ICSCCS50重慶市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB50/T1722—2024前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14一般要求 1 26微量全血培養(yǎng) 37細(xì)胞收獲 3 49結(jié)果評(píng)價(jià) 510自動(dòng)化劑量效應(yīng)曲線的建立 5附錄A（資料性）轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞鑒別要點(diǎn) 8附錄B（資料性）淋巴細(xì)胞微核檢測(cè)原始記錄 9附錄C（資料性）淋巴細(xì)胞微核檢測(cè)報(bào)告單 附錄D（資料性）微核劑量估算驗(yàn)證示例 DB50/T1722—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由重慶市疾病預(yù)防控制中心提出。本文件由重慶市衛(wèi)生健康委員會(huì)歸口并組織實(shí)施。本文件起草單位：重慶市疾病預(yù)防控制中心。本文件主要起草人：吳夢(mèng)云、譚秀洪、張華東、李煒、袁方、趙奇、金楠、胡彬、杜全洪、謝悅峰、楊濤、周景華、李奎、金京、徐思垚。DB50/T1722—20241人外周血淋巴細(xì)胞微核檢測(cè)自動(dòng)分析與劑量估算技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了人外周血淋巴細(xì)胞微核自動(dòng)分析與劑量估算的一般要求、實(shí)驗(yàn)室、微量全血培養(yǎng)、細(xì)胞收獲、微核分析、結(jié)果評(píng)價(jià)以及自動(dòng)化劑量效應(yīng)曲線的建立。本文件適用于放射工作人員微核檢測(cè)和一次較均勻全身核與輻射事故劑量估算。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GBZ2.1—2019工作場(chǎng)所有害因素職業(yè)接觸限值第1部分：化學(xué)有害因素GBZ/T248—2014放射工作人員職業(yè)健康檢查外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變檢測(cè)與評(píng)價(jià)GBZ/T328—2023放射工作人員職業(yè)健康檢查外周血淋巴細(xì)胞微核檢測(cè)方法與受照劑量估算標(biāo)準(zhǔn)3術(shù)語(yǔ)和定義GBZ/T328—2023界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1自動(dòng)化分析automatedanalysis利用各種技術(shù)手段，通過(guò)自動(dòng)檢測(cè)、信息處理、分析判斷、操縱控制，使機(jī)器、設(shè)備等按照預(yù)定的規(guī)律自動(dòng)運(yùn)行，實(shí)現(xiàn)預(yù)期的目標(biāo)，或生產(chǎn)過(guò)程、管理過(guò)程、設(shè)計(jì)過(guò)程等高效自動(dòng)地完成。3.2微核micronucleus由于基因組DNA損傷導(dǎo)致細(xì)胞分裂后期滯后的染色體斷片、一個(gè)或多個(gè)染色體不能隨有絲分裂進(jìn)入子細(xì)胞，而在細(xì)胞質(zhì)中形成完全與主核分開的圓形或橢圓形小核。[來(lái)源：GBZ/T328—2023，3.2，有修改]3.3淋巴細(xì)胞微核率lymphocytemicronucleusrate觀察1000個(gè)轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞所見(jiàn)的微核總數(shù)。3.4微核淋巴細(xì)胞率micronucleuslymphocyterate觀察1000個(gè)轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞所見(jiàn)的含微核的細(xì)胞數(shù)。4一般要求4.1.1儀器必須包含微核分析軟件和顯微鏡硬件。DB50/T1722—202424.1.2在明場(chǎng)環(huán)境下可自動(dòng)查找轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞并定位。4.1.3通過(guò)自動(dòng)化分析軟件識(shí)別淋巴細(xì)胞中的微核，記錄對(duì)應(yīng)坐標(biāo)。4.1.4自動(dòng)化分析軟件可統(tǒng)計(jì)樣本轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞微核率和微核淋巴細(xì)胞率。4.1.5可增加端口，擴(kuò)展多個(gè)系統(tǒng)工作站，同時(shí)操作，數(shù)據(jù)共享。4.2技術(shù)人員要求4.2.1一般要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有兩名及以上專業(yè)技術(shù)人員，專業(yè)技術(shù)人員能熟練操作各項(xiàng)設(shè)備，能制片、復(fù)核軟件分析結(jié)果以及鏡下識(shí)別正常和異常淋巴細(xì)胞，及時(shí)完成檢測(cè)任務(wù)。4.2.2人員培訓(xùn)計(jì)劃4.2.2.1上崗前技術(shù)人員應(yīng)接受專業(yè)的理論知識(shí)和技能培訓(xùn)，并保留培訓(xùn)記錄。4.2.2.2在崗期間，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)每年組織技術(shù)人員進(jìn)行專業(yè)知識(shí)學(xué)習(xí)。技術(shù)人員應(yīng)掌握實(shí)驗(yàn)室基本管理?xiàng)l例和生物安全知識(shí)，熟悉相關(guān)法律、法規(guī)、國(guó)家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，熟悉電離輻射生物效應(yīng)的基礎(chǔ)知識(shí)、放射工作人員健康檢查內(nèi)容等。4.2.2.3有條件的實(shí)驗(yàn)室可外派技術(shù)人員參加專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)。4.2.3人員質(zhì)量控制4.2.3.1實(shí)驗(yàn)室每年制定技術(shù)人員內(nèi)部質(zhì)量控制計(jì)劃，至少包括微核實(shí)驗(yàn)考核且合格。4.2.3.2技術(shù)人員實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)完成原始記錄，及時(shí)上傳檢測(cè)結(jié)果，保證報(bào)告時(shí)效性。5實(shí)驗(yàn)室5.1.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)擁有足夠的空間，可供實(shí)驗(yàn)操作、分析數(shù)據(jù)、保存數(shù)據(jù)和樣本等。5.1.2細(xì)胞培養(yǎng)間應(yīng)配置生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、-20℃冰箱、4℃冰箱、移液器等。5.1.3人工細(xì)胞收獲間應(yīng)配置排風(fēng)裝置、水平離心機(jī)、移液器、純水儀、水浴鍋、滅菌鍋，選配渦旋振蕩器、分析天平、吹風(fēng)機(jī)等設(shè)備。5.1.4顯微鏡室應(yīng)配置微核自動(dòng)化分析設(shè)備和普通光學(xué)正置顯微鏡。5.1.5實(shí)驗(yàn)室宜選配自動(dòng)接種儀、自動(dòng)收獲儀、自動(dòng)滴片儀、自動(dòng)染片機(jī)等。5.2管理要求5.2.1實(shí)驗(yàn)室主要儀器和設(shè)備應(yīng)建立檔案，并有標(biāo)準(zhǔn)操作程序和使用及維護(hù)保養(yǎng)記錄。5.2.2設(shè)備應(yīng)定期檢定或校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室根據(jù)檢定或校準(zhǔn)結(jié)果出具驗(yàn)證報(bào)告，評(píng)估設(shè)備是否符合實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求。5.2.3設(shè)備儲(chǔ)存數(shù)據(jù)須定期導(dǎo)出并保存。5.2.4實(shí)驗(yàn)室備案實(shí)驗(yàn)儀器使用狀況，如正常、停止或報(bào)廢，備份實(shí)驗(yàn)相關(guān)設(shè)備說(shuō)明書，留存現(xiàn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。5.3試劑要求5.3.1應(yīng)按照GBZ/T248—2014中C3.1～C3.7的規(guī)定和要求配制試劑。5.3.2細(xì)胞松胞素B儲(chǔ)存：用2.5mL二甲基亞砜溶解5mg細(xì)胞松胞素B粉末配置成母液，-20℃避DB50/T1722—20243光保存。4.5mL生理鹽水加入0.5mL母液配置成工作液。取160μL工作液加入5mL培養(yǎng)體系，保證試劑終濃度為6μg/mL。液體配置、保存和加入培養(yǎng)體系均需避光。5.3.3細(xì)胞培養(yǎng)基可購(gòu)買商業(yè)成品。更換試劑廠商和批次，須進(jìn)行驗(yàn)收實(shí)驗(yàn)，并留存驗(yàn)收實(shí)驗(yàn)記錄。5.3.4低滲液配制，可取50mL的3mol/L氯化鉀飽和液加蒸餾水稀釋成2L，配制成0.075mol/L的低滲液，常溫保存?zhèn)溆谩２豢煞磸?fù)加熱使用。5.3.5染液可買成品試劑，并按說(shuō)明書要求配置和使用。試劑在有效期內(nèi)使用。6微量全血培養(yǎng)靜脈血的采集應(yīng)在所有放射性檢查前進(jìn)行，采集肘靜脈血約2mL，肝素抗凝，顛倒混勻。抗凝血應(yīng)室溫運(yùn)輸并及時(shí)進(jìn)行接種培養(yǎng)。不能立即進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可將抗凝血保存于4℃條件中，但最遲接種時(shí)間不超過(guò)72h。6.2樣本培養(yǎng)步驟6.2.1應(yīng)按照GBZ/T328—2023中4.3.1所規(guī)定的步驟培養(yǎng)樣本。6.2.2細(xì)胞培養(yǎng)可選用以下方法：a)常規(guī)培養(yǎng)微核法。應(yīng)按照淋巴細(xì)胞處于第一次有絲分裂期的培養(yǎng)時(shí)間要求，斜面靜置培養(yǎng)68h～72h收獲細(xì)胞；b)胞質(zhì)分裂阻斷微核法。應(yīng)按照抑制細(xì)胞紡錘絲形成的培養(yǎng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)要求，在培養(yǎng)40h～44h時(shí)加入細(xì)胞松胞素B工作液,繼續(xù)培養(yǎng)至64h～68h收獲。7細(xì)胞收獲7.1細(xì)胞收獲步驟應(yīng)按照GBZ/T328—2023中5.1和5.2所規(guī)定的步驟收獲細(xì)胞。7.2低滲和固定7.2.1操作人員應(yīng)穿工作服、佩戴防毒口罩和外科手套，在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，所有操作必須在符合GBZ2.1—2019要求的場(chǎng)所內(nèi)進(jìn)行。7.2.2可選用微核自動(dòng)收獲儀制備樣品，設(shè)備須放在符合GBZ2.1—2019要求的場(chǎng)所內(nèi)。7.2.3廢棄培養(yǎng)液和固定液須專門回收處理，并保留廢液交接記錄。7.3滴片7.3.1直接滴于傾斜玻片的不同位置上，使其自然鋪展均勻。載玻片需清潔、干燥，避免手指觸摸破片表面，以免沾上油脂。7.3.2滴片應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)人員避免誤吸有毒有害氣體。滴片也可選用滴片儀自動(dòng)操作。7.3.3所有操作必須在符合GBZ2.1—2019要求的場(chǎng)所內(nèi)進(jìn)行。7,4染色7.4.1玻片在室溫下晾干或直接吹風(fēng)機(jī)吹干。染液現(xiàn)配現(xiàn)用。7.4.2技術(shù)人員應(yīng)該穿工作服、佩戴防毒口罩和外科手套，也可選用自動(dòng)染色機(jī)染色。不可徒手觸摸DB50/T1722—20244染液和玻片。7.4.3廢棄染液須專門回收處理，并保留廢液交接記錄。7.5制片質(zhì)量轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞，胞質(zhì)較豐富。背景干凈，細(xì)胞清晰辨認(rèn)，見(jiàn)圖1。圖1微核檢測(cè)制片示例8自動(dòng)化微核分析8.1識(shí)別雙核細(xì)胞的要求8.1.1胞質(zhì)分裂阻斷微核法中，兩個(gè)獨(dú)立的核位于一個(gè)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、互相不連接，如果有一個(gè)或多個(gè)核質(zhì)橋連接，橋不寬于主核的1/4。8.1.2兩個(gè)核的大小接近，色度深淺相同。8.1.3兩個(gè)核不重疊，如果重疊必須能識(shí)別各自的界限。8.1.4一個(gè)雙核細(xì)胞胞質(zhì)與鄰近細(xì)胞的胞質(zhì)界限清楚。8.1.5細(xì)胞胞質(zhì)完整。8.2識(shí)別轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的要求常規(guī)培養(yǎng)法中，自動(dòng)分析軟件可識(shí)別轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞。轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞鑒別要點(diǎn)見(jiàn)附錄A。8.3識(shí)別微核的要求8.3.1微核應(yīng)存在于胞質(zhì)中，與主核結(jié)構(gòu)相似，但與主核不重疊、不相切，如果有相切必須能鑒別各8.3.2微核直徑介于主核直徑的1/3～1/16。8.3.3微核的形狀呈圓形或橢圓形，邊緣整齊。8.3.4微核不折光，染色的深淺與主核一致或稍淺，偶爾比主核略深。8.4掃描部位的要求自動(dòng)顯微鏡從玻片頭和體交界處迂回向體部掃描并計(jì)數(shù)。8.5微核的表示要求使用淋巴細(xì)胞微核率(‰)和微核淋巴細(xì)胞率(‰)報(bào)告結(jié)果，正常情況下兩者結(jié)果差異不大，但隨著受照劑量的升高兩者的均值差異越大。DB50/T1722—202458.6計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目要求選取細(xì)胞胞體較大、胞質(zhì)豐富且胞膜完整的細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)受檢個(gè)體，常規(guī)培養(yǎng)法至少計(jì)數(shù)1000個(gè)轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞，胞質(zhì)分裂阻斷微核法至少計(jì)數(shù)1000個(gè)雙核細(xì)胞。9結(jié)果評(píng)價(jià)常規(guī)培養(yǎng)微核法外周血淋巴細(xì)胞自發(fā)微核率正常為0‰～6‰，大于6‰為異常；胞質(zhì)分裂阻斷微核法的外周血淋巴細(xì)胞自發(fā)微核率正常為0‰～30‰，大于30‰為異常。9.2結(jié)果評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果異常的受檢者，排除非放射性影響因素（化學(xué)因素、年齡因素等其他因素應(yīng)在3個(gè)月~6個(gè)月內(nèi)復(fù)查微核和染色體畸變。復(fù)查結(jié)果出具之后，按復(fù)查結(jié)論及建議執(zhí)行。對(duì)每位受檢者應(yīng)出具外周血淋巴細(xì)胞微核率檢測(cè)報(bào)告單。檢測(cè)原始記錄（見(jiàn)附錄B）等其他原始記錄應(yīng)歸檔并建立電子檔案。9.4原始記錄和報(bào)告的制定9.4.1自動(dòng)化分析系統(tǒng)可自動(dòng)導(dǎo)出原始記錄、圖片和檢測(cè)報(bào)告等。9.4.2原始記錄表格可參見(jiàn)附錄B。原始記錄采取雙人簽字。9.4.3報(bào)告可提供異?；蛘５臋z測(cè)圖片，格式見(jiàn)附錄C，報(bào)告至少雙人簽字。9.4.4檢測(cè)結(jié)束之日起30日內(nèi)出具報(bào)告。9.5玻片、自動(dòng)分析圖片、原始記錄、報(bào)告的保存9.5.1有玻片、紙質(zhì)原始記錄、紙質(zhì)報(bào)告的固定存放地點(diǎn)。9.5.2有專門的電子路徑存放自動(dòng)分析圖片、電子原始記錄和報(bào)告。9.5.3玻片存放至少2年，紙質(zhì)或電子原始記錄、報(bào)告和圖片等文件終生保存。10自動(dòng)化劑量效應(yīng)曲線的建立10.1照射條件、培養(yǎng)和收獲方法10.1.1照射條件選擇標(biāo)準(zhǔn)輻照?qǐng)鲞M(jìn)行均勻照射。一般實(shí)驗(yàn)室首選低傳能線密度（低LET）的γ射線或X射線，劑量率接近1.0Gy/min，估算范圍在0.1Gy～5.0Gy之間,劑量點(diǎn)一般選擇0Gy、0.25Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy、3.0Gy、4.0Gy、5.0Gy。有條件的實(shí)驗(yàn)室可建立不同輻射類型和劑量率的效應(yīng)曲線。10.1.2樣本選擇與照射選擇2名～4名健康成年人，無(wú)過(guò)量受照史，不抽煙、不嗜酒，半年內(nèi)無(wú)急慢性疾病、無(wú)射線和化學(xué)毒物接觸史，近一個(gè)月內(nèi)無(wú)病毒感染史。用肝素抗凝管抽靜脈血6mL～8mL，離體均勻受照，受照后在（37±0.5）℃條件下修復(fù)2h，然后取出血樣將血按0.5mL每5mL培養(yǎng)液離心管加樣。DB50/T1722—2024610.1.3培養(yǎng)和收獲劑量-效應(yīng)曲線的細(xì)胞培養(yǎng)選擇胞質(zhì)分裂阻斷微核法。培養(yǎng)、收獲應(yīng)按照GBZ/T328—2023第9章9.2所規(guī)定的步驟。10.2計(jì)數(shù)分析按公式（1）計(jì)算各劑量點(diǎn)應(yīng)分析的細(xì)胞數(shù)?！璶——應(yīng)分析的細(xì)胞數(shù)；p——微核淋巴細(xì)胞率，可在計(jì)數(shù)分析一定數(shù)量的細(xì)胞后求得。10.3劑量-效應(yīng)曲線的擬合在低LET輻射時(shí)，微核與受照射劑量之間的劑量效應(yīng)關(guān)系符合二次多項(xiàng)式，可選擇CABAS軟件按公式（2）進(jìn)行擬合。y=a+bD+CD2…………（2）b——回歸系數(shù)；D——吸收劑量，單位為戈瑞（Gy）；10.4生物劑量估算生物劑量估算樣本的制備和自動(dòng)掃描分析應(yīng)與建立劑量效應(yīng)曲線的方法相同。估算樣本微核率及其95%可信區(qū)間分別按照式（3）、（4）和（5）計(jì)算:p=×1000‰ (4)CI=p±1.96SP…………（5）p——雙核微核率；CI——95%可信區(qū)間。將雙核微核率及95%可信區(qū)間的上下限代入建立的劑量效應(yīng)曲線，估算出受照劑量。微核自動(dòng)化劑量估算驗(yàn)證示例見(jiàn)附錄D。DB50/T1722—2024710.5質(zhì)量控制10.5.1事故后24h到一周之內(nèi)取血，最遲不超過(guò)30d。10.5.2對(duì)估算劑量的個(gè)體，至少應(yīng)自動(dòng)掃描分析500個(gè)以上的雙核淋巴細(xì)胞。如數(shù)量不夠，需全片自動(dòng)計(jì)數(shù)所有雙核淋巴細(xì)胞。10.5.3應(yīng)選擇和放射事故條件接近的劑量效應(yīng)曲線進(jìn)行劑量估算，在曲線估算范圍內(nèi)0.25Gy～5.0Gy應(yīng)用，不得外推。10.5.4估算劑量時(shí)，除給出平均值以外，同時(shí)給出劑量范圍的95%可信區(qū)間。DB50/T1722—20248轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞鑒別要點(diǎn)轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞鑒別要點(diǎn)見(jiàn)表A.1。表A.1轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞鑒別要點(diǎn)細(xì)胞大小(μ)無(wú)無(wú)無(wú)9DB50/T17