ICS11.220

B41

DB22

吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB22/T3172.3—2020

流感病毒HA和NA基因熒光RT-PCR檢測(cè)

第3部分：H3N8亞型馬流感病毒

Real-timeRT-PCRdetectiononHAandNAgenesofinfluenzavirus

Part3：H3N8subtypeequineinfluenzavirus

2020-10-14發(fā)布2020-10-30實(shí)施

吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)布

DB22/T3172.3—2020

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。

DB22/T3172《流感病毒HA和NA基因檢測(cè)熒光RT-PCR法》分為四個(gè)部分。

——第1部分：H7N9亞型禽流感病毒；

——第2部分：H7N4亞型禽流感病毒；

——第3部分：H3N8亞型馬流感病毒；

——第4部分：H7N7亞型馬流感病毒。

本部分為DB22/T3172的第3部分。

本部分由長(zhǎng)春海關(guān)提出并歸口。

本部分起草單位：長(zhǎng)春海關(guān)技術(shù)中心。

本部分主要起草人：王偉利、王準(zhǔn)、王瑋琳、姚貴哲、劉金華、肖芳、李玥、馬文晨、楊帆、蔡陽(yáng)、

馬玲。

I

DB22/T3172.3—2020

流感病毒HA和NA基因熒光RT-PCR檢測(cè)

第3部分：H3N8亞型馬流感病毒

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了H3N8亞型馬流感病毒HA和NA基因熒光RT-PCR檢測(cè)方法的原理、試驗(yàn)條件、試劑與材料、

儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟和試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及試驗(yàn)報(bào)告。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于H3N8亞型馬流感病毒檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫

3縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件

Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到的設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Cyclethreshold）

DEPC：焦磷酸乙二酯（Diethypyrocarbonate）

HA：血凝素（Hemagglutinin）

NA：神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase）

RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）

RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reversetranscription-polymerasechainreaction）

Taq酶：Taq脫氧核糖核酸聚合酶（ThermusaquaticusDNApolymerase）

4原理

根據(jù)H3N8亞型馬流感病毒HA基因和NA基因序列設(shè)計(jì)特異引物和探針，探針結(jié)合部位在擴(kuò)增片段內(nèi)

部。HA基因和NA基因探針?lè)謩e在5’端標(biāo)記FAM和CY3熒光素作為報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端分別標(biāo)記MGB和BHQ1

作為淬滅熒光基團(tuán)。反應(yīng)進(jìn)入退火階段時(shí)，引物和探針同時(shí)與目的基因片段結(jié)合，此時(shí)探針上熒光基團(tuán)

發(fā)出的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào)；而反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq酶發(fā)揮

5’→3’的外切核酸酶功能，將探針降解，探針上的熒光基團(tuán)游離出來(lái)，所發(fā)出的熒光不再為淬滅基團(tuán)所

吸收而被檢測(cè)儀所接收。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)往復(fù)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)形式增長(zhǎng)，熒光信號(hào)也相應(yīng)增長(zhǎng)。據(jù)

此熒光PCR儀可實(shí)現(xiàn)對(duì)HA基因和NA基因的同步實(shí)時(shí)檢測(cè)。

5試驗(yàn)條件

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DB22/T3172.3—2020

5.1生物安全措施

所有培養(yǎng)物和廢棄物的處置應(yīng)按照GB19489中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

5.2防污染措施

防止污染措施應(yīng)符合GB/T27401的規(guī)定。

6試劑與材料

6.1試劑

6.1.1陰性對(duì)照：可采用經(jīng)滅活的不含馬流感病毒的雞胚尿囊液。

6.1.2陽(yáng)性對(duì)照：非感染性體外轉(zhuǎn)錄RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6.1.32×RT-PCRBuffer。

6.1.4RTEnzymeMix。

6.1.5Taq酶。

6.1.6DEPC水：0.1%DEPC處理后的去離子水。

6.1.7引物與探針：見(jiàn)表1。

表1H3N8亞型馬流感病毒HA基因和NA基因引物和探針

引物F15’–TGGATTTCATTTGCCATATCAT–3’

HA基因引物R15’–GCAAATGTTGCATCTAATRTTG–3’

探針P1FAM–TGGCAGGCCCACAT–MGB

引物F25’–CTCCAAGAGGGGAAGATGCT–3’

NA基因引物R25’–CTGACCTGGAGGTTCGACTA–3’

探針P2CY3–CGCCCCACCCACACATCAGTTCCCTGT–BHQ1

6.2材料

6.2.1離心管（1.5mL、0.2mL）。

6.2.2熒光PCR反應(yīng)管（0.1mL、0.2mL）。

7儀器設(shè)備

7.1生物安全柜。

7.2高速冷凍離心機(jī)（13000r/min）。

7.3微量可調(diào)移液器(2.5μL、10μL、100μL、1000μL)。

7.4超低溫冰箱（-80℃）。

7.5熒光定量PCR儀（至少包含F(xiàn)AM和VIC通道）。

7.6旋渦振蕩器。

7.7高壓滅菌器。

8樣品

2

DB22/T3172.3—2020

8.1采集

將拭子經(jīng)前側(cè)鼻道伸入鼻腔深部蘸取呼吸道黏液，取出后立即放入盛有2.0mLPBS液（含有青霉素

和鏈霉素）的采樣管中，編號(hào)。

8.2運(yùn)輸與儲(chǔ)存

鼻拭子樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h；若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱中，但應(yīng)避

免反復(fù)凍融。

9試驗(yàn)步驟

9.1核酸提取

采用市售RNA提取試劑盒或自動(dòng)化核酸提取儀及配套核酸提取試劑進(jìn)行提取。

9.2熒光RT-PCR檢測(cè)

9.2.1反應(yīng)體系

在PCR溶液配制區(qū)，反應(yīng)體系配制見(jiàn)表2與表3，每份檢測(cè)樣品的熒光RT-PCR體系為25μL。用旋渦

振蕩器進(jìn)行混勻，瞬間離心后置熒光PCR儀擴(kuò)增。

表2H3N8亞型馬流感病毒HA基因熒光RT-PCR反應(yīng)體系

成分用量

μL

2×RT-PCRBuffer（6.1.3）12.5

RTEnzymeMix5U/μL（6.1.4）0.5

Taq酶5U/μL（6.1.5）0.5

F110μmol/L（6.1.7）1.0

R110μmol/L（6.1.7）1.0

P115μmol/L（6.1.7）1.0

模板RNA5.0

DEPC水（6.1.6）3.5

總計(jì)25

表3H3N8亞型馬流感病毒NA基因熒光RT-PCR反應(yīng)體系

成分用量

μL

2×RT-PCRBuffer（6.1.3）12.5

RTEnzymeMix5U/μL（6.1.4）0.5

Taq酶5U/μL（6.1.5）0.5

F210μmol/L（6.1.7）1.0

R210μmol/L（6.1.7）1.0

P215μmol/L（6.1.7）1.0

模板RNA5.0

DEPC水（6.1.6）3.5

總計(jì)25

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DB22/T3172.3—2020

9.2.2反應(yīng)參數(shù)

9.2.2.1第1階段，反轉(zhuǎn)錄45℃30min。

9.2.2.2第2階段，預(yù)變性92℃3min。

9.2.2.3第3階段，92℃15s，53℃20s，60℃30s（在此收集熒光），40個(gè)循環(huán)。

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