ICS65.020.20

CCSB21

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內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2594—2022

紫花苜蓿組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

Technicalcodeofpracticefortissuecultureofmedicagosativa

2022-06-24發(fā)布2022-07-24實施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2594—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)和草原局提出并歸口。

本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)。

本文件主要起草人：徐春波、王勇、趙海霞。

I

DB15/T2594—2022

紫花苜蓿組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了紫花苜蓿組織培養(yǎng)的術(shù)語與定義、培養(yǎng)基、外植體、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、

分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗與移栽等基本內(nèi)容及技術(shù)要求。

本文件適用于紫花苜蓿組織培養(yǎng)育苗。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T603化學(xué)試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備

NY/T2306花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程

DB15/T1940西部沙櫻組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)

3術(shù)語和定義

NY/T2306界定的術(shù)語和定義適用于本文件。

紫花苜蓿medicagosativaL.

屬于豆科（Leguminosae）苜蓿屬（Medicago）多年生草本植物。

4環(huán)境與器具滅菌

按照DB15/T1940操作。

5培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基、1/2MS、改良SH培養(yǎng)基和MSO培養(yǎng)基見附錄A。

母液的配制和保存

5.2.1配制

將常用試劑配制成50～100倍的母液，嚴(yán)格按照GB/T603規(guī)定方法配制。所用激素均配制濃度為0.5

mg/mL，配制方法詳見附錄B。

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DB15/T2594—2022

5.2.2保存

母液配制好分別貼上標(biāo)簽，注明溶液名稱、配制倍數(shù)、配制日期、配制者。母液貯存在4℃的冰箱

中。貯藏時間在3個月之內(nèi)，有霉菌和沉淀產(chǎn)生，則不準(zhǔn)許使用。

培養(yǎng)基的配制

5.3.1配制

配置1L培養(yǎng)基時，先加蒸餾水600ml～700ml，再加入7.5g瓊脂，加熱攪拌瓊脂融化后加入25g

蔗糖，攪拌溶解后再分別加入母液，攪拌均勻，加蒸餾水定容至1L。

5.3.2pH值調(diào)節(jié)

用1mol/L的NaOH將配制好的培養(yǎng)基調(diào)到pH值5.8～6.0，用酸度計或精密pH試紙測定。

5.3.3分裝和滅菌

配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝。分裝量以占培養(yǎng)容器的1/4～1/3為宜。切勿將培養(yǎng)基沾到瓶口和外壁上，

以免招致雜菌污染。分裝后立即加蓋，不同的處理做好標(biāo)記。分裝后進(jìn)行滅菌，121℃狀態(tài)下保持20min。

6外植體

無菌苗的培養(yǎng)

紫花苜蓿種子用75%的酒精滅菌3min～5min，無菌水沖洗，再用10%次氯酸鈉消毒10min～15min，

無菌水沖洗5～6次后用滅菌的濾紙吸干種子表面的液體，接種到1/2MS培養(yǎng)基上。

外植體的選擇和制備

取7d～10d無菌苗的子葉和下胚軸或15d～20d無菌苗的葉片、葉柄和莖段，將外植體剪成3mm～

5mm長的小塊或小段。

7愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良SH+2.0mg/L2，4-D+0.5mg/L6-BA。

接種

將外植體接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每2.5cm2～3cm2接種1個，均勻擺放，封好皿口，標(biāo)明名

稱和日期。

培養(yǎng)條件

白天25℃、晚上18℃，每天光照時間16h，光照強(qiáng)度1000Lux～2000Lux。

培養(yǎng)時間

培養(yǎng)20d～30d。

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8增殖培養(yǎng)

培養(yǎng)基

增殖培養(yǎng)基1為MSO+0.5mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LAgNO3。增殖培養(yǎng)基2為MS+0.3mg/L

TDZ。

接種

在超凈工作臺上，將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基上，每4cm2～5cm2接種1個，均勻擺放，封

好皿口，標(biāo)明名稱和日期。

培養(yǎng)條件

按照7.3進(jìn)行。

培養(yǎng)時間

增殖培養(yǎng)基1培養(yǎng)14d～20d，移到增殖培養(yǎng)基2繼續(xù)培養(yǎng)5d～7d，之后再移至增殖培養(yǎng)基1培養(yǎng)

10d～15d。

9分化培養(yǎng)

培養(yǎng)基

分化培養(yǎng)基為MS+0.2mg/LKT。

接種

在超凈工作臺上，將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，每5cm2～6cm2接種1個，均勻擺放，封好瓶口，

標(biāo)明名稱和日期。

培養(yǎng)條件

按照7.3進(jìn)行。

培養(yǎng)時間

培養(yǎng)40d～50d；每20d換1次培養(yǎng)基。

10生根培養(yǎng)

培養(yǎng)基

生根培養(yǎng)基為1/2MS。

接種

在超凈工作臺上，將長至3cm～5cm的小苗逐一轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，每器皿接種1苗，封好瓶口，標(biāo)

明名稱和日期。

培養(yǎng)條件

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DB15/T2594—2022

按照7.3進(jìn)行。

培養(yǎng)時間

培養(yǎng)20d～30d。

11煉苗與移栽

煉苗

選擇生長健壯的組培苗，打開封口膜，放在自然光、室溫下2d～3d。

基質(zhì)

土:草碳:蛭石3:2:1混合。高壓滅菌后裝入花盆備用。

移栽

取出組培苗，洗掉培養(yǎng)基，栽入花盆，澆水，放入溫室，適當(dāng)保溫，常規(guī)管理。待苗長至20cm～

30cm移栽至大田。

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

基本培養(yǎng)基成分

基本培養(yǎng)基成分見表A.1。

表A.1基本培養(yǎng)基成分

類型組分MS培養(yǎng)基改良SH培養(yǎng)基MSO培養(yǎng)基

KNO31900.02830.01900.0

NH4NO31650.0463.01650.0

大量元素MgSO4·7H2O370.0185.0370.0

KH2PO4170.0400.0170.0

CaCl2·2H2O440.0166.0440.0

MnSO4·4H2O22.300----22.300

ZnSO4·7H2O8.6008.6008.600

H3BO36.200----6.200

微量元素KI0.830----0.830

Na2MoO4·6H2O0.2500.2500.250

CuSO4.5H2O40.0250.0250.025

CoCl2.6H2O0.0250.0250.025

Na2-EDTA37.3037.3037.30

鐵鹽

FeSO4.7H2O27.8027.8027.80

甘氨酸2.000--------

鹽酸吡哆辛0.5009.5001.000

鹽酸硫銨素0.1009.90010.000

有機(jī)物

煙酸0.500----1.000

肌醇100.000----100.000

尼克酸----4.500----

5

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B

B

附錄B

（規(guī)范性）

激素的配制

激素的配制見表B.1。

表B.1激素的配制

類別名稱配制方法滅菌方式存儲方式

2，4-二氯苯氧乙酸

用適量無水乙醇溶解后加入去離冷藏（4℃），

（2，4-D）

生長素高溫滅菌

子水定容。