2010年版中國藥典品種鹽酸多西環(huán)素及其制劑HPLC法的建立CF在新系統(tǒng)中能與相鄰峰完全分離。代表性樣品乙酰-2-脫碳酰胺多西環(huán)素)溶液(99%)LC-ESI-IP-MS2F0.95、1.29、0.770.07～122.556μg/ml范圍內(nèi)線性良好（r=1.0），0.0160.063μg/ml，多西環(huán)素及已知雜質(zhì)的檢測精密度良好，片劑和膠囊的回收率分別為99.2%(n=9)、0.2%）0.01mol/L24小時。微調(diào)該色譜條件，可用于土霉素、四環(huán)素、金霉素、JPⅩⅤ2010年版中國藥典采用。2010TheEstablishmentofChromatographicAnalysisMethodofDoxycyclineHyclateandItsPreparationsforPharmacopoeiaofthePeople’sRepublicofChina2010YuanYao-zuo1,ZhangMei1，QianWen1，YangZhi-ming2andZhao(1.JiangsuInstitutefordrugcontrol,Nanjing210008;2.ChangzhouPharmaceuticalfactoryChangzhouAbstractObjectivesToestablishabetterchromatographicanalysismethodofdoxycyclinehyclateanditspreparationsforPharmacopoeiaofthePeople’sRepublicofChina2010.MethodsCarryoutthemethodforhighperformanceliquidchromatogram,usingacolumnpackedwithoctadecysilanebondedsilicagelandamixtureofabuffersolutionwhichconsistof100volumesof0.25mol/Lammoniumacetatesolution,10volumesof0.1mol/Lethyldiaminetetraaceticaciddisodiumsaltsolutionand1volumeoftriethyamineadjustingpHto8.8withglacialaceticacid–acetonitrile(85:15)asthemobilephase,maintainthecolumntemeratureat35℃,detectionwavelengthis280nm,flowrateis1mL·min-1,injectionvolumeis20μl.ResultsThechromaotograhicmobilephaseofdoxycyclinehyclateanditspreparationsusedinCP2005waschangedcompletely,substitutingammoniumacetateforammoniumoxalateasbuffersalttoavoidthetunnelblockofchromatographicsystem,substitutingacetonitrilefordimethylformamideandtetrahydrofuran,theadjustmentofpHvalueofmobilephaseimprovestheseparationability,theadditionoftriethyamineandethyldiaminetetraaceticaciddisodiumimprovesthesymmetryofpeaks.ImpurityCandimpurityFwhichcan’tbeseparatedeffectivelywiththeirneighboringcomponentsinCP2005chromatographicsystemcanbeseparatedcompletelyunderthenewchromatographicsystem.ImpurityA(6-epidoxycycline),B(metacycline),E(oxytetracycline)werelocatedinthechromatogrambyimpuritystandards.ImpurityC(4-epidoxycycline),D(4-epi-6-epi-doxycycline)werelocatedinthechromatogrambyimpuritysolutionspreparedaccordingasliteraturemethods,impurityFwaslocatedbythesolutionofimpurityFwhichpreparedbyapreparativeTLCmethod,andidentifiedbyLC-ESI-IP-MS2,therelativeresponsefactorsofoxytetracycline,metacyclineand6-epidoxycyclinewere0.95,1.29and0.77respectively.Thelinearrangewas0.07～122.556μg/ml(r=1.0).Theprecisionofmethodisgood.Therecoveryofthetabletmethodwas99.2%(n=9)andRSD%0.2%,theaveragerecoveryofthecapsulemethodwas99.4%(n=9)andRSD%0.2%.Doxycyclinecanbestableina0.01mol/Lhydrochloricacidsolutionfor24hours.Thischromatographicsystemcanbeappliedtothedeterminationofoxytetracycline,tetracycline,chlorotetracycline,minocyclineandmetacyclinebyadjustingthemobilephaseratioofacetatebufferandacetonitrile.ConclusionstheestablishedmethodwasbetterthanthecorrespondingmethodsofCP2005,USP31/NF26,BP2008,Ph.Eur6.0andJPⅩⅤandwasusedinCP2010.Key DoxycyclinehyclateHighperformanceliquidchromatographyAssayRelatedPharmacopoeiaofthePeople’sRepublicofChina1968.03.10劑在USP31/NF26BP2008Ph.Eur6.0、JPⅩⅤ和中國藥典2005年版等標(biāo)準(zhǔn)中均有收載[2~7]，Ph.Eur6.0化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1[4]。RR2R R多西環(huán)素雜質(zhì)A(β-多西環(huán)素，6-表多西環(huán)素6-雜質(zhì)C（4-表多西環(huán)素4-雜質(zhì)D（4-表-6-表多西環(huán)素4-epi-6-雜質(zhì)E(土霉素雜質(zhì)F(2-乙酰-2-1.Figure1.thestructuresofdoxycyclineandit’srelatedHC調(diào)節(jié)pH(pH值＜2)(pH值≥8[~7200518而UPP、h.ur、J（srenedvnlbenene200（大于2分鐘雜質(zhì)200P200研究，對流動相中緩沖鹽的種類和濃度、pH值的變化、有機溶劑的種類和比例、金屬離子螯合劑和環(huán)素及其制劑的含量和有關(guān)物質(zhì)測定的色譜條件，與《中國藥典》2005年版的色譜條件相比，現(xiàn)有CF在現(xiàn)有條件均能得到完全分離，作者還采用多種現(xiàn)代分析手段對典型樣品中檢抗生素，具有一定的通用性，2010版藥典中除金霉素外，其余所有四環(huán)類品種的色譜分離用流動相液相色譜儀：Waters2695-2996（Waters公司，美國），MettlerToledoXS205（MettlerToledo公司，瑞士），Agilent1100LC/MSDTrap液質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent公司）。1PhenomenexGeminiC18(250×4.6mm,5μm)；2PhenomenexlunaC18(150×4.6mm,5μm)；3SHISEIDOCAPCELLPAKMGIIC184.6mm×150mm,5μm)；4SHISEIDOCAPCELLPAKMGC18(4.6mm×150mm，5μm)；5AgilentZORBAXExtend-C18(3.0×250mm,5μm)；,色譜柱7(styrene-divinylbenzene填料：美國菲羅門Phenomenexpolymerx(4.6mm×250mm,5μm)；醋酸銨、EDTA鈉鹽、磷酸氫二鈉、三乙胺、冰醋酸、硫酸四丁基氫氧化銨均為分析純；N,N-二1）pH8.8]：乙腈=85：15；柱溫：35℃；檢測波長：280nm；流速：1.0ml/min；2（CP2005方法色譜柱：C18，流動相：0.05mol/L草酸銨-二甲基甲酰胺-0.2mol/L磷酸氫二銨（65：30：5），pH8.0±0.2；等度洗脫，柱溫:35℃；流速:1ml/min280nm，進樣體積：、0.74g氫氧化鈉，0.50g硫酸四丁基氫氧化銨，0.4gEDTA1000850ml60g叔丁流速:1ml/min270nm，進樣體積：20μl。速：8L/min；離子掃描范圍:50～650m/z；正離子檢測方式。（1）4-表多西環(huán)素(4-epidoxycycline)溶液：USP31/NF260.01mol/L0.4mg/ml60min，USP31/NF26的色譜條件進行分析，記錄的色譜圖中（圖略），除多西環(huán)素峰外，另4-表多西環(huán)素峰。（2）4-表-6-表多西環(huán)素(4-epi-6-epi-doxycycline)溶液：參考文獻制備方法[10]6-表多西環(huán)素(β-4-表-6-表多西環(huán)素峰。色譜條件優(yōu)化用溶液1(2005年版方法中系統(tǒng)適用性考察用溶液)分別稱取β多西環(huán)素0.2mg的溶液，供色譜條件優(yōu)化用。,5μl60H薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水(35：59：6)為展開劑，展365nm波長的紫外燈下觀察，多西環(huán)素斑點前有一雜質(zhì)斑點(應(yīng)為反相色譜條件下的后雜峰斑點)HPLC-ESI-IP-MSn對溶液中主成分結(jié)構(gòu)進行鑒定，并在優(yōu)化得到的色譜條件中進行色譜峰定位(2.2.3)。含量測定對照品溶液10mg鹽酸多西環(huán)素對照品，置于一100ml量瓶中，加 精密吸取有關(guān)物質(zhì)供試品液1ml置于一50ml量瓶中，加流動10mg100ml0.01mol/l鹽酸溶10mg，其余同原料操作。有關(guān)物質(zhì)測定用供試品溶液20mg100ml1ml0.01mol/l20mg，其余同原料操作。以1中多西環(huán)素及部分已知有關(guān)物質(zhì)之間的分離度、拖尾因子、峰寬作為指標(biāo)，考察流動相緩沖鹽的種類和濃度、pH值、有機溶劑及其它改性劑如三乙胺、EDTA等添加的2（a）、（b）、（c）所2.（a）0.05mo/L醋酸銨；（b）0.05mo/L磷酸氫二銨（c）0.05mo/LFigure2.thetypicalchromatogramsofdoxycyclineanditsrelatedsubstancesindifferentbuffersolutionsofmobile(a)0.05mo/Lammoniumacetate(b)0.05mo/Lammoniumdibasicphosphate(c)0.05mo/LdisodiumhydrogenCP2005N,N二甲基甲酰胺和四氫呋0.05mol/L醋酸銨-乙腈（pH8.2）（80：20）可以將多西環(huán)素及部分2.1.1.2的色譜條件下的多西環(huán)素有前拖尾現(xiàn)象(3)，且與β-多西環(huán)素之間未達(dá)到基線分離，按EDTA二鈉，競爭性地與硅膠4為多西環(huán)素及其有EDTA二鈉和三乙胺后的流動相可使多西環(huán)素及其有關(guān)物質(zhì)的色譜峰變銳，分離改善。 圖3.用乙腈代替N,N-二甲基甲酰胺典型的的色譜 圖4.添加EDTA二鈉與三乙胺的流動相的典型色譜Figure3.thetypicalchromatogramofdoxycyclineanditsrelatedsubstancesinmobilephasesubstitutingacetonitrilefordimethylformamide

Figure4.thetypicalchromatogramofdoxycyclineanditsrelatedsubstancesinmobilephaseaddingtriethyamineandethyldiaminetetraaceticaciddisodium2.1.1.30.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L0.25mol/L濃度的醋酸0.05~0.25mol/L濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增加，混合溶液中主成分多西環(huán),考慮鹽濃度太高對色譜柱會影0.25mol/L。pH膠載體填料壽命，為此，用冰醋酸將流動相中的水相部分即流動相A0.25mol/L醋酸銨-0.1mol/LEDTA鈉鹽-三乙胺（100:10:1）”pH7.5、8.0、8.51.2.1，用1pHpH7.5與pH8.0pH8.5時，各組分良好的分離，且具有適宜的峰寬與拖67-1pH8.7，4-差向多西環(huán)素峰形良好，綜合平衡色譜峰形、pHpH8.8。 54-pH8.5的流動相中的色譜分Figure5.thetypicalchromatogramof4-epidoxycyclineinapH8.5mobilephase

6.pH8.8的流動相中的Figure6.thetypicalchromatogramofdoxycyclineanditsrelatedsubstancesinpH8.8mobilephase 圖7-1.pH值對各組分峰分離度的影 圖7-2.pH值對各組分峰拖尾因子的影 圖7-3.pH值對各組分峰峰寬的影Figure7-1.theeffectsofmobilephasepHvalueontheresolutionsofdoxycyclineanditsrelatedsubstances

Figure7-2.theeffectsofmobilephasepHvalueonthetailingfactorsofdoxycyclineanditsrelatedsubstances

Figure7-3.theeffectsofmobilephasepHvalueonthepeakwidthofdoxycyclineanditsrelatedsubstances35℃。（100:10:1（85:15;等度洗脫；檢測波長：280nm；柱溫:35℃；流速:1ml/min20μl。86個主要8tR=11.67min的為β-多西環(huán)素(A6-表多西環(huán)素)tR=9.518min的為美他環(huán)素(B)、tR=5.892min的為土霉素(E)。8Figure8.thetypicalchromatogramofcommercialdoxycycline由文獻【2】可知，1.3.1(1)4-表多西環(huán)素，由文獻【10】可知，1.3.1(2)溶液環(huán)素(C)的色譜峰、tR=7.212min4-表-6-表多西環(huán)素(D)的色譜峰。用已知雜質(zhì)對照品法(2.2.1)和直接制備雜質(zhì)對照溶液方法(2.2.2)865個進行了定位，推測tR=18.031min處的雜質(zhì)峰為雜質(zhì)F2乙酰-2脫碳酰胺多西環(huán)素(2-acetyl-2-decarbamoyldoxycline)。為了驗證推測結(jié)果，作者參考Phr.Eu4.0中多西環(huán)素鑒別用TLC方法[12]，以商品化樣品為原料，制備了部分雜質(zhì)F溶液，用建立的色譜條件對其純度進行分析，色918.022min，與樣品中檢出的后相鄰峰色譜保留時間一致，采用流ESI-IP-MSn采集其主成分的一級和二級質(zhì)譜，其準(zhǔn)分子離子的[M+H]+444，與302（10），F(xiàn)11所示，各碎片離子均能得到合理解釋，證 圖9.雜質(zhì)F制備溶液純度測定的色譜 圖10.雜質(zhì)F的二級質(zhì)譜Figure9.thechromatogramofimpurityFsolutionpreparedbyTLC

Figure10.MS2ofimpurityH N

H

H雜質(zhì)

[M-HO]+

H

N

N

11.FFigure11.theMS2fragmentationpathsofimpurity280nm檢測波長下均未檢出，不干擾樣品的測定（圖略）。（0.1oL24hr、堿(0.1oL24hr)450x24hr)6048h、高濕（H92.548hr）等破壞實驗，結(jié)果表明，經(jīng)堿和氧化破壞后，鹽酸多西環(huán)素及其兩種制劑的含量降幅程度大，而酸、光照、干熱和高濕破壞后，含量降幅不大，但所有破壞實驗均會使樣品有關(guān)物質(zhì)個數(shù)增多，雜質(zhì)總數(shù)增加，優(yōu)化后的色譜條件能使這些樣品中的主成分、主要有關(guān)物質(zhì)與相12(a~(f)所示。 12.(a)(b0.1mol/L(c)24hr；(d)0.1mol/L(e60℃48hrs(fRH92.5%48hrsFigure12.thetypicalchromatogramsofdoxycyclinehyclatedegradatedindifferentconditions(a)hydrogenperoxidesolution(b)0.1mol/Lsodiumhydroxidesolution(c)light(d)0.1mol/Lhydrochloricacid(e)heatedat60℃for48hrs(f)RH92.5%for48hrs配制鹽酸多西環(huán)素對照貯備液（1mg/mL）0.07、87.540、105.048、122.556μg/ml20μlYX進行線性回歸，得出回歸方程：Y=3.73E+04X-3.04E+03，R＝1.00.07～122.556μg/ml濃度0.1mg/ml的溶液，并逐級稀釋，考察多西環(huán)素及已知雜質(zhì)對照品的檢測限（S/N=3）和定量限（S/N=10）,11. Table1.thelimitofdetectionandthelimitofquantityofdoxycycineandsomeknown

βdoxycycline

limitofdetection定量限

limitof 分別用鹽酸多西環(huán)素對照品與片劑或膠囊劑輔料，分別定量配制成相對含量約為80%、100%、120%三種溶液（9份）99.2%，RSD0.2%；鹽99.4%，RSD0.2%。RSD0.1％。中間精密度:分別選擇一批有代表性的原料、片劑和膠囊，采用不同的分析人員和不同分析儀RSD2.0%，有關(guān)物質(zhì)之差絕對值(B)0.1%。(4重現(xiàn)性:3批有代表性的原料、片劑和膠囊劑，供天津藥檢所進行復(fù)核，結(jié)果顯示，原料和制劑的含量測定結(jié)果的最大絕對差值(B)1%10%。0.1o/L主要是因為四環(huán)類抗生素在堿性水溶液特別容易氧化，顏色很快變深，形成色素，在酸性溶液中較24小時內(nèi)是穩(wěn)定的。2.Table2.thetestresultsofchromatographicsystemsuitabilityindifferentC18RatioRatioofmobileRetentionnumberofTailing123456

流動相比例

備注1：表2中的流動相比例指流動相A（0.25mol/L醋酸銨-0.1mol/LEDTA鈉鹽-三乙胺（100：10：1）,用磷酸調(diào)節(jié)pH至8.8）與流動相B（乙腈）之間的比例。2：2β別制備已知濃度（0.1mg/mL）多西環(huán)素、土霉素、美他環(huán)素、β-60.9～1.1范圍內(nèi)的要求，建議采用加校正因子的主成分自身對照法，用建立的方法分別對來源于不同企業(yè)(具體企業(yè)的名稱略)9批原料、18批片劑、1批膠囊(只征集到一批)3。3.Table3.theresultsofassayandrelatedsubstancesofdoxycyclinehyclateandits 檢測項目 批 有關(guān)物質(zhì)related 含量

The

unknown

HPLCCP2005EP、USPJP分離能力強：EP、USPJP6-表多西環(huán)素有效分離，但不能同時分離土霉素、美他環(huán)素、6-表多西環(huán)素和多西環(huán)素，且色譜峰很寬，CP20054-差N,N-二甲基甲酰胺和四氫呋喃，流動相比國外藥典方法更簡單。諾環(huán)素、美他環(huán)素、金霉素等品種，2010年中國藥典收載的四環(huán)類抗生素中，除金霉素外，其余品4.流動相比例 流動相比例 流動相pH 柱溫 RatioofmobilepHvalueofmobilephaseColumntemperatureA為不同pH值的醋酸鹽緩沖液(1.2.1);BFigure13thechromatogramsofthefamiliartetracyclineantibiotics(a)oxytetracycline(b)tetracycline(c)minocycline(d)chlorotetracycline(e)HuHFStudyonHydrogenationSynthesisofDoxycyclineHydrochloride[J].JiangsuChemicalIndustry(江蘇化工).2003,31(4):36~37TheUnitedStatesPharmacopoeialConventionInc.TheUnitedStatesPharmacopoeia31-TheNationalFormulary26[S].TwinbrookParkway,Rockville,MD:TheBoardofTrustees,2008,p2022~1027TheBritishPharmacopoeiaCommission.TheBritishPharmacopoeia[S].London:theStationaryOffice,2008:767~769CouncilofEurope.EuropeanPharmacopoeia6.0thEdition[S].Strasbourg：theDirectoratefortheQual