ICS65.020.01

CCSB01

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T3185—2023

山藥根尖染色體制片和核型分析技術(shù)規(guī)程

Technicalrulesforchromosomepreparationandkaryotypeanalysisin

roottipofyam

2023-10-30發(fā)布2023-11-30實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T3185—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳提出。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC20）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院、鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院、

巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院所。

本文件主要起草人：霍秀文、張艷芳、郭樹(shù)春、菅志亮、劉小燕、張曉蒙、張勇、邵盈、趙令敏、

喬慧蕾、邢麗南、葛明然、黃小龍。

I

DB15/T3185—2023

山藥根尖染色體制片和核型分析技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文規(guī)定了山藥根尖染色體制片的試劑溶液配制、制片方法以及核型分析方法。

本文件適用于山藥根尖染色體玻片制備和核型分析。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

DB15/T2788向日葵根尖染色體制片和核型分析技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

著絲粒centromere

染色體主縊痕部位的染色質(zhì)，是染色體中將兩條姐妹染色單體結(jié)合起來(lái)的區(qū)域。

核型karyotype

染色體組在有絲分裂中期的表型，是染色體數(shù)目、大小、形態(tài)特征的總和。

隨體satellite

位于染色體末端的、圓形或圓柱形的染色體片段，通過(guò)次縊痕與染色體主要部分相連，主要由異染

色質(zhì)組成，含高度重復(fù)的DNA序列，不具有常染色質(zhì)的功能活性。

染色體核型分析chromosomekaryotyping

以分裂中期染色體為研究對(duì)象，根據(jù)染色體的長(zhǎng)度、著絲粒位置、長(zhǎng)短臂比例、隨體的有無(wú)等特征，

對(duì)染色體進(jìn)行分組、比較、排隊(duì)、配對(duì)，并進(jìn)行形態(tài)分析的過(guò)程。

4試劑配制

本文件用到的試劑參見(jiàn)附錄A中表A.3。

1

DB15/T3185—2023

5染色體標(biāo)本的制備

樣本的獲取

選擇打破休眠的山藥塊莖或者零余子，播種于裝有育苗基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，在溫度24℃±2℃，濕

度60%，光照強(qiáng)度3000lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng)生根。

預(yù)處理

剪取0.5cm～1cm的根尖材料自來(lái)水沖洗后，置于8-羥基喹啉預(yù)處理液中14℃處理1h。

固定

將預(yù)處理的根尖蒸餾水沖洗后放入卡諾固定液中4℃固定24h。

前低滲

將固定后的根尖蒸餾水沖洗后置于0.075mol/L氯化鉀溶液中，室溫處理30min。

解離

將低滲處理后的根尖蒸餾水沖洗后置于0.25mol/L的鹽酸溶液37℃水浴12min。再蒸餾水沖洗10

min后用乙酸-乙酸鈉緩沖液浸泡4min，用3%纖維素酶和0.1%果膠酶酶解液37℃水浴18min。

后低滲

室溫條件下蒸餾水后低滲處理30min以上。

染色壓片

將處理后的根尖置于干凈的載玻片，滴改良卡寶品紅染液染色2min。蓋上蓋玻片輕壓。

鏡檢及圖像采集

在100倍的顯微鏡下觀察中期分裂相，對(duì)染色體充分分散的分裂相進(jìn)行拍照。

6染色體核型分析

分析方法

取30個(gè)以上中期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。選擇背景清晰、染色體形態(tài)清晰的5個(gè)細(xì)胞進(jìn)行染色體長(zhǎng)

度的測(cè)量，用于核型分析。核型分析方法等見(jiàn)附錄B，核型分類依據(jù)Stebbins的標(biāo)準(zhǔn)劃分見(jiàn)附錄B中表B.3。

測(cè)量

圖像相關(guān)指標(biāo)測(cè)量使用光學(xué)顯微圖像處理，測(cè)量方法參見(jiàn)附錄A。

Excel計(jì)算

對(duì)每個(gè)細(xì)胞分別計(jì)算每條染色體的臂比和絕對(duì)長(zhǎng)度總長(zhǎng)，并列出著絲粒位置類別。

同源染色體配對(duì)及排列

按染色體形態(tài)大小和著絲粒位置進(jìn)行染色體配對(duì)，方法見(jiàn)附錄B。

2

DB15/T3185—2023

核型模式圖繪制

分析方法按照DB15/T2788的規(guī)定。使用VideoTesT-Karyo染色體分析軟件進(jìn)行染色體核型圖的制

作，運(yùn)用MicrosoftofficeExcel制作核型模式圖；結(jié)果見(jiàn)附錄B。

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DB15/T3185—2023

A

A

附錄A

（資料性）

染色體長(zhǎng)度測(cè)量步驟及本技術(shù)規(guī)程用到的試劑和配置方法

A.1染色體長(zhǎng)度測(cè)量步驟

A.1.1掃描修整圖像

用OLYMPUSBX51顯微鏡觀察染色體制片，在100×物鏡下對(duì)染色體充分分散的中期分裂相進(jìn)行拍

照。對(duì)河南鐵棍山藥材料取40個(gè)中期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。選擇背景清晰、染色體形態(tài)清晰的5個(gè)

細(xì)胞進(jìn)行拍照，圖像采集使用奧特光學(xué)顯微圖像處理系統(tǒng)OPTPro2008v2.0完成。

A.1.2整理同源染色體并測(cè)量

選擇染色體形態(tài)清晰的5個(gè)細(xì)胞進(jìn)行染色體長(zhǎng)度的測(cè)量。按染色體形態(tài)大小和著絲粒位置進(jìn)行染

色體配對(duì)。使用軟件中“圖像測(cè)量”菜單里“直線”或“曲線”測(cè)量工具測(cè)量染色體長(zhǎng)臂、短臂及隨

體的絕對(duì)長(zhǎng)度。對(duì)每個(gè)細(xì)胞分別計(jì)算每條染色體的臂比和絕對(duì)長(zhǎng)度總長(zhǎng)，并列出著絲粒位置類別，由

此進(jìn)行同源染色體的配對(duì)。對(duì)每個(gè)細(xì)胞配對(duì)后計(jì)算每對(duì)同源染色體的長(zhǎng)臂、短臂平均值，得到這個(gè)細(xì)

胞的長(zhǎng)臂值、短臂值。對(duì)細(xì)胞的長(zhǎng)臂值、短臂值再對(duì)應(yīng)地求平均值。得到該材料的長(zhǎng)臂值、短臂值。

由該材料的長(zhǎng)短臂值，計(jì)算染色體總長(zhǎng)并做記錄，由此進(jìn)行染色體排序。

各指標(biāo)的測(cè)量使用奧特光學(xué)顯微圖像處理系統(tǒng)OPTPro2008v2.0完成。核型不對(duì)稱系數(shù)的計(jì)算按

照ARANO的方法，即核型不對(duì)稱系數(shù)=長(zhǎng)臂總長(zhǎng)/全組染色體總長(zhǎng)。相對(duì)長(zhǎng)度指數(shù)(indexofrelative

length)按照KUO的方法計(jì)算并對(duì)染色體進(jìn)行分類，即IRL=染色體長(zhǎng)度/全組染色體平均長(zhǎng)度。

A.2染色體參數(shù)計(jì)算

按染色體形態(tài)大小和著絲粒位置進(jìn)行染色體配對(duì)，并根據(jù)染色體臂長(zhǎng)計(jì)算出染色體絕對(duì)長(zhǎng)度、相

對(duì)長(zhǎng)度和臂比等核型參數(shù)。使用VideoTesT-Karyo染色體分析軟件進(jìn)行染色體核型圖的制作，運(yùn)用

MicrosoftofficeExcel制作核型模式圖。

A.3試劑及配置方法

試劑及配置方法見(jiàn)表A.1。

表A.1試劑及配置方法

試劑名稱配制方法

0.002mol/L8-羥基喹啉稱取0.29g8-羥基喹啉，先加入少許乙醇溶解，然后用蒸餾水定容至1000mL。

對(duì)二氯苯飽和水溶液稱取15g對(duì)二氯苯，60℃蒸餾水中攪拌溶解，定容至1000mL，靜置1h取上清，室

溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

0.01%秋水仙素溶液稱取0.1g秋水仙素，先用少許乙醇溶解，用蒸餾水定容至1000mL。

0.075mol/L氯化鉀溶液稱氯化鉀5.59g，蒸餾水溶解，定容至1000mL。

1mol/L鹽酸量取83mL36%～38%的濃鹽酸，加蒸餾水定容至1000mL。

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液溶液A：量取冰醋酸1.5mL，定容至250mL，制成0.1mol/L醋酸溶液；

(pH=4.75)溶液B：稱取醋酸鈉2.05g，溶解后定容至250mL，制成0.1mol/L醋酸鈉溶液；

使用時(shí)等體積混合，4℃冷藏備用。

酶解液含3%纖維素酶和0.1%果膠酶。取3g纖維素酶（CelluloseOnozukaR-10）和

酶解液0.1g果膠酶（PectolyaseY-23），分別加入少量的乙酸-乙酸鈉緩沖液，待溶解后定

容至100mL。

4

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表A.1試劑及配置方法（續(xù)）

試劑名稱配制方法

原液A：3g堿性品紅，溶于100mL70%酒精中（可長(zhǎng)期保存）。

原液B：取10mL原液A加入5%苯酚水溶液90mL（棕色瓶中保存，限兩周內(nèi)使用）。

改良卡寶品紅染液染色液母液：55mL原液B加冰醋酸和6mL37%甲醛。

改良卡寶品紅染液：10mL染色液母液加45%乙酸90mL，最后加山梨醇1.8g，室溫下

放置兩周后待用。

5

DB15/T3185—2023

B

B

附錄B

（規(guī)范性）

著絲粒位置

B.1著絲粒位置見(jiàn)表B.1。

表B.1著絲粒位置

臂比著絲粒位置符號(hào)

1.00正中部著絲粒M

1.01-1.70中部著絲粒m

1.71-3.00近中部著絲粒sm

3.01-7.00近端部著絲粒st

7.01以上端部著絲粒t

B.2染色體長(zhǎng)度類型見(jiàn)表B.2。

表B.2染色體長(zhǎng)度類型

絕對(duì)長(zhǎng)度（μm）長(zhǎng)度類型符號(hào)

≤1微小型染色體S

1-4小型染色體M1

4-10中等染色體M2

10-30大染色體L

B.3染色體核型分類標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表B.3。

表B.3染色體核型分類標(biāo)準(zhǔn)

染色體長(zhǎng)度比臂比>2:1的染色體的百分比

(L/S)0.00.01-0.50.51-0.991.00

<2：11A2A3A4A

2：1-4：11B2B3B4B

>4：11C2C3C4C

B.4染色體核型分析參數(shù)見(jiàn)表B.4。

表B.4染色體核型分析參數(shù)

染色體長(zhǎng)度(μm)相對(duì)相對(duì)染色著絲