LC-MS/MS定量分析流程與經(jīng)驗(yàn)美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)公司應(yīng)用技術(shù)服務(wù)部Opportunities

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Market第一步：Q1

SCAN——確定母離子的質(zhì)荷比2Date

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Biosystems根據(jù)待測(cè)化合物性質(zhì)，選擇分析的極性(＋/－)、離子化 方式(ESI/APCI)，根據(jù)分子量選擇掃描范圍和時(shí)間確定母離子的質(zhì)荷比，準(zhǔn)確到小數(shù)點(diǎn)后一位。參數(shù)設(shè)置：掃描方式：Q1Scan質(zhì)量范圍：Parameter

Range，100～MW+30，t=1～2secCenter

Width，MW±5Da，t=0.5sec通過手動(dòng)調(diào)節(jié)DP、GS1，使噴霧平穩(wěn)、有效Opportunities

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Market第二步：Product

Ion

Scan——確定子離子的質(zhì)荷比3Date

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Biosystems得到高質(zhì)量的MS2圖，母離子的強(qiáng)度為圖譜中基峰強(qiáng)度 的1/3到1/4為宜平滑后選擇子離子質(zhì)荷比，確定到小數(shù)點(diǎn)后一位參數(shù)設(shè)置掃描方式：Product

Ion

Scan質(zhì)量范圍：Parameter

Range，50～MW+10，t=1～2sec通過手動(dòng)調(diào)節(jié)CEOpportunities

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Market第三步：優(yōu)化化合物參數(shù)4Date

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Biosystems根據(jù)前面選出的母、子離子，組建MRM離子對(duì)選擇多個(gè)離子對(duì)時(shí)，應(yīng)合理分配每一對(duì)的分析時(shí)間用“Ramp”，優(yōu)化Compound項(xiàng)下各參數(shù)，以及Source 項(xiàng)下CAD參數(shù)。各離子對(duì)應(yīng)分別設(shè)定。初步建立MRM方法一般優(yōu)化兩次，以得到比較確切的結(jié)果Opportunities

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Market第四步：方法轉(zhuǎn)化：將連續(xù)進(jìn)樣方法→LC-MS方法5Date

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Biosystems關(guān)掉所有質(zhì)譜分析界面，將現(xiàn)有質(zhì)譜體系滅活，激活液相色譜、質(zhì)譜設(shè)備。單擊Acquire中Build

Acquire

Method，打開上面保存過的MRM方法，添加設(shè)備：色譜泵、自動(dòng)進(jìn)樣器等。設(shè)置色譜同步。設(shè)置色譜參數(shù)，分析時(shí)間一般為0.6～1min，流動(dòng)相組成和流量與實(shí)際樣品分析時(shí)相同；修改質(zhì)譜分析時(shí)間，與色譜參數(shù)一致；設(shè)置GS1、GS2、TEM初始值為40、40、400左右，保存方法，例如：LC-MRM.dam。Opportunities

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Market第五步：FIA-優(yōu)化Source參數(shù)6Date

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Biosystems將前面用過的樣品溶液稀釋100～1000倍。在Tune項(xiàng)下，雙擊QuantitativeOptimization，選擇FIA分析，根據(jù)向?qū)нM(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化。不接色譜柱進(jìn)行FIA定量?jī)?yōu)化注意：需要優(yōu)化的各可選值之間用“;”分隔。當(dāng)對(duì)源參數(shù)含義及設(shè)置比較清楚后，可以省略此步。Opportunities

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Market第六步：色譜條件優(yōu)化7Date

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Biosystems接好并平衡色譜柱，用適當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)品考察分離情況根據(jù)色譜分離情況，會(huì)設(shè)定梯度洗脫MRM方式可以不必所有峰都基線分離，但要注意避開 基質(zhì)離子抑制的干擾調(diào)整色譜流動(dòng)相組成和流速，并相應(yīng)調(diào)整源參數(shù)Opportunities

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Market第七步：標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作8Date

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Biosystems空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋成不同濃度根據(jù)LC流動(dòng)相組成，選擇稀釋液，配制實(shí)際樣品，編輯批處理文件，排列進(jìn)樣順序平衡MS離子源和色譜柱LC-MS/MS采集數(shù)據(jù)Opportunities

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Market第八步：數(shù)據(jù)處理9Date

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Biosystems標(biāo)準(zhǔn)曲線的制做正確積分色譜圖有內(nèi)標(biāo)和無內(nèi)標(biāo)的計(jì)算方法最后結(jié)果的打印、存貯、復(fù)制Opportunities

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Market10Date

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Market重復(fù)步驟-流程圖多種方法同時(shí)編入批處理，清洗，降溫，關(guān)機(jī)程序11Date

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Biosystems自動(dòng)STANGBY。美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)公司應(yīng)用技術(shù)服務(wù)部成功定量分析的經(jīng)驗(yàn)與體會(huì)Opportunities

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Market準(zhǔn)備工作13Date

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Biosystems查閱文獻(xiàn)做好樣品前處理，萃取 濃縮 分離 純化有條件的可先在HPLC上摸好LC條件，能夠基本分離更好，緩沖體系符合MS要求溶劑包括水的純度，最好色譜純以上新的色譜柱可能要先沖洗很長(zhǎng)時(shí)間才能干凈,某些樣品非常容易吸附在進(jìn)樣閥和管路中，用溶劑清洗質(zhì)譜儀須校準(zhǔn)，預(yù)熱時(shí)間要足夠長(zhǎng)，氣流的穩(wěn)定也很重要，液N氣閥開度要注意，達(dá)到穩(wěn)定程度Opportunities

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MarketMS條件優(yōu)化——先定性后定量14Date

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Biosystems首先，確定離子化方式：ESI

or

APCI，POS

or

NEG用10-100ppm的純樣，Q1

SCAN

察看存在哪些離子，要能夠看到待測(cè)的母離子，應(yīng)明顯比周圍的噪聲離子高，通過改變DP,觀察離子的增減,若為POS方式，看M+1，M+18，M+23等等,初步判斷分子離子,如看不到則可能是濃度太低或離子化方式不合

適，或選擇的溶劑體系不合適母離子選M+H,或M-H最好,但有時(shí)只有M+NH4,M+Na等,這樣

CAD能量可能需要高些,選擇[M+H]+，還是+NH4，+Na等，要由化合物決定。加合離子若穩(wěn)定，則可用，不穩(wěn)定則可能需換流動(dòng)相，但+H通常好些，所需碰撞能量低，靈敏度高；如含Cl可選擇2個(gè)母離子峰Opportunities

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MarketSIM與MRM，單級(jí)Q只能SIM，MRM可看成2個(gè)SIM，選擇性更好再根據(jù)上一步確定的母離子進(jìn)行PRODUCT

SCAN，確保所有碎片離子都來自待測(cè)化合物，而不是溶液中的雜質(zhì)，找出較強(qiáng)的碎片離子信息。還可改變CE，從中選定MRM需要測(cè)定的一對(duì)或更多離子對(duì),為最后LC-MS/MS聯(lián)用做準(zhǔn)備做PRODUCT

SCAN時(shí)，注意小數(shù)點(diǎn)后的位數(shù),MRM輸入要準(zhǔn),靈 敏度才高先多選幾個(gè)離子對(duì)，待出現(xiàn)基質(zhì)干擾時(shí)可換，最后根據(jù)法規(guī)要求 確定離子對(duì)數(shù)目MRM方式優(yōu)化儀器，通過優(yōu)化儀器參數(shù)，使得母、子離子都達(dá)到 一定強(qiáng)度水平，使MRM靈敏度最高?？上茸寖x器自動(dòng)優(yōu)化參數(shù)， 然后再手動(dòng)細(xì)致優(yōu)化，只檢測(cè)一對(duì)離子時(shí)根據(jù)TIC的強(qiáng)度來確定儀 器參數(shù)，一次優(yōu)化多對(duì)離子時(shí)，要根據(jù)每對(duì)離子的XIC強(qiáng)度來分別 確定儀器參數(shù)15Date

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Market先用注射泵優(yōu)化COMPOUND項(xiàng)下面的參數(shù)，如DP、CE及CAD等，再接通LC，用FIA優(yōu)化其他參數(shù)如溫度，氣流和IS電壓及離子源位置，或接一個(gè)三通，樣品仍由注射泵進(jìn)入離子源，同時(shí)

LC保持需要的流量.然后進(jìn)行MRM測(cè)定。CURTAIN

GAS在不降低靈敏度情況下盡量大些，霧化輔助加熱氣流不用太大，這樣可以提高信噪比，保持信號(hào)穩(wěn)定。分辨率的選擇：當(dāng)樣品較純，Q3可選LOW，提高靈敏度，若選LOW后本底噪聲太高則意義不大。16Date

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MarketLC條件優(yōu)化：17Date

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Biosystems色譜柱長(zhǎng)度可根據(jù)分離的要求而定，定性可長(zhǎng)些,定量在能有效排除干擾情況下盡量短,提高效率；內(nèi)徑最好選細(xì)徑柱如2mm的,1mm的,IS可不分流,4.6mm柱用1ml流量時(shí)如不分流靈敏度還不是最佳,不如流量低時(shí)更好。流速高，峰形好不同牌號(hào)色譜柱，效果很可能不同PH的影響-正離子方式PH要低些，負(fù)離子方式PH要高些，除對(duì)離子化有影響外，還影響LC的峰形，以至定量誤差。流動(dòng)相加乙酸銨可適合大部分測(cè)定要求Opportunities

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Market用流動(dòng)相配的標(biāo)樣，初步優(yōu)化確定LC條件是否合適標(biāo)準(zhǔn)品工作液現(xiàn)配現(xiàn)做，尤其是較低濃度，時(shí)間長(zhǎng)了可能因吸附分解等降低進(jìn)樣順序要先稀后濃洗針液要常換，進(jìn)過濃樣后要進(jìn)一針空白，檢驗(yàn)是否有殘留污染順序：純樣-添加樣-實(shí)際樣品流動(dòng)相液優(yōu)化后，空白提取液配制標(biāo)準(zhǔn)再優(yōu)化，看干擾，空白添加再提取后看回收率用空白提取液配制標(biāo)準(zhǔn)樣做曲線，準(zhǔn)確，有效排除干擾因素18Date

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Market前處理方法的優(yōu)化19Date

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BiosystemsLC，MS都優(yōu)化還不行，改提取方法離子抑制-改變前處理方法或LC條件內(nèi)標(biāo)用法，藥代動(dòng)力學(xué)時(shí)多采用內(nèi)標(biāo)，選擇原則：內(nèi)標(biāo)物與被測(cè) 物的化學(xué)性質(zhì)有區(qū)別時(shí)，要注意干擾基質(zhì)對(duì)他們的離子化影響的 不同，盡量選同系物。還可利用同位素標(biāo)記衍生化：有時(shí)有助于信號(hào)強(qiáng)，且穩(wěn)定，例如硝基呋喃類，衍生化 后容易測(cè)量。Oppor