2025年P(guān)CR上崗證考試題及答案一、單選題1.PCR反應(yīng)中，引物的作用是（）A.提供模板B.激活Taq酶C.提供3’-OH末端，引導(dǎo)DNA合成D.穩(wěn)定反應(yīng)體系答案：C解析：引物是一小段單鏈DNA或RNA，它可以與模板DNA的特定區(qū)域互補配對，為DNA聚合酶提供3’-OH末端，引導(dǎo)DNA合成。模板是待擴增的DNA，而不是引物，A選項錯誤；Taq酶的激活不需要引物，B選項錯誤；引物的主要作用不是穩(wěn)定反應(yīng)體系，D選項錯誤。2.下列哪種物質(zhì)不是PCR反應(yīng)體系的組成成分（）A.dNTPB.引物C.核酸染料D.TaqDNA聚合酶答案：C解析：PCR反應(yīng)體系通常包括模板DNA、dNTP（脫氧核苷三磷酸）、引物、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。核酸染料是用于電泳后染色觀察PCR產(chǎn)物的，不是PCR反應(yīng)體系的組成成分，C選項符合題意。3.PCR反應(yīng)的變性溫度一般為（）A.55℃左右B.72℃左右C.94-95℃D.37℃左右答案：C解析：PCR反應(yīng)的變性步驟是使雙鏈DNA解旋為單鏈，需要較高的溫度，一般為94-95℃。55℃左右通常是退火溫度，72℃左右是延伸溫度，37℃一般不是PCR反應(yīng)的特征溫度，C選項正確。4.以下關(guān)于TaqDNA聚合酶的描述，錯誤的是（）A.具有5’-3’聚合酶活性B.具有3’-5’外切酶活性C.耐高溫D.可用于PCR反應(yīng)答案：B解析：TaqDNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性，能夠在引物的引導(dǎo)下合成新的DNA鏈，A選項正確；它耐高溫，適合PCR反應(yīng)中高溫變性的步驟，C選項正確；是PCR反應(yīng)常用的酶，D選項正確。但TaqDNA聚合酶不具有3’-5’外切酶活性，缺乏校對功能，B選項錯誤。5.在PCR實驗中，防止交叉污染的措施不包括（）A.不同操作區(qū)域分開B.嚴格遵守操作規(guī)程C.重復(fù)使用一次性耗材D.使用帶濾芯的槍頭答案：C解析：為防止PCR實驗中的交叉污染，應(yīng)將不同操作區(qū)域分開，如試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)、PCR擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)等，A選項屬于防止交叉污染的措施；嚴格遵守操作規(guī)程可以減少污染的機會，B選項正確；使用帶濾芯的槍頭可以防止氣溶膠污染，D選項正確。而重復(fù)使用一次性耗材會增加交叉污染的風(fēng)險，C選項不屬于防止交叉污染的措施。6.實時熒光定量PCR技術(shù)中，常用的熒光標記方法不包括（）A.SYBRGreenI熒光染料法B.TaqMan探針法C.MolecularBeacon探針法D.放射性標記法答案：D解析：實時熒光定量PCR技術(shù)中常用的熒光標記方法有SYBRGreenI熒光染料法、TaqMan探針法和MolecularBeacon探針法等。SYBRGreenI能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光，TaqMan探針和MolecularBeacon探針利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理進行檢測。而放射性標記法有放射性危害，且不用于實時熒光定量PCR，D選項符合題意。7.PCR反應(yīng)中，dNTP的作用是（）A.提供能量B.提供合成DNA的原料C.穩(wěn)定反應(yīng)體系D.激活引物答案：B解析：dNTP（脫氧核苷三磷酸）包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP，它們是合成DNA的原料，在DNA聚合酶的作用下，dNTP中的脫氧核苷酸依次連接形成新的DNA鏈。dNTP不是主要提供能量，A選項錯誤；其主要作用不是穩(wěn)定反應(yīng)體系，C選項錯誤；也不能激活引物，D選項錯誤。8.以下哪種因素不會影響PCR反應(yīng)的特異性（）A.引物的特異性B.退火溫度C.dNTP的濃度D.模板的純度答案：C解析：引物的特異性直接影響PCR反應(yīng)的特異性，如果引物與非靶序列結(jié)合，會導(dǎo)致非特異性擴增，A選項不符合題意；退火溫度不合適可能會使引物與模板的結(jié)合特異性降低，出現(xiàn)非特異性擴增，B選項不符合題意；模板的純度也會影響PCR反應(yīng)的特異性，雜質(zhì)可能會干擾引物與模板的結(jié)合或影響酶的活性，D選項不符合題意。dNTP的濃度主要影響PCR反應(yīng)的產(chǎn)量，而不是特異性，C選項符合題意。9.實時熒光定量PCR中，Ct值的含義是（）A.達到熒光閾值時的循環(huán)數(shù)B.熒光信號的強度C.反應(yīng)的終止循環(huán)數(shù)D.模板的起始濃度答案：A解析：在實時熒光定量PCR中，Ct值（Cyclethreshold）是指熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。它與模板的起始濃度呈負相關(guān)，可以用于定量分析。熒光信號的強度不是Ct值的含義，B選項錯誤；Ct值不是反應(yīng)的終止循環(huán)數(shù)，C選項錯誤；Ct值是用于推算模板起始濃度的指標，而不是模板的起始濃度本身，D選項錯誤。10.PCR實驗室的空氣凈化系統(tǒng)應(yīng)達到（）級潔凈度要求。A.百級B.千級C.萬級D.十萬級答案：C解析：PCR實驗室的空氣凈化系統(tǒng)一般應(yīng)達到萬級潔凈度要求，以減少空氣中的塵埃、微生物等對實驗的干擾。百級和千級潔凈度要求過高，成本也較高，一般不用于PCR實驗室，A、B選項錯誤；十萬級潔凈度可能不能滿足PCR實驗對環(huán)境的要求，D選項錯誤。二、多選題1.PCR反應(yīng)的基本步驟包括（）A.變性B.退火C.延伸D.終止答案：ABC解析：PCR反應(yīng)的基本步驟包括變性、退火和延伸。變性是使雙鏈DNA在高溫下解旋為單鏈；退火是引物與單鏈模板DNA互補配對；延伸是在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3’-OH末端開始合成新的DNA鏈。PCR反應(yīng)沒有終止這一基本步驟，D選項錯誤。2.以下屬于PCR實驗室分區(qū)的有（）A.試劑準備區(qū)B.樣本處理區(qū)C.PCR擴增區(qū)D.產(chǎn)物分析區(qū)答案：ABCD解析：PCR實驗室通常分為試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)、PCR擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)。試劑準備區(qū)用于準備PCR反應(yīng)所需的各種試劑；樣本處理區(qū)用于樣本的采集、處理和核酸提??；PCR擴增區(qū)進行PCR反應(yīng)；產(chǎn)物分析區(qū)對PCR產(chǎn)物進行檢測和分析。3.影響PCR反應(yīng)效率的因素有（）A.模板的質(zhì)量和濃度B.引物的設(shè)計和濃度C.TaqDNA聚合酶的活性D.反應(yīng)體系的pH值答案：ABCD解析：模板的質(zhì)量和濃度會影響PCR反應(yīng)的效率，如果模板質(zhì)量差或濃度過低，可能導(dǎo)致擴增失敗或效率低下，A選項正確；引物的設(shè)計和濃度不合適，如引物特異性不好或濃度過高、過低，都會影響擴增效率，B選項正確；TaqDNA聚合酶的活性直接關(guān)系到DNA合成的速度和質(zhì)量，活性降低會影響反應(yīng)效率，C選項正確；反應(yīng)體系的pH值會影響酶的活性和反應(yīng)的進行，不合適的pH值會降低反應(yīng)效率，D選項正確。4.實時熒光定量PCR的優(yōu)點有（）A.靈敏度高B.特異性強C.可進行定量分析D.無需電泳檢測答案：ABCD解析：實時熒光定量PCR具有靈敏度高的特點，能夠檢測到低濃度的模板；特異性強，通過引物和探針的設(shè)計可以準確擴增和檢測靶序列；可以根據(jù)Ct值對模板進行定量分析；并且在反應(yīng)過程中實時監(jiān)測熒光信號，無需電泳檢測，減少了操作步驟和污染的機會。5.防止PCR產(chǎn)物污染的方法有（）A.紫外線照射B.dUTP-UNG系統(tǒng)C.嚴格的實驗室管理D.及時清理實驗臺面答案：ABCD解析：紫外線照射可以破壞PCR產(chǎn)物的DNA結(jié)構(gòu)，減少污染的可能性，A選項正確；dUTP-UNG系統(tǒng)是在PCR反應(yīng)中用dUTP代替dTTP，UNG酶可以降解含dUTP的DNA，防止殘留的PCR產(chǎn)物污染新的反應(yīng)，B選項正確；嚴格的實驗室管理，如不同區(qū)域分開、人員培訓(xùn)等，可以有效防止產(chǎn)物污染，C選項正確；及時清理實驗臺面可以去除可能殘留的PCR產(chǎn)物，減少污染風(fēng)險，D選項正確。6.以下關(guān)于PCR引物設(shè)計的原則，正確的有（）A.引物長度一般為18-25個堿基B.引物的GC含量一般為40%-60%C.引物之間不應(yīng)形成互補序列D.引物的3’末端應(yīng)避免有連續(xù)的G或C答案：ABCD解析：引物長度一般為18-25個堿基，這樣可以保證引物與模板的特異性結(jié)合，同時也便于合成和退火，A選項正確；引物的GC含量一般為40%-60%，合適的GC含量有助于引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合，B選項正確；引物之間不應(yīng)形成互補序列，否則會形成引物二聚體，影響PCR反應(yīng)的效率，C選項正確；引物的3’末端應(yīng)避免有連續(xù)的G或C，因為連續(xù)的G或C可能會導(dǎo)致非特異性結(jié)合和錯配，D選項正確。7.PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用包括（）A.病原體檢測B.遺傳病診斷C.腫瘤的早期診斷D.親子鑒定答案：ABCD解析：PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。在病原體檢測方面，可以快速、靈敏地檢測各種病毒、細菌等病原體；在遺傳病診斷中，能夠檢測基因突變等異常；對于腫瘤的早期診斷，可檢測腫瘤相關(guān)基因的變化；在親子鑒定中，通過擴增和分析特定的基因片段來確定親子關(guān)系。8.以下哪些是PCR反應(yīng)中可能出現(xiàn)的問題（）A.非特異性擴增B.引物二聚體形成C.擴增效率低D.產(chǎn)物降解答案：ABCD解析：PCR反應(yīng)中可能出現(xiàn)非特異性擴增，即擴增出非靶序列；引物二聚體形成會消耗引物和dNTP，影響靶序列的擴增；擴增效率低可能是由于模板質(zhì)量、引物設(shè)計、酶活性等多種因素導(dǎo)致；產(chǎn)物降解可能是由于核酸酶的污染等原因引起。9.實時熒光定量PCR中，標準曲線的作用有（）A.確定樣本的Ct值B.定量分析樣本中模板的起始濃度C.評估PCR反應(yīng)的效率D.檢測樣本的純度答案：BC解析：標準曲線是通過一系列已知濃度的標準品進行實時熒光定量PCR得到的Ct值與模板濃度的關(guān)系曲線?？梢愿鶕?jù)樣本的Ct值，通過標準曲線定量分析樣本中模板的起始濃度，B選項正確；同時，標準曲線的斜率可以用于評估PCR反應(yīng)的效率，C選項正確。確定樣本的Ct值是實時熒光定量PCR過程中直接測量得到的，不是標準曲線的作用，A選項錯誤；標準曲線不能檢測樣本的純度，D選項錯誤。10.PCR實驗室的安全防護措施包括（）A.佩戴個人防護裝備B.正確處理廢棄物C.定期進行實驗室消毒D.對實驗人員進行培訓(xùn)答案：ABCD解析：PCR實驗室的安全防護措施包括佩戴個人防護裝備，如口罩、手套、實驗室工作服等，防止接觸有害物質(zhì)；正確處理廢棄物，避免污染環(huán)境和傳播病原體；定期進行實驗室消毒，減少微生物和核酸污染；對實驗人員進行培訓(xùn)，使其了解正確的操作方法和安全注意事項。三、判斷題1.PCR反應(yīng)中，模板DNA可以是雙鏈DNA，也可以是單鏈DNA。（）答案：√解析：PCR反應(yīng)中，模板DNA可以是雙鏈DNA，在變性步驟中雙鏈解旋為單鏈后進行擴增；也可以是單鏈DNA，直接作為模板進行擴增。2.實時熒光定量PCR只能進行相對定量分析，不能進行絕對定量分析。（）答案：×解析：實時熒光定量PCR既可以進行相對定量分析，通過比較不同樣本之間的基因表達差異；也可以進行絕對定量分析，通過制作標準曲線，根據(jù)樣本的Ct值計算出模板的起始絕對濃度。3.PCR實驗室的各個區(qū)域可以不設(shè)置緩沖間。（）答案：×解析：PCR實驗室的各個區(qū)域應(yīng)設(shè)置緩沖間，緩沖間可以起到隔離和緩沖的作用，減少不同區(qū)域之間的交叉污染。4.引物的濃度越高，PCR反應(yīng)的效率就越高。（）答案：×解析：引物濃度過高可能會導(dǎo)致引物二聚體的形成，消耗引物和dNTP，影響靶序列的擴增，還可能增加非特異性擴增的風(fēng)險，所以引物濃度并非越高越好。5.TaqDNA聚合酶在常溫下也具有較高的活性。（）答案：×解析：TaqDNA聚合酶是一種耐高溫的酶，在常溫下活性較低，其最適反應(yīng)溫度在72℃左右，在高溫（如94-95℃）下也能保持一定的穩(wěn)定性。6.實時熒光定量PCR中，SYBRGreenI熒光染料法比TaqMan探針法的特異性更強。（）答案：×解析：TaqMan探針法通過探針的特異性結(jié)合來檢測靶序列，特異性更強；而SYBRGreenI熒光染料法是與雙鏈DNA結(jié)合，只要有雙鏈DNA就會發(fā)出熒光，可能會出現(xiàn)非特異性擴增產(chǎn)物也被檢測到的情況，特異性相對較弱。7.PCR反應(yīng)中，延伸時間越長，擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量就越高。（）答案：×解析：延伸時間過長可能會導(dǎo)致非特異性擴增增加，并且在反應(yīng)后期，由于底物的消耗和酶活性的降低，過長的延伸時間并不能顯著增加擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量。延伸時間應(yīng)根據(jù)擴增片段的長度合理設(shè)置。8.防止PCR交叉污染的關(guān)鍵是嚴格遵守操作規(guī)程和保持實驗室的清潔。（）答案：√解析：嚴格遵守操作規(guī)程可以減少人為因素導(dǎo)致的交叉污染，如正確使用移液器、避免樣本和試劑的濺出等；保持實驗室的清潔，包括定期消毒、清理實驗臺面等，可以減少環(huán)境中的核酸污染，所以防止PCR交叉污染的關(guān)鍵是嚴格遵守操作規(guī)程和保持實驗室的清潔。9.PCR技術(shù)可以擴增任意長度的DNA片段。（）答案：×解析：PCR技術(shù)雖然可以擴增不同長度的DNA片段，但對于過長的DNA片段，擴增效率會降低，并且容易出現(xiàn)非特異性擴增等問題，一般擴增的DNA片段長度有一定的限制。10.實時熒光定量PCR實驗中，不需要設(shè)置陰性對照和陽性對照。（）答案：×解析：實時熒光定量PCR實驗中，需要設(shè)置陰性對照和陽性對照。陰性對照可以檢測是否存在污染，陽性對照可以驗證實驗體系的有效性和可靠性。四、填空題1.PCR反應(yīng)體系中，dNTP的全稱是____。答案：脫氧核苷三磷酸2.實時熒光定量PCR中，常用的熒光報告基團有____等。（寫出一種即可）答案：FAM3.PCR實驗室的四個分區(qū)應(yīng)按照____的方向進行設(shè)置。答案：試劑準備區(qū)→樣本處理區(qū)→PCR擴增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)4.引物設(shè)計時，應(yīng)避免在引物的____末端形成二級結(jié)構(gòu)。答案：3’5.TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度是____℃左右。答案：726.實時熒光定量PCR中，根據(jù)標準曲線計算樣本模板起始濃度的方法稱為____。答案：絕對定量法7.PCR反應(yīng)的變性步驟是使____解旋為單鏈。答案：雙鏈DNA8.防止PCR產(chǎn)物污染的dUTP-UNG系統(tǒng)中，UNG酶的作用是____。答案：降解含dUTP的DNA9.PCR技術(shù)的發(fā)明人是____。答案：穆里斯（KaryMullis）10.實時熒光定量PCR中，熒光閾值的設(shè)定一般是____。答案：基線期熒光信號標準差的10倍五、簡答題1.簡述PCR反應(yīng)的基本原理。(1).PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）是一種體外擴增特定DNA片段的技術(shù)。其基本原理是基于DNA的半保留復(fù)制機制。(2).反應(yīng)體系包括模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。(3).反應(yīng)過程分為變性、退火和延伸三個基本步驟：變性：將反應(yīng)體系加熱至94-95℃，使雙鏈DNA解旋為單鏈，為引物與模板的結(jié)合提供條件。退火：將溫度降低至引物的退火溫度（一般55℃左右），引物與單鏈模板DNA互補配對結(jié)合。延伸：將溫度升高至72℃左右，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3’-OH末端開始，按照堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。(4).重復(fù)上述變性、退火和延伸的循環(huán)過程，DNA片段以指數(shù)形式擴增。2.說明實時熒光定量PCR技術(shù)的原理和應(yīng)用。原理：實時熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)物的擴增情況。常用的熒光標記方法有SYBRGreenI熒光染料法和TaqMan探針法等。SYBRGreenI能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光，隨著PCR產(chǎn)物的增加，熒光信號強度也隨之增強；TaqMan探針法是利用探針上的熒光報告基團和淬滅基團之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，當(dāng)探針與靶序列結(jié)合并被Taq酶切割后，熒光報告基團與淬滅基團分離，發(fā)出熒光信號。通過檢測熒光信號達到設(shè)定閾值時的循環(huán)數(shù)（Ct值），可以對模板進行定量分析。應(yīng)用：病原體檢測：可以快速、靈敏地檢測各種病毒、細菌等病原體，如新冠病毒的檢測?；虮磉_分析：定量檢測不同組織或細胞中基因的表達水平，研究基因的功能和調(diào)控機制。遺傳病診斷：檢測基因突變、基因缺失等異常，用于遺傳病的診斷和產(chǎn)前診斷。腫瘤研究：檢測腫瘤相關(guān)基因的表達變化和基因突變，用于腫瘤的早期診斷、預(yù)后評估和治療監(jiān)測。3.分析PCR反應(yīng)中出現(xiàn)非特異性擴增的原因及解決方法。原因：引物特異性不好：引物與非靶序列有一定的互補性，導(dǎo)致非特異性結(jié)合和擴增。退火溫度不合適：退火溫度過低，引物與模板的結(jié)合特異性降低，容易與非靶序列結(jié)合。模板質(zhì)量問題：模板中含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物，可能會影響引物與模板的結(jié)合，導(dǎo)致非特異性擴增。酶濃度過高：過高的酶濃度可能會增加非特異性擴增的機會。循環(huán)次數(shù)過多：過多的循環(huán)次數(shù)會增加非特異性產(chǎn)物的積累。解決方法：重新設(shè)計引物：確保引物的特異性，避免與非靶序列互補。優(yōu)化退火溫度：通過梯度PCR實驗確定合適的退火溫度，提高引物與模板結(jié)合的特異性。提高模板質(zhì)量：對模板進行純化，去除雜質(zhì)和降解產(chǎn)物。調(diào)整酶濃度：適當(dāng)降低酶的濃度，減少非特異性擴增。減少循環(huán)次數(shù)：根據(jù)模板的濃度和擴增要求，合理設(shè)置循環(huán)次數(shù)。4.闡述PCR實驗室的分區(qū)設(shè)置及各分區(qū)的功能。試劑準備區(qū)：功能：主要用于準備PCR反應(yīng)所需的各種試劑，如引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、緩沖液等。該區(qū)域應(yīng)保持清潔，避免受到樣本和擴增產(chǎn)物的污染。要求：配備專用的移液器、冰箱、天平、混勻器等設(shè)備，實驗人員應(yīng)穿戴專用的工作服和手套。樣本處理區(qū)：功能：進行樣本的采集、處理和核酸提取。樣本可能含有各種病原體和核酸，該區(qū)域容易產(chǎn)生氣溶膠污染。要求：配