中華人民共和國司法部司法鑒定管理局發(fā)布SF/ZJD0105003——2015前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4檢驗(yàn)程序 25SNP分型結(jié)果分析 36SNP分型結(jié)果表示 47SNP分型結(jié)果應(yīng)用 48SNP分型結(jié)果評估 4 6 7 8SF/ZJD0105003——2015本技術(shù)規(guī)范按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本技術(shù)規(guī)范由四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院、司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所提出。本技術(shù)規(guī)范由司法部司法鑒定管理局歸口。本技術(shù)規(guī)范起草單位：四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院、司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所。本技術(shù)規(guī)范主要起草人：侯一平、李成濤、張霽、張素華、李英碧、李莉、羅海玻、宋鳳。本技術(shù)規(guī)范為首次發(fā)布。SF/ZJD0105003——2015法醫(yī)SNP分型與應(yīng)用規(guī)范本技術(shù)規(guī)范規(guī)定了法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室用微測序法進(jìn)行法醫(yī)SNP分型的要求及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)（采用微測序法作為SNP分型技術(shù)的說明見附錄A）。本技術(shù)規(guī)范適用于法庭科學(xué)采用SNP進(jìn)行個體識別和親緣關(guān)系鑒定兩個領(lǐng)域。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本技術(shù)規(guī)范的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本技術(shù)規(guī)范。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本技術(shù)規(guī)范。GA/T382－2014法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室建設(shè)規(guī)范GA/T383－2014法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范GA/T965－2011法庭科學(xué)DNA親子鑒定規(guī)范CNAS－CL08：2013司法鑒定/法庭科學(xué)機(jī)構(gòu)能力認(rèn)可準(zhǔn)則CNAS－CL28：2014司法鑒定/法庭科學(xué)機(jī)構(gòu)能力認(rèn)可準(zhǔn)則在法醫(yī)物證DNA鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用說明SF/ZJD0105001－2010親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本技術(shù)規(guī)范。3.1單核苷酸多態(tài)性Singlenucleotidepolymorphisms（SNPs）指人群中正常個體基因組的單個堿基的變異，且最小等位基因頻率大于1％。3.2微測序法minisequencingtechnique指基于引物延伸原理進(jìn)行單個堿基序列分析的技術(shù)，也稱引物延伸法?；驹硎窃诰o鄰已知SNP位點(diǎn)的上游設(shè)計引物，在僅有ddNTP存在條件下進(jìn)行測序反應(yīng)時，延伸反應(yīng)在延長一個堿基時終止，然后通過檢測ddNTP標(biāo)記物的特征確定延伸單個堿基的種類。3.3SNaPshot方法SNaPshotassay是一種基于熒光標(biāo)記ddNTP單堿基延伸原理用于SNP分型的微測序技術(shù)。同一反應(yīng)體系中若含有針對不同SNP的等位基因特異性引物，而它們59端長度不同，則可實(shí)現(xiàn)多個SNP同步分析。3.4匹配概率probabilityofmatching（Pm）指一名與案件沒有關(guān)系的隨機(jī)個體純粹由于機(jī)會與檢材分型結(jié)果一致的概率。3.5似然率likelihood（LR）SF/ZJD0105003——20152是評估遺傳分析提供證據(jù)強(qiáng)度的指標(biāo)。數(shù)值上似然率是兩個條件概率的比值。在個人識別時兩個條件概率的假設(shè)分別是，現(xiàn)場檢材是嫌疑人所留（原告假設(shè)）和現(xiàn)場檢材是一個與案件無關(guān)的隨機(jī)個體所留（被告假設(shè)）。似然率提供了基于術(shù)語“支持”的簡單約定,以便根據(jù)一定數(shù)據(jù)來支持一種假設(shè)，排斥另一種假設(shè)。4檢驗(yàn)程序4.1檢材的提取和保存按照GA/T383－2014中的要求進(jìn)行。4.2DNA提取與定量分析按照GA/T383－2014中的要求進(jìn)行。4.3SNP分型4.3.1采用基于微測序的SNaPshot方法進(jìn)行SNP分型。分型方法包括：PCR擴(kuò)增、引物延伸反應(yīng)和電泳分型。4.3.2PCR擴(kuò)增4.3.2.1PCR擴(kuò)增試劑、儀器、反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)：按照GA/T383－2014中的要求進(jìn)行。4.3.2.2在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用SNP進(jìn)行個人識別和親緣關(guān)系鑒定時，本規(guī)范建議可在以下SNP中選擇：a)【常染色體SNP】1)二等位SNP：rs740910、rs1490413、rs1335873、rs1979255、rs1493232、rs2040411、rs1528460、rs717302、rs251934、rs8037429、rs891700、rs901398、rs873196、rs964681、rs737681、rs1463729、rs10495407、rs1357617、rs719366、rs1031825、rs733164、rs938283、rs2111980、rs1886510、rs914165、rs354439、rs763869、rs2076848、rs1024116、rs1355366、rs735155、rs1454361、rs727811、rs917118、rs2831700、rs907100、rs1029047、rs2046361、rs722098、rs876724、rs2016276、rs826472、rs2830795、rs1028528。2)三等位SNP：rs1630312、rs3091244、rs2069945、rs6001030、rs140676、rs356167、rs941454、rs10045、rs3743842、rs2298556、rs3816662、rs2307223、rs10811897、rs17287498、rs385780、rs11141033、rs4540055、rs3812847、rs2032582、rs2278786。b)【非常染色體SNP】1)Y染色體SNP：rs11096433、M145、rs9306845、rs9786479、rs17276358、rs2075640、M134、M88、M95、rs16980426、rs17323322、M122、rs13447354、M89、rs9786707、M15、rs16980711、M9、rs17316592、rs17276345。2)X染色體：SF/ZJD0105003——20153rs925178、rs1207480、rs1936313、rs1977719、rs1372687、rs1857602、rs985425、rs933315、rs1981452。3)線粒體SNP：709、1719、1736、3010、3394、3970、4216、4883、5147、5417、5460、6392、6455、16519。4.3.3引物延伸反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物使用核酸外切酶（Exo）和蝦堿性磷酸酶(SAP)進(jìn)行純化。在Exo和SAP酶處理后的PCR產(chǎn)物中加入SNP的單堿基延伸引物、SNaPshotmix進(jìn)行單堿基引物延伸反應(yīng)，反應(yīng)完成后，通過向產(chǎn)物中加入SAP來消化未結(jié)合的熒光素標(biāo)記的ddNTP。4.3.4電泳分型使用遺傳分析儀，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，數(shù)據(jù)分析可使用為觀測峰的顏色和片段長度范圍涉及的Genotyper或GeneMapperID等軟件進(jìn)行SNP分型。具體步驟按照儀器或軟件操作手冊進(jìn)行。5SNP分型結(jié)果分析5.1分型結(jié)果的說明5.1.1峰的位置與SNP遺傳標(biāo)記5’端加尾的長度有關(guān)，表示相互區(qū)別的不同位點(diǎn)。純合子以單峰形式出現(xiàn)，雜合子通常以不同顏色峰顯示。5.1.2峰的顏色表示所選擇的SNP的核苷酸信息，四種脫氧核糖核苷酸標(biāo)記不同顏色的染料：A(綠色),G(藍(lán)色),C(黃色，為了達(dá)到更好的視覺效果，通常顯示為黑色),T(紅色)。因此，在電泳圖譜中出現(xiàn)一個綠色峰，表明一個A（ddATP）通過聚合酶結(jié)合在SNP上。5.2分型結(jié)果的基本要求5.2.1確認(rèn)內(nèi)標(biāo)峰高閾值大于100相對熒光單位，且每一內(nèi)標(biāo)峰標(biāo)定正確。5.2.2確認(rèn)已知陽性參照物的分型結(jié)果正確，陰性參照物無等位基因峰。5.2.3樣本分型圖譜清晰，且峰高大于100相對熒光單位。5.3拔起峰的分析5.3.1拔起峰（pullup峰）指含有熒光染料的單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物從一個光譜通道擴(kuò)散到另一個通道的結(jié)果在電泳圖譜中的呈現(xiàn)。5.3.2每一種熒光染料都有不同波長的最大發(fā)射光譜，而當(dāng)某一熒光染料過多造成matrix去顏色疊加不能正常工作，會出現(xiàn)拔起峰的現(xiàn)象5.3.3當(dāng)一個樣本的SNP分型圖譜中，與主峰處于同一縱軸線的其他所有顏色上均有相應(yīng)的吸收峰時，判斷為拔起峰，通常由于超高峰所致。5.3.4拔起峰可通過減少擴(kuò)增時的樣本DNA量、減少擴(kuò)增循環(huán)數(shù)、減少單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物、重建光譜校正等來消除。SF/ZJD0105003——201545.4等位基因丟失的分析5.4.1當(dāng)PCR擴(kuò)增或單堿基延伸反應(yīng)的模板在引物結(jié)合區(qū)發(fā)生突變，阻礙引物結(jié)合，會導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或引物延伸失敗，無法檢測到模板DNA中本身存在的一個等位基因。5.4.3考慮有等位基因丟失可能時，需更換DNA序列不同的引物進(jìn)行重新檢測。5.5非特異峰的分析5.5.1PCR引物去除不全：表現(xiàn)為在電泳圖譜上出現(xiàn)的片段長度為比PCR引物長度多1個堿基的產(chǎn)物，為Exo酶對PCR引物消化不全，可加大Exo酶量消化后去除。5.5.2ddNTP去除不全：未經(jīng)消化的ddNTP常出現(xiàn)在大于70bp的位置，超量的ddNTP也會出現(xiàn)在較短片段位置，為SAP對未結(jié)合的熒光素標(biāo)記的ddNTP消化不完全所致，可通過加大SAP量消化后去除，由于ddNTP是熒光素標(biāo)記的，該原因?qū)е碌念~外峰也稱為染料峰。5.5.3熒光污染：由于抗菌素、維生素、多環(huán)芳香族化合物、熒光助色物質(zhì)、各種紡織染料等有熒光，導(dǎo)致出現(xiàn)非特異峰也稱熒光污染峰，通常比較寬，擁有較寬的熒光光譜范圍，可通過有機(jī)提取法去除。5.5.4其它：還有由氣泡、尿素結(jié)晶或電壓波動引起的非特異峰稱為偽峰，通常尖聳且出現(xiàn)在四種顏色的相同位置，沒有重復(fù)性。6SNP分型結(jié)果表示分型結(jié)果的描述：SNP檢驗(yàn)結(jié)果以表格的形式列出，標(biāo)明檢材或樣本的編號、SNP名稱及等位基因分型。等位基因以A、C、G、T表示，等位基因間以“/”分隔；純合子只標(biāo)出1個；未得到分型或無法明確判定分型的標(biāo)為“-”。7SNP分型結(jié)果應(yīng)用7.1補(bǔ)充個人識別鑒定STR基因座被廣泛應(yīng)用于DNA數(shù)據(jù)庫建立和實(shí)際案件鑒定的個體識別。當(dāng)犯罪現(xiàn)場提取的物證為降解檢材時，SNP分型結(jié)果可作為補(bǔ)充鑒定應(yīng)用于個體識別，即通過比較案發(fā)現(xiàn)場收集到的法醫(yī)物證檢材與嫌疑人的SNP遺傳標(biāo)記，判斷前后兩次或多次出現(xiàn)的個體是否為同一個體。若兩份檢材的SNP分型不同，可判斷兩份檢材不是來自同一個體；若SNP分型相同，則稱為兩份檢材的SNP分型匹配，即不能排除兩份檢材來自同一個體。7.2輔助親緣關(guān)系鑒定當(dāng)STR系統(tǒng)的分型結(jié)果不足以確定某些復(fù)雜親緣關(guān)系時，SNP可以作為補(bǔ)充鑒定的遺傳標(biāo)記。常染色體SNP符合孟德爾遺傳規(guī)律，即子代的等位基因一個來自于父親，一個來自于母親。在有爭議的父母和孩子三份樣本所檢測的多個SNP分型結(jié)果中，孩子的一對等位基因分別在有爭議父母的基因型中找到來源時，不排除該有爭議父母為孩子的生物學(xué)父母。Y染色體、X染色體和線粒體SNP可在某些特殊的親緣關(guān)系鑒定中作為補(bǔ)充鑒定的遺傳標(biāo)記使用。8SNP分型結(jié)果評估8.1個人識別SF/ZJD0105003——20158.1.1匹配。兩份檢材所檢測的多個SNP均相同時判斷為匹配。兩份檢材遺傳標(biāo)記分型匹配有兩種可能的原因：①兩份檢材來自同一個體；②兩份檢材不是來自同一個體，理論上可能來自群體中的一名隨機(jī)個體，僅僅因其遺傳標(biāo)記碰巧相同而出現(xiàn)了匹配。此時可以通過計算匹配概率來估計一個理論上的隨機(jī)個體碰巧匹配的可能性有多大。匹配概率按附錄B計算，似然率按附錄C計算。8.1.2不匹配。在排除拔起峰、等位基因丟失、非特異峰等前提下，兩份檢材在所檢測的SNP中有兩個及以上不同時判斷為不匹配。8.1.3兩份檢材在所檢測的SNP中只有一個不同時，不能排除兩份檢材來自同一個體，需增加檢測更多SNP。增加檢測更多SNP后，兩份檢材在所檢測的SNP中有兩個及以上不同時判斷為不匹配。8.2親子鑒定SNP作為親子鑒定的補(bǔ)充遺傳標(biāo)記。累積非父排除概率和累積父權(quán)指數(shù)按GA/T965－2011或SF/ZJD0105001－2010中的要求計算。對于不符合遺傳規(guī)律的SNP，PI取值可為0.00001.8.3SNP與STR的同時使用當(dāng)SNP與STR同時使用時，或多個SNP同時使用時，需有證據(jù)表明SNP與STR是相互獨(dú)立的，或SNP之間是相互獨(dú)立的。不能證明相互獨(dú)立時按單倍型計算。SF/ZJD0105003——20156（規(guī)范性附錄）有關(guān)本規(guī)范采用微測序法作為SNP分型技術(shù)的說明由于SNP不具有與STR相當(dāng)?shù)亩鄳B(tài)信息量，實(shí)際案件中DNA樣本量往往又十分有限，所以法醫(yī)SNP檢測方法必須具有同時檢測多個SNP的能力。微測序法能同時復(fù)合分析多個SNP，符合這一要求。微測序方法更重要的優(yōu)點(diǎn)是可直接用于當(dāng)前絕大多數(shù)法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室的多色熒光電泳檢測設(shè)備上，包括310、3130和3500等基因分析儀?，F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室無需新增設(shè)備即可開展檢驗(yàn)。這種技術(shù)靈敏度高，被證實(shí)應(yīng)用于案件樣本相當(dāng)有效。其他方法需