目錄TOC\o"1-3"\h\u26577摘要 I14473Abstract II22777目錄 3235651緒論 443741.1淫羊藿概述 4135361.2宮頸癌概述 4183721.3淫羊藿的主要化學(xué)成分 5326441.4淫羊藿中主要成分的抗癌作用機制 513881.5網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概述 6125201.6研究目的與意義 6268252網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接 8318332.1篩選淫羊藿活性成分和主要靶點 844842.2篩選宮頸癌相關(guān)靶點 877132.3篩選核心靶點 884142.4構(gòu)建中藥-成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖 8143612.5GO功能注釋與KEGG通路富集分析 821772.6分子對接 9142543體外實驗部分 10248073.1實驗材料 10146363.1.1儀器 1030713.1.2藥品與試劑 10149273.1.3細(xì)胞株 10199593.2實驗方法 10159733.2.1實驗藥液制備 1054603.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 11226713.3WesternBlot法檢測AKT1和MAPK1信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá) 11134973.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理 11299124實驗結(jié)果 1292374.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接 12161914.1.1藥物主要成分和靶點以及疾病相關(guān)靶點 12194714.1.2繪制venny圖 13163644.1.3篩選核心靶點 13137894.1.4構(gòu)建中藥-成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖 15159064.1.5GO和KEGG通路富集分析 1528084.1.6分子對接驗證 18183534.2WesternBlot實驗結(jié)果 23274654.2.1淫羊藿促凋亡時相關(guān)蛋白的表達(dá) 23268585討論 255559結(jié)論 2716755參考文獻(xiàn) 2832327致謝 35

1緒論1.1淫羊藿概述淫羊藿（EpimediumbrevicornuMaxim,EM）是小檗科植物REF_Ref3413\r\h[1]，其干燥葉片入藥?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列為中品，別名仙靈脾。淫羊藿有多個品種，包括朝鮮淫羊藿、箭葉淫羊藿、巫山淫羊藿以及柔毛淫羊藿等[2]，全世界大約有55種淫羊藿，主要分布在北非、黑海、喜馬拉雅、中國和日本REF_Ref5813\r\h[3]。淫羊藿味辛甘、性溫，歸肝腎二經(jīng)。其主要功效為補腎助陽、強筋健骨、祛風(fēng)除濕等REF_Ref23055\r\h[4]，在臨床中常用于改善陽痿遺精、腰膝痿軟等腎虛癥狀，以及半身不遂、風(fēng)濕痹痛等經(jīng)絡(luò)痹阻病癥REF_Ref12269\r\h[5]。多項現(xiàn)代研究揭示，淫羊藿的黃酮類、生物堿類及揮發(fā)油等成分蘊含豐富藥理活性。其不僅對心腦血管具有保護作用，還在提升免疫功能、抗炎、抗氧化、抗疲勞及抑制腫瘤發(fā)展等方面展現(xiàn)顯著效果REF_Ref12919\r\h[6-REF_Ref4347\r\h9]。淫羊藿一般在夏秋季節(jié)采收，采割莖葉繁茂的植株，去除粗梗及雜質(zhì)后陰干或曬干。炮制時可揀凈雜質(zhì)切絲，或通過炒制、酒炙炒增強藥效。但陰虛火旺或相火易動者不宜使用REF_Ref23198\r\h[10]。此外，淫羊藿還可作為觀賞植物，其資源保護和可持續(xù)利用也受到關(guān)注REF_Ref1247\r\h[11]。1.2宮頸癌概述宮頸癌（CervicalCancer,CC）作為全球高發(fā)惡性腫瘤REF_Ref23872\r\h[12]，在女性惡性腫瘤發(fā)病率統(tǒng)計中位列第二REF_Ref21184\r\h[13]，尤其在低收入和中等收入地區(qū)更為常見，對女性健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅REF_Ref20210\r\h[14]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年宮頸癌新增確診病例超50萬，病死人數(shù)逾30萬REF_Ref29851\r\h[15]。在中國，女性癌癥患者群體中，宮頸癌的罹患率與病死率均處于高位REF_Ref30008\r\h[16]。臨床上，醫(yī)生依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會分期為癌患者選擇合適的治療方案，根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟2018年分期標(biāo)準(zhǔn)，IA2至IB2期及IIA1期的早期宮頸癌患者，臨床多采用根治性子宮切除術(shù)進行治療[17]。美國國家癌癥研究所SEER數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)表明，在宮頸癌患者群體中，45歲以下育齡期女性占比達(dá)36%。相當(dāng)比例的年輕宮頸癌患者存在生育保留需求，鑒于此，子宮切除術(shù)并非首選治療策略REF_Ref30488\r\h[18]。探索新的宮頸癌的療法和安全有效的抗宮頸癌藥物，尤其是開發(fā)能靶向抑制宮頸癌細(xì)胞的藥物對于醫(yī)務(wù)工作者至關(guān)重要。中醫(yī)藥憑借協(xié)同增效與低不良反應(yīng)的優(yōu)勢，在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，已成為備受關(guān)注的研究熱點REF_Ref30736\r\h[19-REF_Ref30749\r\h21]。1.3淫羊藿主要化學(xué)成分目前已從淫羊藿屬植物中成功鑒定出約260種化學(xué)成分REF_Ref31102\r\h[22]，其主要成分包括生物堿、木脂素及黃酮類化合物等。黃酮類物質(zhì)是淫羊藿發(fā)揮藥效的關(guān)鍵成分REF_Ref31229\r\h[23]，包含淫羊藿苷、寶藿苷I、朝藿定A、B、C以及淫羊藿次苷II等典型化合物，這些活性成分共同構(gòu)成了淫羊藿的物質(zhì)基礎(chǔ)，對闡明其藥理機制具有重要意義。淫羊藿苷是其關(guān)鍵生物活性成分之一,具有保護骨、神經(jīng)、生殖功能等藥理作用REF_Ref1446\r\h[24]。此外，淫羊藿多糖作為其重要的活性成分，由多種單糖聚合而成，主要包含葡萄糖、果糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖和木糖等，這些成分共同構(gòu)筑了淫羊藿的生物活性基礎(chǔ)，對其藥用價值的發(fā)揮具有重要意義REF_Ref31481\r\h[25]。在現(xiàn)代藥理研究中，其展現(xiàn)出多元化的生物活性，在疾病防治與機體健康維護領(lǐng)域具有重要的研究價值與應(yīng)用潛力REF_Ref31699\r\h[26REF_Ref31709\r\h27]。1.4淫羊藿中主要成分的抗癌作用機制研究證實，淫羊藿的關(guān)鍵成分淫羊藿素具備抗癌活性。作為黃酮類化合物的淫羊藿苷，在腸道內(nèi)經(jīng)過酶解代謝后可轉(zhuǎn)化為淫羊藿素，二者共同構(gòu)成了淫羊藿發(fā)揮藥理作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)REF_Ref3967\r\h[28-REF_Ref3980\r\h29]。ITC有著廣泛的藥理活性，其藥理研究集中在抗腫瘤REF_Ref4205\r\h[30-REF_Ref4209\r\h31]、骨保護REF_Ref4496\r\h[32]和抗炎REF_Ref4542\r\h[33]等領(lǐng)域。淫羊藿素也能夠通過影響細(xì)胞內(nèi)部的信號通路，促使腫瘤細(xì)胞自我毀滅，即凋亡，亦可經(jīng)由細(xì)胞壞死途徑引發(fā)死亡進程。淫羊藿素能夠干預(yù)腫瘤生長和存活所依賴的信號通路，通過作用于AKT1、MAPK1等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路REF_Ref7330\r\h[34]。淫羊藿素能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤血管新生，從而有效限制腫瘤的進展。具體而言，該成分可干擾腫瘤細(xì)胞的周期性活動，使其無法順利完成增殖過程；同時，通過調(diào)控相關(guān)因子的表達(dá)，阻礙腫瘤血管的形成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)途徑，最終實現(xiàn)對腫瘤生長和擴散的抑制作用REF_Ref26499\r\h[35]。淫羊藿素能夠抑制炎癥介質(zhì)的合成與釋放，有效減輕炎癥反應(yīng)，從而阻斷炎癥介導(dǎo)的腫瘤惡化過程。此外，淫羊藿還能激活免疫細(xì)胞活性，增強機體對腫瘤細(xì)胞的免疫識別與殺傷功能，實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)控與清除。淫羊藿素能夠靶向作用于腫瘤干細(xì)胞，抑制其自我更新能力，從根源上遏制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。1.5網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)驅(qū)動的前沿交叉學(xué)科，通過生物網(wǎng)絡(luò)解析揭示疾病病理機制?？梢詮幕謴?fù)或改善生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度解析藥物與機體的相互作用，具有“多靶點協(xié)同、多基因調(diào)控”特性REF_Ref2621\r\h[36]，其通過系統(tǒng)性整合調(diào)控機制，突破傳統(tǒng)單靶點治療局限，為臨床精準(zhǔn)干預(yù)策略開發(fā)提供理論支撐與實踐依據(jù)。該學(xué)科利用計算機和高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析等技術(shù)，與中醫(yī)整體觀念及辨證施治理念高度契合，既傳承中醫(yī)理論精髓，又融入現(xiàn)代科學(xué)方法，對推動中藥理論創(chuàng)新與臨床實踐發(fā)展具有重要意義。利用網(wǎng)絡(luò)藥物學(xué)方法，研究人員可以預(yù)測植物成分的去向，并通過實驗驗證，從而深入理解中藥的治療效果。1.6研究目的與意義本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法及體外實驗，探索淫羊藿治療宮頸癌的潛在分子機制。研究目標(biāo)為識別淫羊藿的活性成分及其靶點，分析其對宮頸癌相關(guān)信號通路的影響，還通過體外實驗測試淫羊藿對宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和理論支持。本研究旨在探索中藥在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的價值，為宮頸癌治療提供一種新思路?，F(xiàn)有研究顯示，超過60%的臨床抗癌藥物源自天然產(chǎn)物[37]，其中植物來源的化合物已超3000種被應(yīng)用于癌癥治療[38]。相較于普通植物化合物，生物活性分子展現(xiàn)出更為顯著的抗癌效能[39]，這使得天然產(chǎn)物抗癌研究成為學(xué)術(shù)界關(guān)注焦點。基于此，本研究著重探究淫羊藿的抗腫瘤特性，以期為抗癌藥物研發(fā)提供新方向。淫羊藿首載于《\t"/item/%E6%B7%AB%E7%BE%8A%E8%97%BF/_blank"神農(nóng)本草經(jīng)》，有著上千年的用藥史REF_Ref11008\r\h[40]。中國是其地理分布中心，擁有40個品種，其中15個種類形成藥材商品，是《中華人民共和國藥典》2015年版收錄的關(guān)鍵物種之一REF_Ref11279\r\h[41]。淫羊藿在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其具備多重藥理活性[42]，該藥材對骨骼、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)具有顯著保護作用，同時可調(diào)節(jié)生殖機能。臨床上，淫羊藿常被用于骨質(zhì)疏松癥、不孕癥、健忘癥、老年功能障礙、心血管疾病REF_Ref11439\r\h[43]、勃起功能障礙REF_Ref11488\r\h[44]、焦慮抑郁、激素紊亂REF_Ref11530\r\h[45]、炎癥REF_Ref11592\r\h[46]及腫瘤等REF_Ref11625\r\h[47]。在肝癌治療中，淫羊藿提取物可抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡REF_Ref11690\r\h[48]。在甲狀腺癌治療中，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞活性REF_Ref11755\r\h[49]。在食管癌治療中，可增強裸鼠的Fas-FasL蛋白表達(dá)，抑制食管癌細(xì)胞生長并誘導(dǎo)凋亡REF_Ref11798\r\h[50]，在膀胱癌的治療進程中，該物質(zhì)能夠有效調(diào)控關(guān)鍵蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗癌作用。其主要可抑制細(xì)胞增殖核抗原（PCNA）的蛋白合成，降低Bcl-2蛋白水平，同時提升Bax蛋白表達(dá)量，通過這種協(xié)同作用，誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞走向程序性死亡，進而達(dá)到抑制腫瘤發(fā)展的目的REF_Ref11827\r\h[51]。還可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞CD54和CD18表達(dá)，增加細(xì)胞對細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞的敏感性REF_Ref11876\r\h[52]。然而，淫羊藿治療宮頸癌相關(guān)研究很少，其機制不明。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接及體外實驗，結(jié)合中醫(yī)多通路、多成分、多靶點協(xié)同作用的特點，探索淫羊藿治療宮頸癌的潛在藥理和分子機制，為淫羊藿在宮頸癌臨床治療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和思路。2網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接2.1篩選淫羊藿活性成分和主要靶點本研究借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)TCMSP數(shù)據(jù)庫（/tcmsp.php），對淫羊藿的活性成分展開篩選工作，類藥性（DrugLikeness,DL）和口服生物利用度（OralBioavailability,OB）是評價藥物在體內(nèi)有效利用的關(guān)鍵指標(biāo)。設(shè)定閾值為OB≥30，DL≥0.18，篩選淫羊藿的主要成分，并收集其相關(guān)靶點，統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為GeneSymbol。2.2篩選宮頸癌相關(guān)靶點以“CervicalCancer”作為檢索詞，在GeneCards（https:∥/）和OMIM（https:∥/）數(shù)據(jù)庫中進行檢索，獲取宮頸癌相關(guān)靶點信息，并將其保存，以備后續(xù)研究使用。2.3篩選核心靶點探究藥物與疾病相關(guān)靶點的聯(lián)系，先將前期獲取的相關(guān)靶點數(shù)據(jù)，導(dǎo)入至在線分析工具Venny2.1.0（b.csic.es/tools/venny/）。利用該工具交集分析功能，篩選出藥物與疾病的共有靶點。隨后，把得到的交集靶點信息，提交至STRING數(shù)據(jù)庫（https:∥/），設(shè)置物種為“人類”（Homosapiens），置信度設(shè)閾值＞0.9，并隱藏?zé)o關(guān)靶點，生成PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖。隨后導(dǎo)入Cytoscape3.9.0軟件，利用NetworkAnalyzer模塊分析網(wǎng)絡(luò)圖，依據(jù)節(jié)點的度數(shù)和中介中心度值篩選關(guān)鍵基因。2.4構(gòu)建中藥-成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖為深入探究淫羊藿活性成分和宮頸癌靶點的關(guān)聯(lián)，將淫羊藿的主要成分和靶點數(shù)據(jù)輸入Cytoscape3.8.2軟件開展可視化剖析?；贒egree值對網(wǎng)絡(luò)圖進行解析與可視化處理，構(gòu)建出包含中藥成分以及交集靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。2.5GO功能注釋與KEGG通路富集分析借助DAVID數(shù)據(jù)庫（https:∥/）與微生信平臺（https:∥/），進行基因本體（GO）功能及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路的富集分析。將交集靶點上傳至Metascape網(wǎng)站，以H.Sapiens為物種進行CustomAnalysis，設(shè)置p值＜0.01，MinOverlap為3，MinEnrichment為1.5。通過這些分析，明確淫羊藿治療宮頸癌的潛在作用靶點的生物學(xué)功能及參與的通路,進而預(yù)測其治療宮頸癌的可能機制。2.6分子對接首先，于PDB數(shù)據(jù)庫（/）內(nèi)檢索核心靶點的晶體結(jié)構(gòu)，篩選含有配體且分辨率較低的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，在PubChem（/）數(shù)據(jù)庫中獲取淫羊藿主要活性成分的小分子配體的2D結(jié)構(gòu)。運用Chem3D軟件把2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)，將其以SDF格式存儲。接著，執(zhí)行能量最小化操作，再把處理后的結(jié)構(gòu)以Mol2格式保存。之后，利用AutoDockVina軟件開展分子對接實驗。并借助DiscoveryStudio2019Client軟件展示3D和2D圖。

3體外實驗部分3.1實驗材料3.1.1儀器THC-20B型數(shù)控超聲波提取機太陽集團tyc5997（中國）股份有限公司LE204E/02電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮MCO-15ACCO2培養(yǎng)箱上海巴玖科學(xué)儀器有限公司酶標(biāo)儀上海閃譜生物科技有限公司顯影儀深圳市矢量科學(xué)儀器有限公司3.1.2藥品與試劑淫羊藿哈爾濱三棵樹藥材市場BCA蛋白濃度測定試劑盒碧云天生物科技有限公司ECL熒光顯色試劑碧云天生物科技有限公司PBS試劑碧云天生物科技有限公司細(xì)胞凋亡試劑盒碧云天生物科技有限公司DMEM培養(yǎng)基HyClone公司胰蛋白酶HyClone公司AKT1RabbitMonoclonalAntibody一抗PI3K（Erk2）RabbitPolyclonalAntibody（KOValidated）一抗GoatAnti-rabbitIgG/HRPantibody二抗碧云天生物科技有限公司3.1.3細(xì)胞株宮頸癌Hela細(xì)胞上海富衡生物科技有限公司，F(xiàn)H03093.2實驗方法3.2.1實驗藥液制備將淫羊藿葉片洗凈后粉碎，過10-20目篩。加入70%-80%的乙醇，加熱回流提取2-4次，每次2-3小時。完成提取后進行過濾，合并所得濾液，經(jīng)減壓濃縮直至無酒精氣味。隨后，添加適量水稀釋，靜置后再次過濾，便可得到淫羊藿提取液。3.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組從液氮罐中取出Hela細(xì)胞，在37℃溫水浴中快速復(fù)溫解凍，將細(xì)胞置于添加了1%青霉素-鏈霉素混合液、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃且二氧化碳濃度為5%的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下培養(yǎng)。待細(xì)胞充分貼壁，使用胰酶消化進行傳代處理，將生長良好的對數(shù)期Hela細(xì)胞以每孔2mL的量接種到6孔板，培養(yǎng)24h后分組，設(shè)置未處理的細(xì)胞為對照組，實驗組分別用低、中、高劑量的淫羊藿浸出液處理Hela細(xì)胞。3.3WesternBlot法檢測AKT1和MAPK1信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)先從各組細(xì)胞中提取總蛋白，再用BCA試劑盒精確檢測其濃度。隨后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。為降低非特異性結(jié)合，將膜浸入含5%脫脂乳粉的TBST封閉液中，室溫條件下，將膜置于搖床上低速振蕩，封閉2小時。封閉結(jié)束，向膜內(nèi)添加按1:500稀釋的AKT1、MAPK1抗體，隨后將膜放入4℃冰箱，孵育過夜，促進抗體充分結(jié)合。次日，取出膜用TBST溶液清洗，再加入稀釋至1:2000的二抗，室溫下孵育2小時。完成孵育后，多次用TBST洗滌膜，直至膜潔凈，最后利用ECL化學(xué)發(fā)光液使蛋白質(zhì)條帶顯影。最終，以β-actin為內(nèi)參，利用成像分析系統(tǒng)掃描蛋白條帶，測定其灰度值，從而量化目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理所有實驗結(jié)果均取至少三次獨立實驗的平均值。數(shù)據(jù)處理與分析采用IBMSPSSStatistics21軟件完成，并以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(±s)表示。組間差異性通過t檢驗評估，當(dāng)（P<0.01）時，認(rèn)為兩組間存在顯著差異。4實驗結(jié)果4.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接4.1.1藥物主要成分和靶點以及疾病相關(guān)靶點本研究共搜集到23種淫羊藿的主要成分，其中Magnograndiolide的OB值最高（63.71%），IcarisideA7的DL值最高（0.86）。按OB值降序排列的成分（見表1）。進一步收集淫羊藿的相關(guān)靶點，去除重復(fù)項后共得198個靶點。同時，在Genecard數(shù)據(jù)庫中檢索到宮頸癌相關(guān)靶點6314個。表1淫羊藿主要活性成分MolIDMoleculeNameOB(%)DLMOL000622Magnograndiolide63.710.19MOL004367olivil62.230.41MOL0043886-hydroxy-11,12-dimethoxy-2,2-dimethyl-1,8-diox0-2,3,4,8-tetrahydro-1H-isochromeno[3,4-h]isoquinolin-2-ium60.640.66MOL004382YinyanghuoA56.960.77MOL0043961,2-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-1,3-diol52.310.22MOL004386YinyanghuoE51.630.55MOL0043918-(3-methylbut-2-enyl)-2-phenyl-chromone48.540.25MOL000098quercetin46.430.28MOL004384YinyanghuoC45.670.5MOL004373Anhydroicaritin45.410.44MOL001645Linoleylacetate42.10.2MOL000422kaempferol41.880.24MOL004394Anhydroicaritin-3-0-alpha-L-rhamnoside41.580.61MOL004425Icariin41.580.61MOL004380Homoerythrinan,1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-,(3.beta.)39.140.49MOL0035428-Isopentenyl-kaempferol38.040.39MOL00151024-epicampesterol37.580.71MOL001771poriferast-5-en-3beta-0l36.910.75MOL000359sitosterol36.910.75MOL000006luteolin36.160.25MOL003044Chryseriol35.850.27MOL001792DFV32.760.18MOL004427IcarisideA731.760.864.1.2繪制venny圖將淫羊藿靶點與宮頸癌靶點上傳至在線平臺上，生成Venny圖（見圖2），最終篩選出173個交集靶點。圖2Venny圖4.1.3篩選核心靶點將交集靶點上傳至STRING網(wǎng)站，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3），得到172個節(jié)點，628條邊，平均節(jié)點度值為3，平均局部集聚系數(shù)為0.393，p-value＜1.0e-16。利用Cytoscape3.8.2進一步構(gòu)建交集靶點的網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4）。圖中，內(nèi)圈、顏色深、形狀大的節(jié)點Degree值高，可能是淫羊藿治療宮頸癌的關(guān)鍵靶點。在這些靶點中，AKT1、TP53、MAPK1等靶點的Degree值各異。具體而言，AKT1的Degree值為39，TP53、MAPK1的Degree值均為36，JUN的Degree值是35，ESR1為31，JUN為26，RELA為24，MAPK14為23，F(xiàn)OS、MAPK8的Degree值同為22，CDKN1A的Degree值也是22。圖3PPI網(wǎng)絡(luò)圖4交集靶點的網(wǎng)絡(luò)圖注：越在內(nèi)圈，顏色越深，形狀越大，Degree值越大4.1.4構(gòu)建中藥-成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論，篩選出淫羊藿的主要活性成分，并借助Cytoscape3.8.2軟件進行可視化分析（見圖5），圖中，黃色圓圈標(biāo)識淫羊藿的主要活性成分，紅色圓圈代表淫羊藿，靶點以綠色長方形標(biāo)識。節(jié)點形態(tài)大小與色彩深淺直觀反映Degree值，尺寸越大、顏色越濃，對應(yīng)Degree值越高。此次分析共得到195個節(jié)點、411條邊，其中MOL000098（Quercetin）的Degree值最高為128，其次，MOL000006（木犀草素）值為52，MOL000422（山柰酚）值為49，MOL004373（脫水淫羊藿素）值為30。圖5淫羊藿-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖注：以紅色圓圈表征中藥淫羊藿，黃色圓圈標(biāo)識其核心活性成分，綠色長方形代表靶點。節(jié)點的色澤深度與形態(tài)尺寸正比于Degree值，顏色越深、形狀越大，對應(yīng)Degree值越高。4.1.5GO和KEGG通路富集分析對173個交集靶點開展基因本體（GO）功能及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集解析，繪制前20個靶點氣泡圖（見圖6-9）。圖6GO分析中BP前20氣泡圖圖7GO分析中MF前20氣泡圖圖8GO分析中CC前20氣泡圖圖9KEGG分析中前20氣泡圖4.1.6分子對接驗證進一步探究淫羊藿治療宮頸癌的活性，配體與受體結(jié)合能越小，結(jié)合穩(wěn)定性越高。當(dāng)結(jié)合能呈負(fù)值時，意味著配體與受體可自發(fā)結(jié)合。本研究選擇Quercetin與核心靶點TP53、AKT1、JUN、MAPK1、RELA、ESR1、MAPK14、FOS、MAPK8、CDKN1A進行對接打分，結(jié)果均小于-6kcal/mol。其中，RELA與Quercetin的對接打分最低（Affiffiffinity為-9.2kcal/mol），而FOS與Quercetin的對接打分最高（Affiffiffinity為-6.5kcal/mol），具體對接打分如下（見表2）。最后，利用DiscoveryStudio2019Client軟件展示對接結(jié)果的3D和2D圖（見圖10A-J）。表2Quercetin對接打分TargetsPDBIDAffinity(kcal/mol)TP535hmk-8AKT13os5-8.7JUN3ptg-8.4MAPK15k4i-8.6RELA3rc0-9.2ESR15acc-7.6MAPK14lozl-8.4FOS5fv8-6.5MAPK84glw-7.9CDKN1A5oai-6.9圖10Quercetin與TP53、RELA、MAPK14、MAPK8、MAPK1、JUN、FOS、ESR1、CDKN1A、AKT1的對接圖像。A：Quercetin與TP53；B:Quercetin與RELA；C:Quercetin與MAPK14；D:Quercetin與MAPK8；E:Quercetin與MAPK1；F:Quercetin與JUN；G:Quercetin與FOS；H:Quercetin與ESR1；I:Quercetin與CDKN1A；J:Quercetin與AKT1。表3分子對接的相互作用參數(shù)TargetsHydrogenbPi-AIKylPi-SigmaPi-PiTP53GLN-72LYS-51LEU-54TYR-67TYR-67ARG-208RELAARG-358LEU-205LEU-362GLU-360THR-307LEU-171MAPK14LEU-104ALA-51THR-106VAL-38THR-106TYR-35LYS-53LEU-104LYS-53MAPK8LYS-55GLU-73ARG-69ARG-69MAPK1ALA-52GLU-71VAL-39ILE-31LEU-156ASP-167CYS-166ASP-111ILE-31LYS-54VAL-78JUNGLU-147MET-149VAL-196ALA-91ILE-70LEU-206ASP-150ILE-70LEU-206FOSARG-28ARG-16ALA-21ALA-21LYS-11LYS-14ESRIPRO-324PRO-324ARG-394ILE-326TRP-393PRO-325GLU-353CDKNIAILE-19ILE-19LEU-54HIS-96GLN-24ASN-265AKT1TYR-335ILE-223ALA-226TRP-352ASN-296HIS-2964.2WesternBlot實驗結(jié)果4.2.1淫羊藿促凋亡時相關(guān)蛋白的表達(dá)通過體外實驗檢測淫羊藿對Hela細(xì)胞中促凋亡相關(guān)蛋白指標(biāo)AKT1和MAPK1表達(dá)的調(diào)控作用，結(jié)果顯示，淫羊藿顯著抑制AKT1蛋白的表達(dá)，顯著激活MAPK1蛋白的表達(dá)（P<0.01），且呈劑量依賴性（見表4、圖11、圖12）。淫羊藿能雙向調(diào)節(jié)Hela細(xì)胞關(guān)鍵信號通路，這表明淫羊藿可通過調(diào)控AKT1和MAPK1信號網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮抗腫瘤作用。表4淫羊藿對Hela細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)情況影響（±s，n=3）組別AKT1（相對表達(dá)量）MAPK1（相對表達(dá)量）空白組(0μg/mL)1.00±0.081.00±0.07低劑量組(300μg/mL)0.82±0.07**1.28±0.09**中劑量組(500μg/mL)0.61±0.06**▲▲1.55±0.11**▲▲高劑量組(700μg/mL)0.45±0.05**▲▲▼▼1.85±0.14**▲▲▼▼注：與空白組相比，**P<0.01；與低劑量組相比，▲▲P<0.01；與中劑量組相比，▼▼P<0.01圖11不同劑量淫羊藿WesternBlot實驗結(jié)果圖圖12淫羊藿對AKT1、MAPK1蛋白表達(dá)量統(tǒng)計圖5討論宮頸惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅全球女性生殖系統(tǒng)健康的惡性疾患，其流行病學(xué)特征和臨床防治現(xiàn)狀始終是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點問題REF_Ref5021\r\h[53]。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，該疾病在全球范圍內(nèi)的疾病負(fù)擔(dān)呈現(xiàn)持續(xù)增長態(tài)勢，在發(fā)展中國家，宮頸惡性腫瘤的年齡標(biāo)化發(fā)病率明顯高于發(fā)達(dá)國家[54]。該疾病不僅會對患者生理機能造成永久性損害，還會引發(fā)一系列心理及社會問題，同時也給醫(yī)療衛(wèi)生體系帶來沉重經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[55]。我國作為人口大國，宮頸惡性腫瘤的防治形勢尤為嚴(yán)峻REF_Ref6148\r\h[56]。國家癌癥中心最新腫瘤登記年報數(shù)據(jù)顯示，在我國女性惡性腫瘤發(fā)病情況中，該疾病處于高發(fā)位置，其年齡標(biāo)化發(fā)病率與死亡率均大幅高于全球平均水平[57]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來該疾病的發(fā)病年齡呈現(xiàn)明顯的年輕化趨勢，這與性行為模式改變、HPV感染率上升等因素密切相關(guān)REF_Ref7601\r\h[58]。這一流行病學(xué)特征的變化，使得臨床治療面臨更多挑戰(zhàn)，特別是對于有生育需求的患者群體。在臨床診療規(guī)范方面，目前國際上普遍采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟制定的分期系統(tǒng)作為治療決策的主要依據(jù)。目前，根治性子宮切除術(shù)輔以淋巴結(jié)清掃仍是早期患者的常規(guī)治療手段REF_Ref9645\r\h[59]。但臨床觀察顯示，約三成患者處于生育年齡，且生育需求尚未滿足，這使得傳統(tǒng)手術(shù)方案的適用性受到限制REF_Ref10413\r\h[60]。雖然保留生育功能的手術(shù)方式如宮頸廣泛切除術(shù)等已在臨床開展，但此類手術(shù)易引發(fā)術(shù)后妊娠風(fēng)險，導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)等不良的后果REF_Ref11086\r\h[61]。這一臨床困境促使研究人員必須探索更為精準(zhǔn)的治療策略。在腫瘤治療領(lǐng)域，傳統(tǒng)中醫(yī)藥因其獨特的理論體系和豐富的臨床經(jīng)驗，正逐漸受到國際醫(yī)學(xué)界的重視REF_Ref11432\r\h[62]。與現(xiàn)代化學(xué)合成藥物相比，中藥復(fù)方憑借多組分、多作用靶點及整體調(diào)理的特性，在復(fù)雜病癥的防治中彰顯出獨特價值REF_Ref11713\r\h[63]。據(jù)統(tǒng)計，目前臨床應(yīng)用的抗腫瘤藥物中，超過半數(shù)的先導(dǎo)化合物來源于天然植物提取物REF_Ref12578\r\h[64]。值得關(guān)注的是，經(jīng)證實超三千種植物活性成分具有潛在抗腫瘤功效[65]，為創(chuàng)新抗腫瘤藥物研發(fā)構(gòu)筑了重要資源基礎(chǔ)。本研究選取傳統(tǒng)中藥淫羊藿作為研究對象，淫羊藿在我國藥用歷史源遠(yuǎn)流長。其最早見于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》[66]，被列為中品藥材，亦收錄于現(xiàn)代《中華人民共和國藥典》[67]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，該藥材富含黃酮、生物堿、多糖等多種活性成分[68]。這些活性成分通過復(fù)雜的協(xié)同作用，表現(xiàn)出廣泛的藥理活性，在骨質(zhì)疏松、神經(jīng)退行性疾病等慢性病癥的防治中，亦展現(xiàn)出顯著療效，在抗腫瘤領(lǐng)域也展現(xiàn)出巨大潛力REF_Ref14260\r\h[69]。已有實驗證據(jù)表明，淫羊藿提取物可通過調(diào)控多種信號通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性表型REF_Ref14540\r\h[70]。本研究采用整合生物信息學(xué)與實驗科學(xué)的研究策略，系統(tǒng)探索淫羊藿抗宮頸惡性腫瘤的作用機制REF_Ref14808\r\h[71]。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，構(gòu)建活性成分、潛在靶點與信號通路的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)拓?fù)浞治?，成功篩選出多個核心靶點蛋白，篩選出的核心靶點涵蓋AKT1、MAPK1等調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的關(guān)鍵信號分子REF_Ref15128\r\h[72]。進一步的蛋白質(zhì)免疫印跡分析證實，淫羊藿能雙向調(diào)節(jié)Hela細(xì)胞關(guān)鍵信號通路，顯著抑制AKT1，明顯激活MAPK1。該提取物確實可以調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，這些發(fā)現(xiàn)與前期生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果具有高度一致性。這種將計算預(yù)測與實驗驗證相結(jié)合的研究范式，為解析中藥多效作用機制開辟了新路徑REF_Ref15938\r\h[73]。通過系統(tǒng)生物學(xué)的方法，可以更全面地理解中藥多組分、多靶點的作用特點，克服傳統(tǒng)研究方法的局限性REF_Ref16242\r\h[74]。本研究不僅深化了對淫羊藿藥理作用的認(rèn)識，為宮頸惡性腫瘤靶向治療及創(chuàng)新藥物開發(fā)也提供了關(guān)鍵分子靶點與重要方向。后續(xù)研究將聚焦提取工藝的優(yōu)化改進，將深入探究分子作用機制，為創(chuàng)制擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型抗癌藥物提供理論支撐。從臨床轉(zhuǎn)化角度看，本研究揭示了活性物質(zhì)及其作用機理，為宮頸癌患者，或為有生育訴求的年輕患者提供創(chuàng)新治療方案。與現(xiàn)有治療手段相比，中藥提取物可能具有更好的安全性和耐受性，這對于需要長期治療的患者尤為重要REF_Ref18126\r\h[75]。當(dāng)然，要實現(xiàn)真正的臨床應(yīng)用，還需要進行系統(tǒng)的藥效學(xué)、毒理學(xué)評價以及規(guī)范的臨床試驗驗證。此外，考慮到腫瘤異質(zhì)性和個體差異，后續(xù)研究需著重探索生物標(biāo)志物篩選與個性化用藥策略制定。本研究整合多學(xué)科研究手段，系統(tǒng)闡釋了傳統(tǒng)中藥淫羊藿抗宮頸惡性腫瘤的潛在作用機制，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供了范例。本研究成果兼具理論價值，更為創(chuàng)新抗癌藥物研發(fā)與個體化治療策略制定夯實科學(xué)基礎(chǔ)。隨著研究的深入，傳統(tǒng)中醫(yī)藥必將在惡性腫瘤綜合治療中發(fā)揮更加重要的作用。

結(jié)論1、本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，預(yù)測了中藥淫羊藿治療宮頸癌的分子機制可能與調(diào)控AKT1、MAPK1蛋白有關(guān)，為淫羊藿的進一步實驗驗證奠定了基礎(chǔ)。2、通過WB實驗，驗證了中藥淫羊藿可以調(diào)控宮頸癌細(xì)胞AKT1、MAPK1蛋白的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)為今后相關(guān)藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，有利的指引了后續(xù)的研究方法。參考文獻(xiàn)姚辛敏,周曉潔,周妍妍,等.遠(yuǎn)志化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2022,50(2)：103-107.翟英茹,羅江南,李慧,等.不同基原淫羊藿綜合品質(zhì)研究[J].中成藥,2024,46(10)：3197-3203.馬曉輝,劉立,孫少伯,等.淫羊藿資源現(xiàn)狀及潛在分布區(qū)劃研究[J].中國現(xiàn)代中藥,2020,22(7)：5.國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版.一部[M].中國醫(yī)藥科技出版社,2015.李莉,王嘉瑞,王晶,等.淫羊藿的主要化學(xué)成分,藥理作用研究進展及質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測分析[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2023,41(11)：143-151.廖玉玲,莫鎮(zhèn)濤,李文娜,等.淫羊藿苷的藥理學(xué)研究進展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2020,38(08)：139-142.孟寧,孔凱,李師翁.淫羊藿屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進展[J].西北植物學(xué)報,2010(5)：11.邢中夫,于慧,萬新煥.淫羊藿多糖提取,分離純化,結(jié)構(gòu)特征和生物活性研究進展[J].藥學(xué)研究,2023,42(10)：830-836.張利,李佳莉,高苑,等.淫羊藿素的藥理作用及機制研究進展[J].中草藥,2024,55(17)：6069-6077.李堂帥,紀(jì)寶玉,陳琳,等.基于“藥用部位-化學(xué)成分-藥理活性-性味功效”的刺類藥用植物相關(guān)性[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2024,30(22).梁利香,付雪麗,王海燕,等.基于不同炮制方法的淫羊藿黃酮類成分含量研究[J].FeedIndustry,2024,45(9).王建紅,肖雪,姚遠(yuǎn).宮頸癌多組學(xué)研究進展[J].四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)[2025-04-21].劉騰達(dá),馬欣原,崔云鶴,等.淫羊藿治療心肌損傷的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析[J/OL].北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),1-6[2025-04-03].徐睿鋒,王泓睿,車云,等.中美癌癥流行特征及長期趨勢對比研究[J/OL].中國胸心血管外科臨床雜志,1-12[2025-04-27].UbswchzhaSC.WorldHealthOrganizationGeneva[J].2010.LeiT,MaoWM,LeiTH,etal.IncidenceAndMortalityTrendofCervicalCancerin11CancerRegistriesofChina[J].ChineseJournalofCancerResearch,2011(01):10-14.CibulaD,P?tterR,PlanchampF,etal.TheEuropeanSocietyofGynaecologicalOncology/EuropeanSocietyforRadiotherapyandOncology/EuropeanSocietyofPathologyGuidelinesfortheManagementofPatientswithCervicalCancer[J].VirchowsArchiv:aninternationaljournalofpathology,2018.Cui,Rosa,R,etal.TrendsinUseandSurvivalAssociatedWithFertility-SparingTrachelectomyforYoungWomenWithEarly-StageCervicalCancer[J].ObstetricsandGynecology:JournaloftheAmericanCollegeofObstetriciansandGynecologists,2018,131(6):1085-1094.LiaoYH,LiCI,LinCC,etal.TraditionalChinesemedicineasadjunctivetherapyimprovesthelong-termsurvivaloflungcancerpatients[J].JournalofCancerResearch&ClinicalOncology,2017.LiuYX,BaiJX,LiT,etal.ATCMformulacomprisingSophoraeFlosandLoniceraeJaponicaeFlosalterscompositionsofimmunecellsandmoleculesoftheSTAT3pathwayinmelanomamicroenvironment[J].PharmacologicalResearch,2019.Chen,MeihongYe,KeZhang,etal.ParisSaponinIIinhibitscolorectalcarcinogenesisbyregulatingmitochondrialfissionandNF-kappaBpathway[J].Pharmacologicalresearch:TheofficialjournalofTheItalianPharmacologicalSociety,2019,139.姜蕊,閆莉,鄒明軒,等.朝鮮淫羊藿內(nèi)生真菌Ilyonectriacyclaminicola代謝產(chǎn)物與藥材化學(xué)成分的對比研究[J/OL].中藥材,2025,(04)：916-921[2025-04-27].王建紅,肖雪,姚遠(yuǎn).宮頸癌多組學(xué)研究進展[J].四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)[2025-04-21].王義翠,彭慧霞,夏子嵐,等.淫羊藿苷藥理作用及應(yīng)用研究進展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2023,41(6)：182-186.吳迪,米甜,王賀東,等.淫羊藿素的藥理作用及分子機制研究進展[J].醫(yī)學(xué)研究與教育,2023,40(6)：1-11.陳亮,郝夢超,安超娜,等.淫羊藿多糖提取工藝及其藥理活性研究進展[J].江蘇調(diào)味副食品,2023,(01)：5-8+11.李曉兵,丁云錄,李馳坤,等.淫羊藿多糖的提取分離及體內(nèi)抗氧化活性研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2020,36(5)：5.ZhangSQ.Ultra-highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometryforthequantificationoficaritininmousebone[J].Journalofchromatography.B,Analyticaltechnologiesinthebiomedicalandlifesciences,2014,978-979C:24-28.ZhangSQ,ZhangSZ.Oralabsorption,distribution,metabolism,andexcretionoficaritininratsbyQ‐TOFandUHPLC–MS/MS[J].DrugTesting&Analysis,2017.HuongNT,SonN.Icaritin:Aphytomoleculewithenormouspharmacologicalvalues.[J].Phytochemistry,2023.吳迪,米甜,王賀東,等.淫羊藿素的藥理作用及分子機制研究進展[J].醫(yī)學(xué)研究與教育,2023,40(6)：1-11.GaoL,ZhangSQ.AntiosteoporosisEffects,Pharmacokinetics,andDrugDeliverySystemsofIcaritin:AdvancesandProspects[J].2022.高麗芳,張雙慶.淫羊藿素抗炎作用的研究進展[J].國外醫(yī)藥：抗生素分冊,2023,44(1)：26-32.張妤.淫羊藿素通過抑制脂肪酸合成酶活性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和生長抑制[D].中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué),2009.孫禮堂,劉明川,曹健,等.基于多指標(biāo)定量指紋圖譜和化學(xué)計量學(xué)的淫羊藿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究[J].化學(xué)試劑,2023,45(11)：117-125.李泮霖,蘇薇薇.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥研究中的最新應(yīng)用進展[J].中草藥,2016,47(16)：5.Zhang,Chen,LX,etal.Plantnaturalcompounds:targetingpathwaysofautophagyasanti-cancertherapeuticagents[J].CELLPROLIFERAT,2012,2012,45(5)(-):466-476.AminARMR,KucukO,KhuriFR,etal.PerspectivesforCancerPreventionWithNaturalCompounds[J].JournalofClinicalOncology,2009,27(16):2712-2725.MonksNR,LiB,GunjanS,etal.NaturalProductsGenomics:Anovelapproachforthediscoveryofanti-cancertherapeutics.[J].JournalofPharmacological&ToxicologicalMethods,2011,64(3):217-225.周富榮.《中華人民共和國藥典》2000年版一部評價[J].中國中藥雜志,2000,25(7)；441-444.趙文龍,王惠珍,馬毅,等.4種基原的淫羊藿適宜生境分布研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2019,26(02)：6-10.王彩虹.中藥多成分藥代動力學(xué)的新方法和策略研究[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2017.MaH,HeX,YangY,etal.ThegenusEpimedium:Anethnopharmacologicalandphytochemicalreview[J].JournalofEthnopharmacology,2011,134(3):519-541.ShindelAW,XinZC,LinG,etal.ErectogenicandNeurotrophicEffectsofIcariin,aPurifiedExtractofHornyGoatWeed(Epimediumspp.)InVitroandInVivo[J].JournalofSexualMedicine,2010,7(4pt1):1518-1528.Qure