2025年上海市醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)人員PCR上崗證考試題含答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共40分）1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，Ct值的定義是：A.擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到平臺期的循環(huán)數(shù)B.熒光信號首次超過設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)C.熒光信號達(dá)到最大峰值的循環(huán)數(shù)D.基線期結(jié)束時(shí)的循環(huán)數(shù)答案：B2.以下哪種物質(zhì)不是PCR反應(yīng)體系的必需成分？A.模板DNAB.dNTPC.逆轉(zhuǎn)錄酶D.TaqDNA聚合酶答案：C（逆轉(zhuǎn)錄酶僅用于RT-PCR）3.臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室分區(qū)中，最嚴(yán)格禁止的操作是：A.在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行樣本處理B.在樣本處理區(qū)配制反應(yīng)體系C.在擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行加樣操作D.在產(chǎn)物分析區(qū)使用與其他區(qū)共用的移液器答案：C（擴(kuò)增區(qū)含大量擴(kuò)增產(chǎn)物，加樣易導(dǎo)致污染）4.引物設(shè)計(jì)時(shí)，避免3’端互補(bǔ)的主要目的是：A.減少引物二聚體形成B.提高擴(kuò)增特異性C.增加擴(kuò)增效率D.降低Tm值答案：A（3’端互補(bǔ)易形成引物二聚體）5.熒光探針法中，TaqMan探針的工作原理基于：A.熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）B.分子信標(biāo)構(gòu)象變化C.雜交后熒光基團(tuán)暴露D.擴(kuò)增產(chǎn)物與探針結(jié)合后淬滅解除答案：A（探針5’端熒光基團(tuán)與3’端淬滅基團(tuán)距離近時(shí)無熒光，Taq酶降解探針后分離發(fā)光）6.臨床PCR檢測中，內(nèi)參基因的主要作用是：A.監(jiān)測擴(kuò)增效率B.排除假陽性C.驗(yàn)證樣本核酸提取質(zhì)量D.定量目標(biāo)基因答案：C（內(nèi)參基因用于判斷樣本是否有效，排除提取失敗導(dǎo)致的假陰性）7.實(shí)驗(yàn)室發(fā)生氣溶膠污染時(shí)，最有效的處理措施是：A.紫外線照射30分鐘B.75%乙醇擦拭臺面C.次氯酸鈉（10%）浸泡D.過氧乙酸熏蒸答案：D（過氧乙酸可有效降解核酸氣溶膠，紫外線對封閉空間內(nèi)氣溶膠穿透力有限）8.以下關(guān)于PCR反應(yīng)退火溫度的描述，正確的是：A.應(yīng)高于引物Tm值5-10℃B.應(yīng)低于引物Tm值5℃左右C.與引物長度無關(guān)D.退火時(shí)間越長擴(kuò)增效率越高答案：B（退火溫度通常設(shè)置為引物Tm值減3-5℃，確保引物與模板有效結(jié)合）9.檢測HBVDNA時(shí)，若陰性對照出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，最可能的原因是：A.樣本核酸提取量過高B.引物特異性不足C.擴(kuò)增產(chǎn)物污染D.熱啟動酶未激活答案：C（陰性對照應(yīng)無擴(kuò)增，出現(xiàn)信號提示污染）10.下列哪種方法不能用于PCR產(chǎn)物的定性分析？A.瓊脂糖凝膠電泳B.實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測C.限制性內(nèi)切酶酶切D.測序答案：B（實(shí)時(shí)熒光用于定量，定性需通過電泳或測序確認(rèn)產(chǎn)物大?。?1.核酸提取過程中，加入蛋白酶K的主要目的是：A.裂解細(xì)胞膜B.降解RNAC.消化蛋白質(zhì)雜質(zhì)D.沉淀DNA答案：C（蛋白酶K水解蛋白質(zhì)，防止其抑制后續(xù)擴(kuò)增）12.實(shí)時(shí)熒光PCR儀的溫度均勻性應(yīng)控制在：A.±0.1℃B.±0.5℃C.±1.0℃D.±2.0℃答案：B（臨床檢測要求溫度均勻性≤±0.5℃，否則影響擴(kuò)增一致性）13.以下哪種情況會導(dǎo)致擴(kuò)增曲線呈“平臺期提前”？A.模板濃度過高B.引物濃度過低C.dNTP濃度不足D.Taq酶量不足答案：A（高濃度模板會提前消耗反應(yīng)底物，導(dǎo)致平臺期提前）14.實(shí)驗(yàn)室生物安全柜的使用中，錯誤的操作是：A.操作前開機(jī)運(yùn)行10分鐘B.物品放置于柜內(nèi)中后部C.操作時(shí)手臂頻繁進(jìn)出D.操作后用75%乙醇擦拭內(nèi)壁答案：C（頻繁手臂進(jìn)出會破壞氣流屏障，增加污染風(fēng)險(xiǎn)）15.檢測新型冠狀病毒RNA時(shí)，選擇N基因作為靶標(biāo)的主要原因是：A.保守性高，變異少B.擴(kuò)增效率低，避免假陽性C.序列長度短，易擴(kuò)增D.表達(dá)量低，需高靈敏度檢測答案：A（N基因在冠狀病毒中保守，適合作為通用檢測靶標(biāo)）16.PCR反應(yīng)體系中，Mg2+濃度過高可能導(dǎo)致：A.引物二聚體減少B.擴(kuò)增特異性下降C.產(chǎn)物量減少D.Taq酶失活答案：B（Mg2+濃度過高會降低引物與模板的特異性結(jié)合，增加非特異性擴(kuò)增）17.以下哪種物質(zhì)不屬于PCR抑制物？A.血紅蛋白B.肝素C.基因組DNAD.膽鹽答案：C（基因組DNA是模板，高濃度可能抑制但非外源性抑制物）18.室內(nèi)質(zhì)控中，連續(xù)3次檢測結(jié)果均偏離均值+2SD，應(yīng)采取的措施是：A.繼續(xù)檢測，觀察趨勢B.重新校準(zhǔn)儀器C.更換試劑批次D.停止檢測，查找失控原因答案：D（連續(xù)3次超出2SD屬于失控，需立即排查原因）19.逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）中，反轉(zhuǎn)錄的最佳溫度通常為：A.25℃B.37℃C.50℃D.72℃答案：C（多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄酶在50℃左右活性最佳，同時(shí)可減少RNA二級結(jié)構(gòu)影響）20.關(guān)于PCR實(shí)驗(yàn)室人員防護(hù)，錯誤的是：A.樣本處理區(qū)需佩戴N95口罩B.各區(qū)域工作服不得交叉使用C.接觸血液樣本時(shí)戴雙層手套D.擴(kuò)增區(qū)可僅佩戴一次性外科口罩答案：D（擴(kuò)增區(qū)可能存在氣溶膠，需佩戴N95或更高防護(hù)級別口罩）二、多項(xiàng)選擇題（每題3分，共30分，少選、錯選均不得分）1.臨床PCR實(shí)驗(yàn)室必須設(shè)置的功能區(qū)域包括：A.試劑準(zhǔn)備區(qū)B.樣本處理區(qū)C.擴(kuò)增區(qū)D.產(chǎn)物分析區(qū)答案：ABCD（根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》，四區(qū)為基本要求）2.導(dǎo)致PCR假陰性的可能原因有：A.樣本中存在抑制物B.引物降解C.擴(kuò)增循環(huán)數(shù)不足D.熱蓋溫度過高答案：ABC（熱蓋溫度過高主要導(dǎo)致蒸發(fā)，可能引起假陽性或結(jié)果波動）3.熒光定量PCR的定量方法包括：A.絕對定量B.相對定量C.終點(diǎn)定量D.內(nèi)標(biāo)定量答案：AB（實(shí)時(shí)熒光定量主要采用絕對定量和相對定量，終點(diǎn)定量不準(zhǔn)確）4.核酸提取質(zhì)量的評價(jià)指標(biāo)包括：A.濃度（OD260）B.純度（OD260/OD280）C.完整性（電泳條帶）D.擴(kuò)增效率（Ct值）答案：ABCD（需綜合濃度、純度、完整性及實(shí)際擴(kuò)增效果評估）5.實(shí)驗(yàn)室污染防控措施包括：A.各區(qū)嚴(yán)格單向氣流B.使用帶濾芯的移液器吸頭C.定期進(jìn)行環(huán)境核酸檢測D.樣本處理時(shí)戴護(hù)目鏡答案：ABCD（均為標(biāo)準(zhǔn)污染防控措施）6.以下關(guān)于PCR引物的描述，正確的是：A.長度通常為18-25個(gè)核苷酸B.G+C含量建議40%-60%C.3’端避免連續(xù)G/CD.引物間避免互補(bǔ)超過3個(gè)堿基答案：ABCD（均為引物設(shè)計(jì)基本原則）7.實(shí)時(shí)熒光PCR儀的校準(zhǔn)項(xiàng)目包括：A.溫度準(zhǔn)確性B.溫度均勻性C.熒光通道靈敏度D.加樣體積準(zhǔn)確性答案：ABC（加樣體積由移液器校準(zhǔn)，非儀器校準(zhǔn)項(xiàng)目）8.檢測腦脊液樣本時(shí)，需特別注意的事項(xiàng)有：A.避免反復(fù)凍融B.增加核酸提取體積C.減少離心速度防止細(xì)胞破裂D.添加RNA酶抑制劑（檢測RNA時(shí)）答案：ABD（腦脊液細(xì)胞含量低，需增加提取體積；RNA易降解需加抑制劑）9.以下哪些情況需要重新進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證？A.更換熒光PCR儀品牌B.試劑批號變更C.檢測靶標(biāo)基因變異D.實(shí)驗(yàn)室搬遷后答案：ACD（試劑批號變更需做批間比對，無需完整驗(yàn)證）10.實(shí)驗(yàn)室記錄應(yīng)包含的內(nèi)容有：A.檢測日期、操作人員B.儀器型號及校準(zhǔn)狀態(tài)C.試劑名稱、批號D.原始數(shù)據(jù)（如擴(kuò)增曲線）答案：ABCD（均為實(shí)驗(yàn)室記錄的基本要素）三、判斷題（每題1分，共10分，正確打√，錯誤打×）1.PCR實(shí)驗(yàn)室各區(qū)可共用清潔工具，只需分區(qū)存放。（×）（需專用清潔工具，避免交叉污染）2.陽性對照應(yīng)使用高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物，以確保檢測靈敏度。（×）（應(yīng)使用與臨床樣本濃度相近的陽性參考品）3.核酸提取時(shí)，75%乙醇洗滌的目的是去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)。（×）（主要去除鹽離子，蛋白質(zhì)已被蛋白酶K消化）4.實(shí)時(shí)熒光PCR中，基線期的熒光信號主要來自引物二聚體。（×）（基線期為背景熒光，引物二聚體出現(xiàn)在指數(shù)期后）5.檢測RNA時(shí)，實(shí)驗(yàn)臺面需用DEPC水擦拭以滅活RNA酶。（√）6.擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果中，目標(biāo)條帶比預(yù)期小，可能是引物結(jié)合位點(diǎn)突變。（√）（突變可能導(dǎo)致引物結(jié)合位置改變，產(chǎn)物長度變化）7.室內(nèi)質(zhì)控品應(yīng)與臨床樣本同時(shí)檢測，不可單獨(dú)檢測。（√）（需模擬實(shí)際檢測條件）8.熱啟動Taq酶的作用是防止PCR反應(yīng)前引物與模板非特異性結(jié)合。（√）9.熒光定量PCR的線性范圍是指檢測結(jié)果與模板濃度呈線性關(guān)系的濃度區(qū)間。（√）10.實(shí)驗(yàn)室發(fā)生樣本泄漏時(shí)，應(yīng)立即用紙巾擦拭后丟棄。（×）（需用含氯消毒劑覆蓋10分鐘后處理）四、簡答題（每題6分，共30分）1.簡述臨床PCR實(shí)驗(yàn)室“四區(qū)兩緩”的具體要求及意義。答案：“四區(qū)”指試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)；“兩緩”指樣本處理區(qū)與擴(kuò)增區(qū)之間的緩沖間，以及試劑準(zhǔn)備區(qū)與樣本處理區(qū)之間的緩沖間。要求：各區(qū)嚴(yán)格單向氣流（從清潔區(qū)到污染區(qū)），壓差梯度≥5Pa；物品、人員單向流動，不得逆向；緩沖間用于更換工作服、鞋套，減少交叉污染。意義：通過物理分隔和氣流控制，最大限度降低擴(kuò)增產(chǎn)物對前區(qū)的污染風(fēng)險(xiǎn)，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.列舉5種常見的PCR抑制物及其來源，并說明處理方法。答案：（1）血紅蛋白（來源：全血樣本），處理：增加核酸提取時(shí)的洗滌步驟，使用含去血紅蛋白的提取試劑；（2）肝素（來源：抗凝管），處理：使用肝素酶降解或選擇無肝素抗凝管；（3）膽鹽（來源：糞便、膽汁樣本），處理：稀釋樣本或使用柱膜法提?。唬?）尿素（來源：尿液樣本），處理：增加離心去除沉淀，或使用特異性吸附柱；（5）EDTA（來源：抗凝管），處理：控制提取時(shí)EDTA殘留量，或在反應(yīng)體系中增加Mg2+濃度。3.分析實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線“無Ct值”（直線型）的可能原因及解決措施。答案：可能原因：（1）模板核酸未成功提取（如提取試劑失效、操作失誤）；（2）引物/探針降解（保存不當(dāng)或過期）；（3）反應(yīng)體系配置錯誤（如漏加Taq酶、dNTP）；（4）儀器故障（溫度模塊異常、熒光檢測通道損壞）；（5）樣本中抑制物濃度過高（如全血未稀釋）。解決措施：（1）重新提取核酸，同時(shí)檢測內(nèi)參基因驗(yàn)證提取質(zhì)量；（2）更換新批次引物/探針，檢測陽性對照確認(rèn)；（3）核查反應(yīng)體系配制記錄，重新配制；（4）用校準(zhǔn)品檢測儀器溫度和熒光強(qiáng)度；（5）對樣本進(jìn)行稀釋或使用抑制物去除試劑盒。4.簡述PCR實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制的主要內(nèi)容及失控處理流程。答案：主要內(nèi)容：（1）陰性對照（無擴(kuò)增）；（2）陽性對照（Ct值在靶值±1SD內(nèi)）；（3）內(nèi)參基因（所有樣本均應(yīng)擴(kuò)增，Ct值在正常范圍）；（4）弱陽性質(zhì)控（驗(yàn)證檢測下限）。失控處理流程：（1）立即停止檢測，記錄失控現(xiàn)象；（2）排查原因（試劑、儀器、操作、環(huán)境）；（3）更換可疑試劑/校準(zhǔn)儀器后重新檢測質(zhì)控品；（4）若仍失控，啟動室間質(zhì)評或第三方檢測驗(yàn)證；（5）失控期間檢測的樣本需重新檢測；（6）記錄失控原因及處理過程，存檔備查。5.說明熒光定量PCR中“熔解曲線分析”的原理及臨床應(yīng)用價(jià)值。答案：原理：PCR擴(kuò)增結(jié)束后，對產(chǎn)物進(jìn)行緩慢升溫（通常55-95℃），同時(shí)監(jiān)測熒光信號。雙鏈DNA解鏈時(shí)，熒光染料（如SYBRGreen）脫離雙鏈導(dǎo)致熒光驟降，通過監(jiān)測熒光變化率（-dF/dT）可得到熔解曲線，峰位置對應(yīng)產(chǎn)物的熔解溫度（Tm值），與產(chǎn)物長度、GC含量相關(guān)。臨床應(yīng)用價(jià)值：（1）驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性（單一峰表示特異性擴(kuò)增）；（2）區(qū)分不同擴(kuò)增產(chǎn)物（如突變型與野生型因Tm值差異呈現(xiàn)不同峰）；（3）檢測引物二聚體（低Tm值的額外峰）；（4）輔助判斷擴(kuò)增失敗原因（如無峰提示無產(chǎn)物，多峰提示非特異性擴(kuò)增）。五、案例分析題（每題15分，共30分）案例1：某實(shí)驗(yàn)室開展HPV基因分型檢測，近期發(fā)現(xiàn)部分臨床樣本出現(xiàn)“假陽性”（即陰性樣本檢測為陽性），且陽性對照Ct值較之前明顯降低（擴(kuò)增效率提高）。問題：（1）分析可能的污染來源；（2）提出排查及處理措施。答案：（1）可能污染來源：①擴(kuò)增產(chǎn)物污染：產(chǎn)物分析區(qū)與前區(qū)氣流逆向，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物通過空氣擴(kuò)散至樣本處理區(qū)或試劑準(zhǔn)備區(qū)；②實(shí)驗(yàn)耗材污染：移液器吸頭、離心管未徹底滅活，殘留之前的擴(kuò)增產(chǎn)物；③人員操作污染：實(shí)驗(yàn)人員未嚴(yán)格分區(qū)換衣，將產(chǎn)物區(qū)工作服帶入前區(qū)；④儀器污染：擴(kuò)增儀密封不嚴(yán)，產(chǎn)物泄漏至內(nèi)部，或產(chǎn)物分析區(qū)電泳儀未定期清潔。（2）排查及處理措施：①環(huán)境核酸檢測：用棉簽擦拭各區(qū)臺面、儀器表面，提取核酸后進(jìn)行PCR檢測，定位污染區(qū)域；②耗材驗(yàn)證：隨機(jī)抽取未使用的吸頭、離心管，進(jìn)行空白PCR檢測，確認(rèn)是否含污染；③人員操作核查：檢查更衣記錄、移液器使用記錄，確認(rèn)是否存在跨區(qū)操作；④儀器維護(hù)：清潔擴(kuò)增儀內(nèi)部，更換密封墊，對電泳儀進(jìn)行次氯酸鈉浸泡；⑤污染清除：對污染區(qū)域用10%次氯酸鈉擦拭，過氧乙酸熏蒸4小時(shí)，紫外線照射過夜；⑥重新檢測質(zhì)控品：確認(rèn)污染清除后，用新批次試劑檢測陰/陽性對照，確保結(jié)果正常；⑦制定長期防控措施：增加環(huán)境監(jiān)測頻率（每周1次），使用帶濾芯吸頭，嚴(yán)格執(zhí)行“一人一區(qū)一服”制度。案例2：某實(shí)驗(yàn)室檢測COVID-19核酸時(shí)，發(fā)現(xiàn)某批次咽拭子樣本（共50份）的內(nèi)參基因（人RPP30基因）Ct值均＞35（正常范圍為25-30），但新型冠狀病毒N基因檢測均為陰性。問題：（1）分析內(nèi)參基因Ct值異常的可能原因；（2）說明此類樣本的處理原則。答案：（1）可能原因：①樣本采集質(zhì)量差：咽拭子未接觸到有效上皮細(xì)胞（如采樣過淺），導(dǎo)致人基因組DNA量少；②核酸提取效率低：提取試劑失效、磁珠量不足或洗滌步驟丟失核酸；③抑制物干擾：樣本中含大量黏液、血液等，抑制內(nèi)參基因擴(kuò)增；④反應(yīng)體系問題：內(nèi)參引物/探針濃度不足，或Taq酶活性下降；⑤儀器問題：擴(kuò)增