外發(fā)育培養(yǎng)”中部分表述（見10.2.1、10.2.2）。

本文件由云南省草地動物科學研究院提出。

本文件由云南省農業(yè)標準化技術委員會（YNTC07）歸口。

本文件起草單位：云南省草地動物科學研究院。

本文件主要起草人：和占星、黃必志、王安奎、金顯棟、劉建勇、張繼才、黃梅芬、王喆、

亐開興、楊世平、趙剛、楊凱、袁希平、楊壽軍。

本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：

——2012年首次發(fā)布；

——本次為第一次修訂。

I

DB53/T447.5—2022

引言

DB53/T447-2022《云嶺牛》是以2014年12月國家審定新品種“云嶺?！睘檩d體制定的綜合養(yǎng)

殖標準，旨在從品種、養(yǎng)殖場建設、繁殖、管理、飼草加工調制、育肥、疫病、檔案和胴體評定分

割等方面指導和規(guī)范云嶺牛的養(yǎng)殖，帶動云嶺牛規(guī)范化、標準化、產業(yè)化發(fā)展的同時，可提高養(yǎng)殖

場（戶）養(yǎng)殖水平和養(yǎng)殖效益，促進云南肉牛產業(yè)高質量發(fā)展。

DB53/T447-2022由十一個部分構成。

——第1部分：品種。目的在于確立云嶺牛特征和特性、生產性能、種牛等級和良種登記，適用

于云嶺牛品種鑒定和種牛等級評定。

——第2部分：養(yǎng)殖場建設規(guī)范。目的在于確立云嶺牛選址、規(guī)劃與布局、牛舍建設和輔助設施

建設等技術要求。

——第3部分：人工授精。目的在于確立云嶺牛種公牛選擇、母牛的初配年齡與發(fā)情鑒定、輸精

方法、母牛妊娠診斷等技術要求。

——第4部分：胚胎移植。目的在于確立云嶺?？焖贁U繁受體牛同期發(fā)情、供體牛超數(shù)排卵與輸

精、胚胎回收、胚胎質量鑒定、胚胎冷凍保存與解凍、胚胎移植、受體牛妊娠診斷等技術要

求。

——第5部分：體外胚胎生產。目的在于確立云嶺牛供體牛的選擇與飼養(yǎng)管理、卵母細胞的獲取、

卵母細胞的檢出與分級、卵母細胞的IVM、卵母細胞的IVF、受精卵的IVC等技術要求。

——第6部分：飼養(yǎng)管理。目的在于確立云嶺牛飼養(yǎng)管理的基本要求以及牛場衛(wèi)生、各類牛的飼

養(yǎng)管理等技術要求。

——第7部分：飼草加工與調制技術。目的在于確立云嶺牛養(yǎng)殖過程中青貯飼料、秸稈氨（堿）

化飼料、青干草飼料的加工調制技術要求。

——第8部分：育肥技術。目的在于確立云嶺牛優(yōu)質牛肉生產和雪花牛肉生產技術要求。

——第9部分：疫病防治。目的在于確立云嶺牛的生物安全、牛場消毒、疫病防治及無害化處理

等技術要求。

——第10部分：檔案管理。目的在于確立云嶺牛養(yǎng)殖過程中建檔范圍、內容及檔案管理的技術要

求。

——第11部分：胴體生產、評定及分割技術。目的在于確立云嶺牛胴體生產、評定、分割以及分

割肉包裝等技術要求。

DB53/T447-2022包含的十一部分內容均是符合生產實際需要，涵蓋了生產環(huán)節(jié)中的品種、養(yǎng)

殖場建設、繁殖、飼養(yǎng)管理、飼草加工調制、育肥、疫病防治、檔案管理和胴體生產、評定及分割

多方面技術。該標準可規(guī)范云嶺牛從養(yǎng)殖場到牛肉產品的全系列生產技術，充分發(fā)揮云嶺牛生產性

能，提高養(yǎng)殖水平，促進規(guī)?；瘶藴驶B(yǎng)殖的構建和肉牛產業(yè)的發(fā)展。

III

DB53/T447.5—2022

云嶺牛第5部分：體外胚胎生產

1范圍

本文件規(guī)定了云嶺牛供體的選擇與飼養(yǎng)管理、卵母細胞的獲取、卵母細胞的檢出與分級、卵母細胞

的IVM、卵母細胞的IVF、受精卵的IVC等技術要求。

本文件適用于牛體外胚胎生產和移植技術操作。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

DB53/T447云嶺牛第4部分：胚胎移植

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

活體采卵ovumpickup

借助超聲波探測器或內窺鏡，直接從供體?；铙w卵巢中采集（吸?。┪闯墒斓穆涯讣毎?。

3.2

體外受精invitrofertilization

在體外培養(yǎng)條件下完成卵母細胞的成熟、受精、以及受精卵發(fā)育成可移植胚胎。其過程包括卵母細

胞的體外成熟（Invitromaturation，IVM）、體外受精（Invitrofertilization，IVF）和受精卵的體外發(fā)育

培養(yǎng)（Invitroculture，IVC）。

3.3

體外胚胎生產invitroembryoproduction

以IVM、IVF和IVC連續(xù)步驟生產胚胎的過程，稱為體外胚胎生產（Invitroembryoproduction，IVP）。

4設施、儀器及器具、耗材

4.1主要設施

胚胎工程實驗室、采卵室、分牛欄、保定架等。

4.2主要儀器

超凈工作臺、超純水儀、高壓滅菌儀、干熱滅菌儀、EO滅菌儀、超低溫冰箱、電冰箱、電子天平、

倒置顯微鏡、實體顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、活體采卵裝置、胚胎冷凍儀、恒溫臺、水浴鍋、細胞(胚胎)培

養(yǎng)運輸儀、液氮罐、pH測定儀、封口機等。

4.3主要器具、耗材

1

DB53/T447.5—2022

硅化瓶、燒杯、量筒、過濾滅菌濾器（0.22μum，0.45μm）、酒精燈、離心管（10mL或15mL、

50mL）、培養(yǎng)皿、注射器（1mL、5mL、10mL、20mL、50mL）、檢卵器或微細玻璃管、巴氏玻璃管、

記號筆、計時器；過濾式集卵（胚）杯、手術器具一套（毛剪、止血鉗、鑷子等）、塑料細管專用剪、

塑料細管（0.25mL）、胚胎解凍杯和溫度計、胚胎移植槍、移植槍加外套和保護膜、75%酒精棉球等。

5供體牛的選擇與飼養(yǎng)管理

供體牛的選擇參照DB53/T447.4的規(guī)定執(zhí)行。供體牛的飼養(yǎng)管理參照DB53/T447.4的規(guī)定執(zhí)行。

6卵母細胞的獲取

6.1獲取方式

從活體供體牛卵巢中采集（活體采卵）或從屠宰后母牛離體卵巢中采集卵母細胞。

6.2活體采卵（OPU）

6.2.1采卵前的準備

6.2.1.1裝置和器具

B型超聲波掃描儀、扇形陰道探頭（7.5MHz）、真空泵和恒溫器；16G、17G、18G金屬采卵針、回

收管、50mL離心管（集收杯）、一次性注射器（5mL、10mL）等。

6.2.1.2麻醉劑

2%利多卡因或普魯卡因。

6.2.1.3采卵液

D-PBS+10IU/mL肝素鈉+1%FCS+青霉素100IU/mL+100μg/mL鏈霉素。

6.2.1.4采卵裝置的調試

將采卵裝置按要求安裝好，并調試到正常工作狀態(tài)，同時把采卵液及其它必需物品在專用臺車或工

作臺上擺放好。

6.2.1.5供體牛的保定與麻醉

按DB53/T447.4的規(guī)定執(zhí)行。

6.2.2采卵

按以下步驟采卵：

a)用右手將B超探頭輕緩地插入母牛陰道子宮頸一側的穹隆處，并把握好；

b)左手插入直腸，用手隔著直腸壁找到卵巢，并將其貼近探頭面上，通過B超顯示屏觀察卵巢

是否正常，記錄卵泡的數(shù)目及其大??；

c)將吸滿采卵液的單腔采卵針插入裝在探頭上的采卵針筒中；

d)用直腸中的左手移動卵巢使穿刺目標卵泡位于B超顯示屏中顯示的采卵線上，根據(jù)B超顯示

屏上所顯示的目標卵泡位置，用把握探頭的右手手指推動進針管進行穿刺（針頭刺穿陰道壁

2

DB53/T447.5—2022

和卵泡壁）的同時踩下腳踏開關將卵母細胞及卵泡液一同吸到置于恒溫器中收集管內（37C

恒溫）；

e)穿刺目標卵泡為直徑2mm～8mm；

f)吸卵時真空泵壓力80mmHg～85mmHg。

6.2.3采卵頻率

根據(jù)實際需要可采用每周1次～2次、每月一次或在母牛集中配種前隨機選擇，批量采卵。

6.3從屠宰后母牛離體卵巢中采集卵母細胞

6.3.1主要材料

保溫箱（壺）、止血鉗、手術剪、乳膠手套、注射器、針頭、離心管、注射器用滅菌過濾器（0.25

μm）等。

6.3.2卵巢保存液

滅菌的PBS液或生理鹽水+100mg硫酸卡那霉素。

6.3.3卵巢的收集

母牛屠宰后30min內采集卵巢，用卵巢保存液沖洗2次～3次后放入盛有33C保存液的保溫瓶內保

存，盡快帶回實驗室。

6.3.4卵母細胞的吸取

按以下步驟進行卵母細胞的吸?。?/p>

a)以PBS液100mL+青霉素100萬單位、鏈霉素10mg，過濾滅菌配置采卵液，裝瓶后放入33

C的恒溫槽內待用；

b)清理卵巢上粘著的脂肪等組織，用保存液沖洗2次～3次，放入加有卵母細胞清洗液（含量

0.3%BSA的BO液（見9.1.1）的燒杯后暫置入33C恒溫槽內；

c)用帶18G或20G針頭的10mL注射器吸取2mm～8mm卵泡的卵泡液，注入到15mL或50mL

離心管內置于恒溫槽待檢卵和分類。

7卵母細胞的檢出與分級

7.1卵母細胞的檢出

按以下步驟檢出卵母細胞：

a)收集到的卵泡液倒入胚胎濾杯中，用含5%～10%CS或FCS的PBS液的洗卵液稀釋，洗滌3次～

4次，將濾杯中的液體及沉淀物倒入培養(yǎng)皿中；

b)在實體顯微鏡下檢出卵母細胞，如使用帶有側濾網的胚胎濾杯，則可直接在其中檢卵；

c)收集卵質色澤基本均勻、卵母細胞周圍有1層～數(shù)層卵丘的卵丘-卵母細胞復合體（Cumulus

oocytecomplexes,COCs）放入盛有PBS液的培養(yǎng)皿中。

7.2卵母細胞的分級與選用

7.2.1卵母細胞質色澤均勻，卵母細胞周圍包圍≥4層卵丘細胞，卵丘-卵母細胞復合體（Thecumulus

oocytescomplexes，COCs）完整為Ⅰ級。

3

DB53/T447.5—2022

7.2.2卵母細胞質色澤均勻、卵母細胞周圍包圍3層卵丘細胞，COCs完整為Ⅱ級。

7.2.3卵母細胞質色澤基本均勻、卵母細胞周圍包圍1～2層卵丘細胞，COCs基本完整為Ⅲ級。

7.2.4卵母細胞質色澤基本均勻，卵丘細胞擴散或半裸、裸卵和閉鎖卵為Ⅳ級。

7.2.5選擇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級卵母細胞用于體外成熟培養(yǎng)。

8卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)（IVM）

8.1體外成熟培養(yǎng)液的配制

TCM-199（19mL）+CS或FCS1mL+FSH20l（0.1g/mL）或E21g/mL+抗菌素20l（青

霉素10萬IU/mL、鏈霉素100mg/mL），過濾滅菌后備用。

8.2COCs的清洗與體外成熟培養(yǎng)（IVM）

按以下步驟進行COCs的清洗與體外成熟培養(yǎng)（IVM）：

a)用IVM培養(yǎng)液在35mm培養(yǎng)皿中制成100l微滴3個～4個或放入4孔培養(yǎng)皿中，覆蓋石蠟

油，在CO2培養(yǎng)箱中平衡20min；

b)COCs用IVM液洗滌3次，移入經平衡的培養(yǎng)微滴中（每滴15枚～20枚），在5%CO2、95%空

氣、38.5C、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h。

9卵母細胞的體外受精（IVF）

9.1精子的制備與獲能處理

9.1.1BO液的配制（修正）

9.1.1.1BO液的配制（修正）應由A液和B液組成。

9.1.1.2A液：NaCl4.3092g+KCl0.1974g+CaCl20.2171g+NaH2PO40.0840g+MgCl20.0697g

+0.5%酚紅0.1mL+超純凈水500mL。

9.1.1.3B液：NaHCO32.5873g+0.5%酚紅0.04mL+超純凈水200mL，溶解后CO2氣體通氣30min

作氣相平衡。

9.1.1.4A液76mL+B液24mL+丙酮酸鈉0.1375g+抗菌素100L（青霉素10萬IU/mL，鏈霉

素100mg/mL）+肝素鈉130L，過濾滅菌后冷藏保存。

9.1.2精子清洗液配制

BO液50mL+咖啡因10mmol/L，過濾滅菌。

9.1.3精子稀釋液配制

BO液10mL+BSA（牛血清白蛋白）0.06g，過濾滅菌。

9.1.4精子制備與獲能

按以下步驟進行精子制備與獲能：

a)凍精用37C～38C水浴10s解凍后倒入離心管內，加入7mL精子清洗液，以1800r.p.m.

離心5min；

b)吸棄上清液，留1mL～2mL，同法第二次離心洗滌，留1mL，加1mL精子稀釋液，使稀釋

后的精子數(shù)達(5106)個/mL；

4

DB53/T447.5—2022

c)取95l精子稀釋液注入到5L卵母細胞清洗液微滴中，使之成為100L的精子培養(yǎng)微滴，

覆蓋石蠟油；

d)在5%CO2、95%空氣、38.5C、飽和濕度的培養(yǎng)箱內預培養(yǎng)1h～1.5h。

9.2卵母細胞的體外受精（IVF）

IVM22h的COCs用卵母細胞清洗液洗滌3次，放入已準備好的100L精子培養(yǎng)液微滴中（每滴15枚～

20枚），在5%CO2、95%空氣、38.5C、飽和濕度的培養(yǎng)箱內受精5