基于血管平滑肌細(xì)胞的抗動(dòng)脈粥樣硬化活性成分篩選與機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種慢性進(jìn)行性的血管疾病，其主要特征為動(dòng)脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小。作為心腦血管疾病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，AS嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，心腦血管疾病已成為全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的首要原因，而AS相關(guān)的心腦血管疾病，如冠心病、腦卒中等，在其中占據(jù)了相當(dāng)高的比例。隨著全球人口老齡化的加劇以及人們生活方式的改變，如高熱量飲食、缺乏運(yùn)動(dòng)、吸煙等不良生活習(xí)慣的普遍存在，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。在中國(guó)，心血管疾病的患病人數(shù)持續(xù)增加，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告2020》顯示，我國(guó)心血管病現(xiàn)患人數(shù)達(dá)3.3億，其中冠心病患者約1139萬，腦卒中患者約1300萬。這些數(shù)據(jù)充分表明，動(dòng)脈粥樣硬化已成為亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，涉及多種細(xì)胞和分子機(jī)制。其中，血管平滑肌細(xì)胞（VascularSmoothMuscleCells，VSMCs）在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中扮演著關(guān)鍵角色。正常情況下，VSMCs處于收縮型表型，主要參與維持血管的張力和結(jié)構(gòu)完整性。然而，在動(dòng)脈粥樣硬化等病理狀態(tài)下，VSMCs會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，獲得增殖、遷移和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力。合成型VSMCs的大量增殖和遷移，會(huì)導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄，同時(shí)還會(huì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)和血栓形成，進(jìn)一步加重動(dòng)脈粥樣硬化的病變程度。此外，VSMCs的異常增殖和遷移還與其他心血管疾病，如高血壓、血管再狹窄等密切相關(guān)。因此，抑制VSMCs的異常增殖和遷移，成為預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化及相關(guān)心血管疾病的重要策略之一。目前，臨床上用于治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物主要包括他汀類、抗血小板藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等。這些藥物在一定程度上能夠降低心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但仍存在一些局限性，如藥物不良反應(yīng)、部分患者治療效果不佳等。因此，尋找新的抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分，開發(fā)更加安全有效的治療方法，具有重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。天然產(chǎn)物來源廣泛，結(jié)構(gòu)多樣，具有豐富的生物活性，為抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物的研發(fā)提供了廣闊的資源。許多傳統(tǒng)中藥及天然產(chǎn)物中含有多種活性成分，已被證實(shí)具有潛在的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。例如，丹參中的丹參酮、三七中的三七皂苷、銀杏葉中的黃酮類化合物等，在調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗炎、抑制VSMCs增殖和遷移等方面表現(xiàn)出顯著的效果。對(duì)這些天然產(chǎn)物活性成分的研究，不僅有助于深入了解其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制，還可能為新藥研發(fā)提供新的先導(dǎo)化合物。本研究以血管平滑肌細(xì)胞為靶標(biāo)，篩選具有抗動(dòng)脈粥樣硬化活性的功效成分，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。通過本研究，有望發(fā)現(xiàn)新的抗動(dòng)脈粥樣硬化活性成分，為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的思路和方法，同時(shí)也為天然產(chǎn)物在心血管疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持，具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜且尚未完全明確的過程，多年來眾多學(xué)者從不同角度進(jìn)行研究，提出了多種學(xué)說，如“脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說”“血栓形成學(xué)說”“損傷-反應(yīng)學(xué)說”“炎癥學(xué)說”等，這些學(xué)說相互補(bǔ)充，共同完善了人們對(duì)AS發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)?！爸|(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說”認(rèn)為，血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要起始因素。血液中升高的膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等脂質(zhì)成分，尤其是氧化修飾的低密度脂蛋白（ox-LDL），可透過受損的血管內(nèi)皮進(jìn)入內(nèi)皮下，被巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞攝取，形成泡沫細(xì)胞，這些泡沫細(xì)胞逐漸聚集融合，形成早期的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊?！把ㄐ纬蓪W(xué)說”強(qiáng)調(diào)血小板聚集和血栓形成在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中的作用。當(dāng)血管內(nèi)皮受損時(shí)，內(nèi)皮下的膠原纖維暴露，激活血小板，使其黏附、聚集在受損部位，形成血小板血栓。同時(shí)，凝血系統(tǒng)也被激活，進(jìn)一步促進(jìn)血栓形成，血栓機(jī)化后可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的增大和血管狹窄?！皳p傷-反應(yīng)學(xué)說”則認(rèn)為，各種危險(xiǎn)因素，如高血壓、高血脂、高血糖、吸煙、感染等，均可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷。受損的內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，吸引血液中的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞黏附并遷入內(nèi)皮下，單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL成為泡沫細(xì)胞。此外，血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）在細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的刺激下，從收縮型表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚捅硇?，遷移至內(nèi)膜下并增殖，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)斑塊的形成和發(fā)展?！把装Y學(xué)說”指出，炎癥反應(yīng)貫穿動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的全過程。在動(dòng)脈粥樣硬化早期，血管內(nèi)皮損傷引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥介質(zhì)可進(jìn)一步損傷血管內(nèi)皮，促進(jìn)VSMCs的增殖和遷移，加速泡沫細(xì)胞的形成，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，增加心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中，血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移起著關(guān)鍵作用。正常生理狀態(tài)下，VSMCs主要維持血管的張力和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，處于相對(duì)靜止的收縮型表型，具有低增殖、低遷移和高收縮能力的特點(diǎn)，同時(shí)表達(dá)高水平的收縮型標(biāo)志物，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、平滑肌22α（SM22α）等。然而，在動(dòng)脈粥樣硬化等病理?xiàng)l件下，VSMCs受到多種刺激因素的影響，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、機(jī)械應(yīng)力、氧化應(yīng)激等，發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚捅硇?。合成型VSMCs失去正常的收縮功能，獲得高度增殖和遷移能力，同時(shí)分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，包括膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白等，導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄。細(xì)胞周期調(diào)控異常是VSMCs異常增殖的重要機(jī)制之一。細(xì)胞周期受到一系列細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）的精確調(diào)控。在正常細(xì)胞周期中，Cyclins與CDKs結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDKs的激酶活性，推動(dòng)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，再依次經(jīng)過G2期和M期，完成細(xì)胞增殖。在動(dòng)脈粥樣硬化過程中，多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等，可通過激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路、PI3K-Akt通路等，上調(diào)Cyclins和CDKs的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)CKIs的表達(dá)，使細(xì)胞周期進(jìn)程加速，導(dǎo)致VSMCs異常增殖。VSMCs的遷移涉及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用以及細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化。細(xì)胞外基質(zhì)中的多種成分，如纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白等，通過與VSMCs表面的整合素受體結(jié)合，為細(xì)胞遷移提供黏附位點(diǎn)和牽引力。當(dāng)VSMCs接收到遷移信號(hào)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生重排，形成偽足結(jié)構(gòu)，偽足前端與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，后端收縮，從而推動(dòng)細(xì)胞向前遷移。此外，多種信號(hào)通路參與調(diào)控VSMCs的遷移過程，如Rho家族小GTP酶（RhoA、Rac1、Cdc42）信號(hào)通路，它們通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的組裝和解聚，影響VSMCs的遷移能力。近年來，隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入。越來越多的研究表明，非編碼RNA，如微小RNA（miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）等，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過程或促進(jìn)其降解，從而調(diào)控基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在動(dòng)脈粥樣硬化病變中表達(dá)異常，它們可通過調(diào)控VSMCs的增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)換以及炎癥反應(yīng)等過程，影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。例如，miR-126可通過抑制VEGFA-PI3K-Akt信號(hào)通路，抑制VSMCs的增殖和遷移，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用；miR-143/145簇是VSMCs特異性表達(dá)的miRNA，對(duì)維持VSMCs的收縮型表型至關(guān)重要，其表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致VSMCs表型轉(zhuǎn)換和異常增殖，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。在動(dòng)脈粥樣硬化領(lǐng)域，一些lncRNA被發(fā)現(xiàn)參與VSMCs的功能調(diào)節(jié)。例如，lncRNAMALAT1可通過與miR-143/145相互作用，調(diào)控VSMCs的表型轉(zhuǎn)換和增殖，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展；lncRNAH19可通過調(diào)節(jié)miR-675-5p/IGF1R軸，影響VSMCs的增殖和遷移，在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮促炎和促增殖作用。此外，表觀遺傳修飾，如DNA甲基化、組蛋白修飾等，也被證實(shí)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基基團(tuán)添加到DNA特定區(qū)域的胞嘧啶殘基上，通常會(huì)抑制基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因的DNA甲基化水平發(fā)生改變，影響其表達(dá)，進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。例如，對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化修飾可調(diào)節(jié)其表達(dá)，影響血管緊張素II的生成，從而影響血壓和動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。組蛋白修飾包括甲基化、乙?；?、磷酸化等多種形式，可通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，調(diào)控基因的表達(dá)。在動(dòng)脈粥樣硬化中，組蛋白修飾參與調(diào)節(jié)VSMCs的表型轉(zhuǎn)換和炎癥反應(yīng)等過程。例如，組蛋白去乙?；福℉DACs）可通過調(diào)節(jié)組蛋白的乙酰化水平，影響VSMCs中相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)VSMCs的增殖和遷移，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展；而組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶可通過對(duì)組蛋白特定賴氨酸殘基的甲基化修飾，調(diào)控炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，影響動(dòng)脈粥樣硬化病變中的炎癥反應(yīng)。1.2.2抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分研究現(xiàn)狀目前，已發(fā)現(xiàn)多種具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的功效成分，這些成分來源廣泛，包括天然產(chǎn)物、合成化合物以及生物制劑等，它們通過不同的作用機(jī)制發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化效果。在天然產(chǎn)物領(lǐng)域，許多植物、動(dòng)物和微生物來源的成分展現(xiàn)出顯著的抗動(dòng)脈粥樣硬化活性。植物來源的成分中，黃酮類化合物是研究較為廣泛的一類。黃酮類化合物廣泛存在于水果、蔬菜、茶葉、中藥材等植物中，具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血脂、抑制血小板聚集等，這些作用均有助于對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化。例如，槲皮素是一種常見的黃酮類化合物，可通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減少ox-LDL的生成和巨噬細(xì)胞的炎癥因子分泌，同時(shí)抑制VSMCs的增殖和遷移，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用；蘆丁能夠降低血脂水平，提高抗氧化酶活性，減少脂質(zhì)過氧化，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。萜類化合物也是一類重要的天然抗動(dòng)脈粥樣硬化成分。丹參中的丹參酮屬于萜類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、調(diào)節(jié)血脂等多種作用。研究表明，丹參酮可通過抑制NF-κB信號(hào)通路，減少炎癥因子的表達(dá)，抑制VSMCs的增殖和遷移，穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；人參皂苷是人參中的主要活性成分，具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗炎癥、抑制細(xì)胞凋亡等作用，能夠改善血管內(nèi)皮功能，抑制VSMCs的異常增殖，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有一定的防治作用。多糖類成分也逐漸受到關(guān)注。黃精多糖可降低高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠血脂水平，提高抗氧化能力，減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)有關(guān)；枸杞多糖能夠調(diào)節(jié)血脂，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。在動(dòng)物來源的成分中，一些活性肽和脂肪酸具有抗動(dòng)脈粥樣硬化潛力。例如，海洋生物來源的ω-3多不飽和脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），可降低血脂，特別是甘油三酯水平，減少炎癥反應(yīng)，抑制血小板聚集，改善血管內(nèi)皮功能，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有預(yù)防和治療作用；從牛奶酪蛋白中提取的活性肽，能夠抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性，降低血壓，同時(shí)具有抗氧化和抗炎作用，有助于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化。微生物來源的成分中，一些益生菌及其代謝產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。益生菌可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，影響脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)。例如，雙歧桿菌和乳酸菌等益生菌能夠降低血脂水平，減少腸道內(nèi)膽固醇的吸收，同時(shí)產(chǎn)生短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，減輕炎癥反應(yīng)，從而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起到一定的預(yù)防作用。在合成化合物方面，他汀類藥物是臨床上廣泛應(yīng)用的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物。他汀類藥物通過抑制羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶，減少膽固醇的合成，降低血液中LDL-C水平，同時(shí)還具有抗炎、抗氧化、穩(wěn)定斑塊等多效性作用。研究表明，他汀類藥物能夠顯著降低心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，改善患者預(yù)后。然而，他汀類藥物也存在一些不良反應(yīng)，如肌肉毒性、肝損傷、血糖升高等，限制了其在部分患者中的應(yīng)用。除他汀類藥物外，其他一些合成化合物也在抗動(dòng)脈粥樣硬化研究中展現(xiàn)出潛力。例如，貝特類藥物主要通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα），調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，降低甘油三酯和升高HDL-C水平，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用；依折麥布通過抑制腸道膽固醇的吸收，降低血液中LDL-C水平，與他汀類藥物聯(lián)合使用可增強(qiáng)降脂效果。生物制劑方面，近年來一些針對(duì)特定靶點(diǎn)的抗體和基因治療藥物成為研究熱點(diǎn)。例如，針對(duì)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（PCSK9）的單克隆抗體，可通過抑制PCSK9與LDLR的結(jié)合，減少LDLR的降解，增加肝臟對(duì)LDL-C的攝取，從而顯著降低血液中LDL-C水平，為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供了新的手段；基因治療藥物則通過導(dǎo)入或調(diào)控特定基因的表達(dá)，干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制。例如，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將抗氧化酶基因?qū)胙軆?nèi)皮細(xì)胞，可增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。盡管目前在抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足與空白。一方面，大多數(shù)研究集中在單一成分的作用及機(jī)制探討，對(duì)于多種成分協(xié)同作用的研究相對(duì)較少。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，尤其是天然產(chǎn)物提取物，往往包含多種活性成分，它們之間可能存在協(xié)同增效或相互作用，共同影響抗動(dòng)脈粥樣硬化效果。因此，深入研究多種成分的協(xié)同作用機(jī)制，對(duì)于開發(fā)更有效的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物具有重要意義。另一方面，現(xiàn)有研究多在細(xì)胞和動(dòng)物模型水平進(jìn)行，臨床研究相對(duì)較少。從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化過程中，存在許多挑戰(zhàn)，如成分的藥代動(dòng)力學(xué)特性、安全性評(píng)價(jià)、劑量?jī)?yōu)化等問題需要進(jìn)一步解決。此外，對(duì)于不同個(gè)體之間的差異，如遺傳背景、生活方式、合并疾病等因素對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分作用效果的影響，研究也相對(duì)不足。在作用機(jī)制研究方面，雖然已經(jīng)明確了許多抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分的主要作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，但仍有一些細(xì)節(jié)尚未完全闡明。例如，一些成分在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物及其作用機(jī)制尚不明確，以及它們與體內(nèi)其他生理過程的相互影響還需要深入研究。同時(shí)，隨著對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入，新的潛在靶點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)，針對(duì)這些新靶點(diǎn)的功效成分篩選和研究還處于起步階段。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在以血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）為靶標(biāo)，從天然產(chǎn)物及合成化合物庫(kù)中篩選出具有抗動(dòng)脈粥樣硬化活性的功效成分，并初步探究其作用機(jī)制，為抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物的研發(fā)提供新的先導(dǎo)化合物和理論依據(jù)。具體目標(biāo)如下：建立高效、穩(wěn)定的血管平滑肌細(xì)胞體外模型，用于抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分的篩選。從多種天然產(chǎn)物提取物和合成化合物中篩選出對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移具有顯著抑制作用的活性成分。明確篩選得到的活性成分對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞功能和信號(hào)通路的影響，初步揭示其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。1.3.2研究?jī)?nèi)容血管平滑肌細(xì)胞體外模型的建立與鑒定：采用組織塊貼壁法或酶消化法分離培養(yǎng)人臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HUVSMCs）或大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（RASMCs），通過形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光染色等方法鑒定細(xì)胞的純度和表型。利用不同濃度的血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、血清等刺激劑建立VSMCs的異常增殖和遷移模型，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖和遷移能力，確定最佳的模型構(gòu)建條件?？箘?dòng)脈粥樣硬化功效成分的篩選：收集多種天然產(chǎn)物提取物，如植物提取物（如丹參、銀杏葉、山楂等）、動(dòng)物提取物（如蛇毒、水蛭提取物等）以及微生物發(fā)酵產(chǎn)物等，同時(shí)從合成化合物庫(kù)中選取具有潛在抗動(dòng)脈粥樣硬化活性的化合物。將這些提取物和化合物作用于建立好的VSMCs模型，采用CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)其對(duì)VSMCs增殖和遷移的影響，篩選出具有顯著抑制作用的活性成分。對(duì)篩選得到的活性成分進(jìn)行初步的結(jié)構(gòu)鑒定和純度分析，采用質(zhì)譜（MS）、核磁共振（NMR）等技術(shù)確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過高效液相色譜（HPLC）等方法測(cè)定其純度?；钚猿煞挚箘?dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制的初步研究：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等方法檢測(cè)活性成分對(duì)VSMCs中與增殖、遷移相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，如細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等。運(yùn)用免疫熒光染色、激光共聚焦顯微鏡等技術(shù)觀察活性成分對(duì)VSMCs細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響，分析其與細(xì)胞遷移能力改變的關(guān)系。通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等方法檢測(cè)活性成分對(duì)VSMCs培養(yǎng)上清中炎癥因子和細(xì)胞因子水平的影響，探討其在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中的作用。利用信號(hào)通路抑制劑和激動(dòng)劑，結(jié)合qRT-PCR、Westernblot等實(shí)驗(yàn)，研究活性成分對(duì)VSMCs中相關(guān)信號(hào)通路的影響，如Ras-Raf-MEK-ERK通路、PI3K-Akt通路、NF-κB通路等，初步明確其作用靶點(diǎn)和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法細(xì)胞培養(yǎng)與模型建立：采用組織塊貼壁法或酶消化法進(jìn)行血管平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)。具體操作如下，在無菌條件下獲取人臍動(dòng)脈或大鼠胸主動(dòng)脈組織，將其剪切成約1mm3大小的組織塊，均勻貼附于培養(yǎng)瓶底部，加入含10%-20%胎牛血清的DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊周圍爬出并融合至80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。通過形態(tài)學(xué)觀察，在倒置相差顯微鏡下，正常的血管平滑肌細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，束狀排列，呈現(xiàn)典型的“峰-谷”樣生長(zhǎng)形態(tài)；利用免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和結(jié)蛋白（Desmin），若細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)陽性染色，則可鑒定為血管平滑肌細(xì)胞，以確保細(xì)胞的純度和表型。為建立血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移模型，用不同濃度的血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF），一般設(shè)置5-50ng/mL的濃度梯度，或10%-20%的血清進(jìn)行刺激。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法，在不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h）用胰酶消化細(xì)胞，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量；CCK-8法，在96孔板中接種細(xì)胞，加入不同濃度的CCK-8試劑，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)450nm處的吸光度值；EdU摻入實(shí)驗(yàn)，按照試劑盒說明書操作，利用熒光顯微鏡觀察EdU陽性細(xì)胞數(shù)量，以此檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，在上室加入細(xì)胞懸液，下室加入含PDGF或血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時(shí)間后，固定、染色遷移到下室的細(xì)胞，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳的模型構(gòu)建條件。2.抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分篩選：從多種天然產(chǎn)物中提取成分，植物提取物可采用乙醇回流提取、超聲輔助提取等方法。例如，對(duì)于丹參，取適量干燥丹參藥材，粉碎后加入8-10倍量的70%乙醇，回流提取2-3次，每次1-2h，合并提取液，減壓濃縮得到丹參提取物。動(dòng)物提取物可根據(jù)其特性選擇合適的提取方法，如蛇毒可采用生理鹽水提取。微生物發(fā)酵產(chǎn)物則收集發(fā)酵液，通過離心、過濾等方法進(jìn)行初步處理。從合成化合物庫(kù)中選取具有潛在抗動(dòng)脈粥樣硬化活性的化合物，如結(jié)構(gòu)類似已知抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物或根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道具有相關(guān)活性的化合物。將這些提取物和化合物作用于建立好的血管平滑肌細(xì)胞模型，采用CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響。設(shè)置不同的藥物濃度梯度，如1-100μM，以確定其半抑制濃度（IC??）。篩選出對(duì)細(xì)胞增殖和遷移具有顯著抑制作用（抑制率≥50%）的活性成分。對(duì)篩選得到的活性成分進(jìn)行初步的結(jié)構(gòu)鑒定和純度分析，采用質(zhì)譜（MS）技術(shù)，通過分析分子離子峰、碎片離子峰等信息確定其分子量和可能的結(jié)構(gòu)；核磁共振（NMR）技術(shù)，通過1H-NMR、13C-NMR等譜圖分析確定分子結(jié)構(gòu)中的氫原子和碳原子的化學(xué)環(huán)境和連接方式。利用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定其純度，一般要求純度≥95%。3.活性成分抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制研究：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增與增殖、遷移相關(guān)的基因，如細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4、CDK2，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21、p27，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9等，通過比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Ct值，計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后用特異性抗體檢測(cè)上述基因?qū)?yīng)的蛋白表達(dá)水平，根據(jù)條帶的灰度值進(jìn)行定量分析。運(yùn)用免疫熒光染色，用熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記F-肌動(dòng)蛋白，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化，分析其與細(xì)胞遷移能力改變的關(guān)系。通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子和細(xì)胞因子水平，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，按照試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)相應(yīng)波長(zhǎng)下的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算因子的濃度。利用信號(hào)通路抑制劑和激動(dòng)劑，如U0126抑制Ras-Raf-MEK-ERK通路，LY294002抑制PI3K-Akt通路，BAY11-7082抑制NF-κB通路。在加入活性成分的同時(shí)，分別加入相應(yīng)的抑制劑或激動(dòng)劑，結(jié)合qRT-PCR、Westernblot等實(shí)驗(yàn)，研究活性成分對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響，初步明確其作用靶點(diǎn)和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：細(xì)胞培養(yǎng)與模型建立階段：獲取人臍動(dòng)脈或大鼠胸主動(dòng)脈組織，通過組織塊貼壁法或酶消化法進(jìn)行血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定。采用PDGF或血清刺激細(xì)胞，建立異常增殖和遷移模型，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等方法驗(yàn)證模型的有效性?？箘?dòng)脈粥樣硬化功效成分篩選階段：提取天然產(chǎn)物成分并收集合成化合物，作用于建立好的細(xì)胞模型，通過CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)篩選活性成分，對(duì)篩選得到的活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和純度分析?；钚猿煞挚箘?dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制研究階段：運(yùn)用qRT-PCR、Westernblot檢測(cè)活性成分對(duì)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，通過免疫熒光染色、激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)變化，采用ELISA檢測(cè)炎癥因子和細(xì)胞因子水平，利用信號(hào)通路抑制劑和激動(dòng)劑研究活性成分對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響。[此處插入技術(shù)路線圖，圖1-1：研究技術(shù)路線圖，包括細(xì)胞培養(yǎng)與模型建立、抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分篩選、活性成分抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制研究三個(gè)階段，各階段用箭頭連接，標(biāo)注每個(gè)階段的主要操作和檢測(cè)方法]二、血管平滑肌細(xì)胞與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系解析2.1血管平滑肌細(xì)胞概述血管平滑肌細(xì)胞（VascularSmoothMuscleCells，VSMCs）作為構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)及維持血管張力的主要細(xì)胞成分，在血管系統(tǒng)中發(fā)揮著不可或缺的作用，其結(jié)構(gòu)與功能的正常維持對(duì)于機(jī)體的健康至關(guān)重要。從結(jié)構(gòu)上看，VSMCs呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞直徑約為5-10μm，長(zhǎng)度則在20-500μm之間，這種形態(tài)使其能夠在血管壁中緊密排列。細(xì)胞內(nèi)富含肌絲，主要包括肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白，它們相互交織形成收縮裝置，是VSMCs發(fā)揮收縮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。此外，VSMCs的胞質(zhì)內(nèi)還含有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與蛋白質(zhì)的合成與加工，為細(xì)胞合成和分泌各種細(xì)胞外基質(zhì)成分以及生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)提供保障；線粒體則是細(xì)胞的能量工廠，通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，為VSMCs的收縮、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、增殖和遷移等生理活動(dòng)提供能量；高爾基體主要負(fù)責(zé)對(duì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)進(jìn)行修飾、加工和分類，然后將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞的特定部位或分泌到細(xì)胞外。同時(shí)，VSMCs還具有豐富的中間纖維和細(xì)胞外基質(zhì)。中間纖維如結(jié)蛋白（Desmin）等，不僅有助于維持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，還在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞間連接等過程中發(fā)揮作用；細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白等組成，它們不僅為VSMCs提供物理支撐，還參與細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移和功能。在功能方面，VSMCs具有多種重要功能。首先，維持血管張力是其核心功能之一。通過自身的收縮和舒張，VSMCs能夠調(diào)節(jié)血管的口徑，從而控制血流的阻力和血壓。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)或需要調(diào)節(jié)局部血流時(shí)，神經(jīng)、體液等因素會(huì)刺激VSMCs發(fā)生收縮或舒張反應(yīng)。例如，去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)與VSMCs上的α1腎上腺素受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的磷脂酶C（PLC）-肌醇三磷酸（IP3）-鈣離子（Ca2?）信號(hào)通路，使細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高，Ca2?與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，激活肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK），MLCK使肌球蛋白輕鏈磷酸化，從而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相互作用，導(dǎo)致VSMCs收縮，血管口徑減小，血流阻力增加，血壓升高；而一氧化氮（NO）等舒張因子則可通過激活鳥苷酸環(huán)化酶（GC），使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平升高，cGMP激活蛋白激酶G（PKG），PKG使MLCK磷酸化失活，同時(shí)促進(jìn)肌球蛋白輕鏈去磷酸化，導(dǎo)致VSMCs舒張，血管口徑增大，血流阻力降低，血壓下降。這種對(duì)血管張力的精確調(diào)節(jié)，對(duì)于維持機(jī)體正常的血液循環(huán)和各組織器官的血液灌注至關(guān)重要。調(diào)節(jié)血液流量也是VSMCs的重要功能。當(dāng)人體處于不同生理狀態(tài)時(shí)，如運(yùn)動(dòng)、睡眠、進(jìn)食等，各組織器官對(duì)血液的需求會(huì)發(fā)生變化。VSMCs能夠感知這些變化，并迅速調(diào)整其收縮狀態(tài)，以適應(yīng)腦組織對(duì)血液流量的需求。例如，在運(yùn)動(dòng)時(shí)，骨骼肌等組織的代謝活動(dòng)增強(qiáng)，對(duì)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求增加，此時(shí)VSMCs會(huì)舒張供應(yīng)這些組織的血管，增加血液流量，滿足組織的代謝需求；而在睡眠時(shí)，機(jī)體的代謝活動(dòng)相對(duì)降低，VSMCs會(huì)適度收縮血管，減少不必要的血液供應(yīng)，以維持整體的血液循環(huán)平衡。VSMCs還參與血管重塑過程。在長(zhǎng)期慢性刺激下，如高血壓、高血脂、炎癥等病理狀態(tài)，VSMCs可發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。收縮型VSMCs具有高收縮性、低增殖和低遷移能力，主要表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、平滑肌22α（SM22α）等收縮型標(biāo)志物，它們能夠維持血管的正常結(jié)構(gòu)和功能；而合成型VSMCs則失去正常的收縮功能，獲得高度增殖和遷移能力，同時(shí)分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白等。合成型VSMCs的增殖和遷移會(huì)導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄，這種血管重塑過程在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。例如，在動(dòng)脈粥樣硬化早期，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，吸引血液中的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞黏附并遷入內(nèi)皮下，同時(shí)刺激VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。合成型VSMCs遷移至內(nèi)膜下并增殖，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，逐漸形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，隨著斑塊的不斷增大和發(fā)展，血管管腔逐漸狹窄，影響血液供應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致血管堵塞，引發(fā)心腦血管事件。在血管中的分布上，VSMCs廣泛存在于動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管等各級(jí)血管中。在動(dòng)脈中，VSMCs主要分布在中膜層，是中膜的主要細(xì)胞成分。不同類型的動(dòng)脈中，VSMCs的分布和功能也存在一定差異。大動(dòng)脈如主動(dòng)脈，其VSMCs富含彈性纖維，具有較強(qiáng)的彈性和順應(yīng)性，能夠緩沖心臟收縮時(shí)產(chǎn)生的壓力波動(dòng)，維持血流的平穩(wěn)；而小動(dòng)脈和微動(dòng)脈的VSMCs則對(duì)血管阻力的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用，它們的收縮和舒張能夠精確控制局部組織的血液灌注。在靜脈中，VSMCs的數(shù)量相對(duì)較少，但同樣參與靜脈血管的張力調(diào)節(jié)和血液回流。在毛細(xì)血管中，雖然沒有典型的平滑肌細(xì)胞，但存在一些具有收縮功能的周細(xì)胞，它們與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，共同調(diào)節(jié)毛細(xì)血管的通透性和血流。血管平滑肌細(xì)胞憑借其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和多樣的功能，在血管系統(tǒng)中承擔(dān)著維持血管張力、調(diào)節(jié)血液流量和參與血管重塑等重要職責(zé)，對(duì)維持血管的正常功能和機(jī)體的健康發(fā)揮著不可替代的作用。2.2血管平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中的異常變化2.2.1異常增殖在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）的異常增殖是一個(gè)關(guān)鍵的病理變化。正常生理狀態(tài)下，VSMCs處于相對(duì)靜止的收縮型表型，增殖活性較低，主要維持血管的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，當(dāng)血管受到多種危險(xiǎn)因素的刺激，如高濃度血清、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)等，VSMCs會(huì)被激活，進(jìn)入細(xì)胞周期并開始異常增殖。高濃度血清是誘導(dǎo)VSMCs異常增殖的常見因素之一。血清中含有多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等，這些因子可以與VSMCs表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。其中，PDGF是一種強(qiáng)效的促有絲分裂原，在動(dòng)脈粥樣硬化病變中，血小板聚集、內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等均可導(dǎo)致局部PDGF釋放增加。PDGF與VSMCs表面的PDGF受體（PDGFR）結(jié)合后，使受體發(fā)生二聚化和磷酸化，進(jìn)而激活下游的磷脂酶Cγ（PLCγ）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）等信號(hào)通路。PLCγ水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP?）產(chǎn)生肌醇三磷酸（IP3）和二酰甘油（DAG），IP3促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2?，升高細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度，激活蛋白激酶C（PKC）；DAG則直接激活PKC。PKC通過磷酸化一系列底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和基因表達(dá)。MAPK通路中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）被激活后，可磷酸化并激活多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Jun、c-Fos等，這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA上的特定序列結(jié)合，啟動(dòng)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白E（CyclinE）等，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而加速細(xì)胞增殖。PI3K激活后，可使下游的蛋白激酶B（Akt）磷酸化并激活，Akt通過抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β），穩(wěn)定CyclinD1，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，同時(shí)還可調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活和代謝，進(jìn)一步促進(jìn)VSMCs的增殖。細(xì)胞因子在VSMCs異常增殖中也發(fā)揮著重要作用。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種重要的促炎細(xì)胞因子，在動(dòng)脈粥樣硬化病變中，TNF-α主要由巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞分泌。TNF-α與VSMCs表面的TNF受體1（TNFR1）結(jié)合后，可激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。TNF-α與TNFR1結(jié)合導(dǎo)致受體三聚化，招募TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TRADD），TRADD進(jìn)一步招募受體相互作用蛋白1（RIP1）和TNF受體相關(guān)因子2（TRAF2），形成復(fù)合物。該復(fù)合物激活I(lǐng)κB激酶（IKK），IKK磷酸化IκBα，使其降解，從而釋放NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)一系列與細(xì)胞增殖、炎癥和存活相關(guān)基因的表達(dá)，如CyclinD1、c-Myc、IL-6等，促進(jìn)VSMCs的增殖。此外，TNF-α還可通過激活MAPK通路中的p38和c-Jun氨基末端激酶（JNK），調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡。白細(xì)胞介素-1（IL-1）也是一種促炎細(xì)胞因子，它可以通過與VSMCs表面的IL-1受體結(jié)合，激活類似的信號(hào)通路，促進(jìn)VSMCs的增殖。IL-1與受體結(jié)合后，招募IL-1受體相關(guān)蛋白（IRAK），IRAK激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），進(jìn)而激活I(lǐng)KK和MAPK通路，最終導(dǎo)致NF-κB的激活和相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。VSMCs的異常增殖在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中產(chǎn)生了多方面的影響。大量增殖的VSMCs遷移至內(nèi)膜下，導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚，管腔狹窄，影響血液的正常流動(dòng)。VSMCs在增殖過程中會(huì)分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白等，這些細(xì)胞外基質(zhì)的堆積進(jìn)一步加重了血管壁的增厚和硬化。異常增殖的VSMCs還會(huì)改變血管壁的力學(xué)性能，增加血管破裂的風(fēng)險(xiǎn)。VSMCs的增殖與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展密切相關(guān)，過度增殖的VSMCs可形成不穩(wěn)定斑塊，容易破裂引發(fā)急性心血管事件，如心肌梗死、腦卒中等。2.2.2遷移在動(dòng)脈粥樣硬化的病理進(jìn)程中，血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）的遷移也是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)疾病的發(fā)展產(chǎn)生著重要影響。正常情況下，VSMCs主要位于血管中膜，維持血管的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。然而，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生時(shí)，多種因素可誘導(dǎo)VSMCs從血管中膜向內(nèi)膜遷移。在細(xì)胞遷移過程中，VSMCs與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）之間存在著復(fù)雜的相互作用。ECM主要由膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白等成分組成，為細(xì)胞提供物理支撐和信號(hào)傳導(dǎo)。VSMCs通過表面的整合素受體與ECM中的配體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與ECM的黏附。整合素是一類跨膜糖蛋白，由α和β亞基組成，不同的α和β亞基組合形成多種整合素亞型，它們對(duì)不同的ECM成分具有特異性的親和力。例如，α5β1整合素主要與纖連蛋白結(jié)合，α2β1整合素則與膠原蛋白和層粘連蛋白結(jié)合。當(dāng)VSMCs接收到遷移信號(hào)時(shí)，整合素與ECM的結(jié)合力增強(qiáng)，形成黏著斑。黏著斑不僅為細(xì)胞提供了附著點(diǎn)，還招募了一系列信號(hào)分子和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白，如樁蛋白（Paxillin）、黏著斑激酶（FAK）和Src激酶等。這些分子相互作用，激活下游的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，為細(xì)胞遷移提供動(dòng)力。細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化是VSMCs遷移的核心過程。細(xì)胞骨架主要由微絲、微管和中間絲組成，其中微絲在細(xì)胞遷移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。微絲由肌動(dòng)蛋白單體聚合而成，在遷移過程中，肌動(dòng)蛋白絲在細(xì)胞前端組裝，形成偽足結(jié)構(gòu)。偽足的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種信號(hào)分子和調(diào)節(jié)蛋白的參與。Rho家族小GTP酶（RhoA、Rac1和Cdc42）在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化中起著重要作用。當(dāng)VSMCs受到遷移信號(hào)刺激時(shí)，Rho家族小GTP酶被激活，它們通過調(diào)節(jié)下游的效應(yīng)分子，如Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK）、p21激活激酶（PAK）和Wiskott-Aldrich綜合征蛋白（WASP）等，影響肌動(dòng)蛋白絲的組裝和解聚。Rac1激活后，可通過PAK激活WASP，WASP與肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3（Arp2/3）復(fù)合物相互作用，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的分支和聚合，從而在細(xì)胞前端形成富含肌動(dòng)蛋白的偽足結(jié)構(gòu)。同時(shí)，RhoA激活ROCK，ROCK通過磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC），增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白之間的相互作用，產(chǎn)生收縮力，推動(dòng)細(xì)胞向前遷移。在細(xì)胞遷移過程中，偽足前端與ECM黏附，形成新的黏著斑，后端的黏著斑則逐漸解聚，使細(xì)胞脫離原來的附著點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的位移。細(xì)胞遷移還涉及多種蛋白和信號(hào)通路的協(xié)同作用?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類鋅依賴性內(nèi)肽酶，在VSMCs遷移過程中，MMPs可以降解ECM成分，為細(xì)胞遷移開辟通道。例如，MMP-2和MMP-9能夠降解膠原蛋白和明膠等ECM成分，使VSMCs更容易穿過ECM。MMPs的表達(dá)和活性受到多種因素的調(diào)控，包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子等。在動(dòng)脈粥樣硬化病變中，血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等生長(zhǎng)因子可以通過激活MAPK和PI3K等信號(hào)通路，上調(diào)MMPs的表達(dá)。此外，一些轉(zhuǎn)錄因子，如核因子-κB（NF-κB）和激活蛋白-1（AP-1），也參與了MMPs基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在信號(hào)通路方面，除了上述的Rho家族小GTP酶信號(hào)通路和MMPs相關(guān)信號(hào)通路外，PI3K-Akt信號(hào)通路在VSMCs遷移中也發(fā)揮著重要作用。PI3K被激活后，可將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP?）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP?），PIP?招募Akt到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的Akt通過調(diào)節(jié)下游的多種效應(yīng)分子，如糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和叉頭框蛋白O1（FoxO1）等，影響細(xì)胞的遷移。Akt可以抑制GSK3β的活性，穩(wěn)定β-連環(huán)蛋白（β-catenin），促進(jìn)細(xì)胞與ECM的黏附；還可以激活mTOR，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞代謝，為細(xì)胞遷移提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。VSMCs的遷移在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中起到了重要的促進(jìn)作用。遷移到內(nèi)膜下的VSMCs在局部增殖，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，逐漸形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。隨著斑塊的不斷增大，血管管腔逐漸狹窄，影響血液供應(yīng)。遷移的VSMCs還會(huì)改變血管壁的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，增加斑塊的不穩(wěn)定性，容易導(dǎo)致斑塊破裂，引發(fā)急性心血管事件，如心肌梗死、腦卒中等。因此，深入研究VSMCs遷移的機(jī)制，對(duì)于理解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)有效的治療策略具有重要意義。2.2.3表型轉(zhuǎn)化血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）的表型轉(zhuǎn)化在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色，是其重要的病理變化之一。正常生理狀態(tài)下，VSMCs處于收縮型表型，具有高收縮性、低增殖和低遷移能力，同時(shí)表達(dá)高水平的收縮型標(biāo)志物，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、平滑肌22α（SM22α）、鈣調(diào)蛋白（Calponin）等。這些收縮型標(biāo)志物在維持VSMCs的收縮功能和正常結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用。α-SMA是VSMCs收縮裝置的重要組成部分，它與肌球蛋白相互作用，產(chǎn)生收縮力，調(diào)節(jié)血管的張力；SM22α參與細(xì)胞骨架的穩(wěn)定和信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)維持VSMCs的形態(tài)和功能具有重要意義；Calponin則通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白的相互作用，影響VSMCs的收縮性。然而，在動(dòng)脈粥樣硬化等病理?xiàng)l件下，VSMCs會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。合成型VSMCs失去了正常的收縮功能，獲得高度增殖和遷移能力，同時(shí)分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白等。在表型轉(zhuǎn)化過程中，VSMCs的收縮型標(biāo)志物表達(dá)顯著下調(diào)，而合成型標(biāo)志物，如骨橋蛋白（OPN）、波形蛋白（Vimentin）等表達(dá)上調(diào)。OPN是一種分泌型磷酸化糖蛋白，在合成型VSMCs中高表達(dá)，它參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖，同時(shí)還具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的功能；Vimentin是一種中間絲蛋白，在合成型VSMCs中表達(dá)增加，它參與維持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并且在細(xì)胞的遷移和增殖過程中發(fā)揮重要作用。VSMCs表型轉(zhuǎn)化的過程受到多種因素的調(diào)控，其中細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子是重要的調(diào)節(jié)因素。在動(dòng)脈粥樣硬化病變中，血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)增加，它們通過與VSMCs表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，誘導(dǎo)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。PDGF與VSMCs表面的PDGF受體（PDGFR）結(jié)合后，激活下游的MAPK、PI3K-Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)VSMCs從收縮型向合成型轉(zhuǎn)化。MAPK通路中的ERK被激活后，可磷酸化并激活一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Jun、c-Fos等，這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)與表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)。PI3K-Akt信號(hào)通路則通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、增殖和代謝，促進(jìn)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。TGF-β與VSMCs表面的TGF-β受體結(jié)合后，激活Smad信號(hào)通路。TGF-β受體磷酸化激活Smad2和Smad3，它們與Smad4形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，促進(jìn)VSMCs合成型標(biāo)志物的表達(dá)，抑制收縮型標(biāo)志物的表達(dá)，從而誘導(dǎo)表型轉(zhuǎn)化。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)也在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。在動(dòng)脈粥樣硬化過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），導(dǎo)致氧化應(yīng)激。ROS可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路，誘導(dǎo)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。ROS激活MAPK通路中的p38和JNK，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和釋放，同時(shí)調(diào)節(jié)與表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)。NF-κB被激活后，進(jìn)入細(xì)胞核，上調(diào)炎癥因子和合成型標(biāo)志物的表達(dá)，下調(diào)收縮型標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等，也可以通過激活相應(yīng)的信號(hào)通路，誘導(dǎo)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。TNF-α與VSMCs表面的TNFR1結(jié)合，激活NF-κB和MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)VSMCs的增殖和表型轉(zhuǎn)化。VSMCs的表型轉(zhuǎn)化對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。合成型VSMCs的大量增殖和遷移，導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄，影響血液的正常流動(dòng)。合成型VSMCs分泌的大量細(xì)胞外基質(zhì)，使血管壁的硬度增加，彈性降低，進(jìn)一步加重了血管病變。合成型VSMCs還會(huì)釋放多種炎癥因子和細(xì)胞因子，加劇炎癥反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，合成型VSMCs的存在使得斑塊的穩(wěn)定性下降，容易破裂引發(fā)急性心血管事件，如心肌梗死、腦卒中等。因此，深入研究VSMCs表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制，對(duì)于揭示動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。2.3研究血管平滑肌細(xì)胞與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系的模型與方法2.3.1細(xì)胞模型高濃度血清誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的細(xì)胞模型是研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制及抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物作用的常用體外模型。在構(gòu)建該模型時(shí)，通常選用人臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HUVSMCs）或大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（RASMCs）。這些細(xì)胞具有典型的血管平滑肌細(xì)胞特征，易于培養(yǎng)和操作。在細(xì)胞培養(yǎng)方面，將細(xì)胞接種于含10%-20%胎牛血清的DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。為了構(gòu)建高濃度血清誘導(dǎo)的細(xì)胞模型，一般采用20%-30%的高濃度血清進(jìn)行刺激。具體操作如下，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管平滑肌細(xì)胞接種于96孔板或6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，更換為含不同濃度血清的培養(yǎng)基，如設(shè)置20%、25%、30%等不同血清濃度梯度，同時(shí)設(shè)置正常血清濃度（如10%）作為對(duì)照組。細(xì)胞增殖檢測(cè)是評(píng)估模型效果的重要指標(biāo)之一。常用的檢測(cè)方法包括CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)等。CCK-8法的原理是利用細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8試劑中的四唑鹽還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，其生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。在實(shí)驗(yàn)中，將CCK-8試劑按一定比例加入培養(yǎng)孔中，孵育一定時(shí)間后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值，通過比較不同組的吸光度值來判斷細(xì)胞增殖情況。EdU摻入實(shí)驗(yàn)則是利用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）能夠在DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中，通過熒光標(biāo)記的疊氮化物與EdU發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，從而可以在熒光顯微鏡下直接觀察到正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)量來評(píng)估細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞遷移檢測(cè)可采用Transwell實(shí)驗(yàn)。Transwell小室由上下兩層組成，上層為聚碳酸酯膜，膜上有許多小孔，下層為培養(yǎng)液。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，將細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上層，下層加入含高濃度血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)一定時(shí)間后，用棉簽輕輕擦去小室上層未遷移的細(xì)胞，將遷移到下層的細(xì)胞固定、染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞的數(shù)量，以此來評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。通過比較不同組的遷移細(xì)胞數(shù)量，可以判斷高濃度血清對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)作用。通過上述方法構(gòu)建的高濃度血清誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的細(xì)胞模型，能夠較好地模擬動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過程中血管平滑肌細(xì)胞的異常變化，為后續(xù)抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分的篩選和作用機(jī)制研究提供了有效的實(shí)驗(yàn)工具。2.3.2動(dòng)物模型動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型在研究血管平滑肌細(xì)胞與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系以及抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物研發(fā)中具有不可或缺的作用，它能夠在整體水平上模擬人類動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程，為深入探究疾病機(jī)制和藥物療效評(píng)估提供重要依據(jù)。目前，常用的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型主要包括以下幾種類型。高脂飼料誘導(dǎo)的動(dòng)物模型是最為經(jīng)典和常用的模型之一。以家兔為例，通常給予家兔高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)，飼料中一般含有1%-2%膽固醇、5%-10%豬油和88%-94%基礎(chǔ)飼料。經(jīng)過8-12周的喂養(yǎng)，家兔血液中的膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平顯著升高，血管壁逐漸出現(xiàn)脂質(zhì)沉積、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等病理變化，形成典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。在大鼠模型中，除了高脂飼料外，還可添加蛋黃粉、膽鹽、抗甲狀腺藥物等，以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成。例如，一次性腹腔注射維生素D?60萬IU/kg并飼喂含3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料的高脂飼料4周后，大鼠主動(dòng)脈可出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。這種模型的優(yōu)點(diǎn)是制作方法相對(duì)簡(jiǎn)單、成本較低，能夠較好地模擬人類動(dòng)脈粥樣硬化的脂質(zhì)代謝紊亂和斑塊形成過程。然而，其也存在一定局限性，如與人類動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制和病理特征不完全一致，病變主要發(fā)生在主動(dòng)脈等大血管，而冠狀動(dòng)脈等中小血管病變相對(duì)較少?；蚯贸齽?dòng)物模型為研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制提供了獨(dú)特的視角。載脂蛋白E（ApoE）基因敲除小鼠和低密度脂蛋白受體（LDLR）基因敲除小鼠是目前應(yīng)用最為廣泛的兩種基因敲除模型。ApoE在脂蛋白代謝中起著關(guān)鍵作用，它能夠與細(xì)胞表面的ApoE受體結(jié)合，促進(jìn)脂蛋白的清除。ApoE基因敲除小鼠由于缺乏ApoE，血液中脂蛋白代謝紊亂，膽固醇和甘油三酯水平顯著升高，在普通飲食條件下即可自發(fā)形成動(dòng)脈粥樣硬化病變，且病變部位廣泛，包括主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈等。LDLR基因敲除小鼠則由于LDLR缺失，導(dǎo)致LDL-C不能正常被肝臟攝取和代謝，血液中LDL-C水平升高，在高脂飲食誘導(dǎo)下，動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)展更為迅速和嚴(yán)重?；蚯贸齽?dòng)物模型的優(yōu)勢(shì)在于其發(fā)病機(jī)制明確，能夠精準(zhǔn)地研究特定基因在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用。但是，該模型制作成本較高，技術(shù)要求復(fù)雜，且由于基因背景單一，可能無法完全模擬人類動(dòng)脈粥樣硬化的多基因遺傳特性。免疫損傷動(dòng)物模型通過免疫刺激誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化病變。以注射牛血清法為例，給兔一次性靜脈注射牛血清蛋白250mg/kg，并飼喂含30%膽固醇、10%豬油、2%脫氧膽酸鈉、2%丙硫氧嘧啶的高脂飼料6周，肉眼和光鏡均可見動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。這種模型能在較短時(shí)間內(nèi)建立典型的動(dòng)脈粥樣硬化病變，模型較為可靠實(shí)用。然而，免疫損傷模型的病變機(jī)制與人類自然發(fā)病過程存在差異，且免疫反應(yīng)的個(gè)體差異可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定。機(jī)械損傷動(dòng)物模型主要通過對(duì)血管進(jìn)行機(jī)械性損傷，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成。例如，采用球囊損傷法，兔喂服含1.0%膽固醇和6%豬油的顆粒飼料一周后，實(shí)施頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)，術(shù)后每天每只繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料120g，8周后動(dòng)脈可出現(xiàn)典型的動(dòng)脈粥樣硬化病變。該模型能夠模擬血管介入治療后血管再狹窄的過程，對(duì)于研究血管平滑肌細(xì)胞在血管損傷修復(fù)和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中的作用具有重要意義。但其操作相對(duì)復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高，且不同個(gè)體的血管損傷程度難以完全一致，可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在研究血管平滑肌細(xì)胞與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系時(shí)，動(dòng)物模型可用于觀察血管平滑肌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化等變化。通過組織學(xué)染色，如蘇木精-伊紅（HE）染色、Masson染色等，可以觀察血管壁的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)變化；免疫組織化學(xué)染色可檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、骨橋蛋白（OPN）等的表達(dá)，以確定平滑肌細(xì)胞的表型和分布。利用這些動(dòng)物模型還可以評(píng)估抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物對(duì)血管平滑肌細(xì)胞功能的影響，為藥物研發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。2.3.3檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)在研究血管平滑肌細(xì)胞與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系中起著關(guān)鍵作用，能夠直觀反映細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖能力，為評(píng)估抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分的作用提供重要依據(jù)。CCK-8法是一種常用的細(xì)胞增殖檢測(cè)方法，其原理基于細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可將CCK-8試劑中的四唑鹽還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，且生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。在實(shí)驗(yàn)操作中，將血管平滑肌細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)一定時(shí)間后，向每孔加入適量CCK-8試劑，孵育1-4小時(shí)，隨后使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值。通過比較不同處理組的吸光度值，可判斷細(xì)胞增殖情況。若某抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分處理組的吸光度值顯著低于對(duì)照組，則表明該成分可能抑制了細(xì)胞增殖。EdU摻入實(shí)驗(yàn)也是一種有效的細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）能在DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將細(xì)胞與EdU孵育一段時(shí)間后，利用熒光標(biāo)記的疊氮化物與EdU發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，在熒光顯微鏡下可直接觀察到正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞。通過計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)量，能準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。與傳統(tǒng)的BrdU檢測(cè)方法相比，EdU摻入實(shí)驗(yàn)無需進(jìn)行DNA變性處理，操作更簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞損傷小，且檢測(cè)靈敏度高。細(xì)胞遷移檢測(cè)技術(shù)對(duì)于研究動(dòng)脈粥樣硬化過程中血管平滑肌細(xì)胞的遷移行為至關(guān)重要，有助于揭示疾病的發(fā)展機(jī)制和抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物的作用靶點(diǎn)。Transwell實(shí)驗(yàn)是常用的細(xì)胞遷移檢測(cè)方法之一。Transwell小室由上下兩層組成，上層為聚碳酸酯膜，膜上有許多小孔，下層為培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將血管平滑肌細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上層，下層加入含趨化因子（如高濃度血清或生長(zhǎng)因子）的培養(yǎng)基。培養(yǎng)一定時(shí)間后，用棉簽輕輕擦去小室上層未遷移的細(xì)胞，將遷移到下層的細(xì)胞固定、染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞的數(shù)量。若某抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分處理組的遷移細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，則說明該成分可能抑制了細(xì)胞遷移。劃痕實(shí)驗(yàn)也是一種簡(jiǎn)單直觀的細(xì)胞遷移檢測(cè)方法。在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞至融合狀態(tài)，用無菌槍頭在細(xì)胞單層上劃一道“劃痕”，然后更換為含不同處理因素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)（如0h、24h、48h），通過顯微鏡觀察并拍照記錄劃痕寬度的變化。根據(jù)劃痕愈合的程度，可評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。若某成分處理組的劃痕愈合速度明顯慢于對(duì)照組，則表明該成分可能對(duì)細(xì)胞遷移具有抑制作用。細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化檢測(cè)技術(shù)能夠明確血管平滑肌細(xì)胞在不同條件下的表型變化，為研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制和抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物的作用機(jī)制提供關(guān)鍵信息。免疫熒光染色是檢測(cè)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的常用方法之一。通過使用針對(duì)收縮型標(biāo)志物（如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白α-SMA、平滑肌22αSM22α）和合成型標(biāo)志物（如骨橋蛋白OPN、波形蛋白Vimentin）的特異性抗體，結(jié)合熒光標(biāo)記的二抗，在熒光顯微鏡下可觀察細(xì)胞中這些標(biāo)志物的表達(dá)情況。正常收縮型血管平滑肌細(xì)胞中，α-SMA和SM22α表達(dá)較高，呈現(xiàn)強(qiáng)熒光信號(hào)；而在發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的合成型細(xì)胞中，OPN和Vimentin表達(dá)上調(diào)，熒光信號(hào)增強(qiáng)。通過比較不同處理組細(xì)胞中這些標(biāo)志物的熒光強(qiáng)度和分布，可判斷細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的程度。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)可從蛋白質(zhì)水平定量檢測(cè)細(xì)胞表型標(biāo)志物的表達(dá)變化。提取不同處理組血管平滑肌細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜或硝酸纖維素膜上。用特異性抗體與膜上的目標(biāo)蛋白結(jié)合，再用相應(yīng)的二抗孵育，最后通過化學(xué)發(fā)光法或顯色法檢測(cè)條帶。根據(jù)條帶的灰度值，可對(duì)收縮型和合成型標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行定量分析。若某抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分處理后，收縮型標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，合成型標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，則提示該成分可能抑制了血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。在相關(guān)分子機(jī)制研究方面，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)可用于檢測(cè)與細(xì)胞增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以GAPDH等管家基因?yàn)閮?nèi)參，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)基因。通過比較不同處理組目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。例如，在研究某抗動(dòng)脈粥樣硬化成分對(duì)細(xì)胞增殖的影響時(shí)，可檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）等相關(guān)基因的表達(dá)變化。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)不僅可用于檢測(cè)細(xì)胞表型標(biāo)志物，還能深入研究信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化水平，從而揭示抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分的作用機(jī)制。如在研究某成分對(duì)Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路的影響時(shí)，可檢測(cè)Ras、Raf、MEK、ERK等蛋白的總表達(dá)量以及磷酸化形式（p-Ras、p-Raf、p-MEK、p-ERK）的表達(dá)變化。若某成分處理后，p-ERK等關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平降低，則表明該成分可能抑制了Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路的激活，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和遷移等功能。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)可用于研究轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況，對(duì)于揭示基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有重要意義。在研究血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的調(diào)控時(shí)，可使用針對(duì)特定轉(zhuǎn)錄因子（如核因子-κBNF-κB、激活蛋白-1AP-1）的抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀，富集與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA片段。然后通過PCR或高通量測(cè)序技術(shù)，分析這些DNA片段中是否包含目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，以及轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合強(qiáng)度變化。若某抗動(dòng)脈粥樣硬化成分處理后，轉(zhuǎn)錄因子與促進(jìn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因啟動(dòng)子的結(jié)合減弱，則提示該成分可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來抑制細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。三、抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分篩選3.1篩選策略與方法3.1.1基于細(xì)胞模型的篩選策略本研究以血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移模型為基礎(chǔ)，構(gòu)建高效的抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分篩選體系。利用高濃度血清或血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）刺激血管平滑肌細(xì)胞，誘導(dǎo)其異常增殖和遷移，模擬動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中血管平滑肌細(xì)胞的病理變化。將待篩選的天然產(chǎn)物提取物和合成化合物作用于上述細(xì)胞模型，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，若某成分處理組的細(xì)胞數(shù)量明顯低于對(duì)照組，且CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞增殖活性受到顯著抑制，則初步判斷該成分具有潛在的抗動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞增殖活性。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，通過Transwell實(shí)驗(yàn)或劃痕實(shí)驗(yàn)，若某成分處理組的遷移細(xì)胞數(shù)量減少或劃痕愈合速度減慢，表明該成分可能抑制了細(xì)胞遷移。為了進(jìn)一步確定篩選得到的活性成分的抗動(dòng)脈粥樣硬化潛力，還需對(duì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化進(jìn)行檢測(cè)。采用免疫熒光染色和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等技術(shù)，檢測(cè)收縮型標(biāo)志物（如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白α-SMA、平滑肌22αSM22α）和合成型標(biāo)志物（如骨橋蛋白OPN、波形蛋白Vimentin）的表達(dá)變化。若某成分能夠上調(diào)收縮型標(biāo)志物的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)合成型標(biāo)志物的表達(dá)，則提示該成分可能抑制了血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，具有潛在的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。通過對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化的綜合檢測(cè)，篩選出對(duì)血管平滑肌細(xì)胞異常變化具有顯著抑制作用的成分，為后續(xù)抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制研究和藥物研發(fā)提供重要的先導(dǎo)化合物。3.1.2活性檢測(cè)方法MTT法是一種廣泛應(yīng)用的檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的方法，其原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中。而死細(xì)胞由于缺乏該酶活性，無法進(jìn)行還原反應(yīng)。二甲基亞砜（DMSO）等有機(jī)溶劑能夠溶解細(xì)胞中的甲瓚，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，吸光度值與活細(xì)胞數(shù)量成正比，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，可間接反映細(xì)胞的增殖情況。在抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分篩選中，將不同濃度的待篩選成分加入培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入MTT試劑，繼續(xù)孵育，然后加入DMSO溶解甲瓚，測(cè)定吸光度值。若某成分處理組的吸光度值顯著低于對(duì)照組，則表明該成分可能抑制了細(xì)胞增殖。BrdU摻入法利用5-溴-2'-脫氧尿嘧啶（BrdU）作為胸腺嘧啶的類似物，在DNA合成期（S期），細(xì)胞會(huì)攝取BrdU并將其摻入到新合成的DNA中。通過特異性抗體與摻入DNA中的BrdU結(jié)合，再利用免疫熒光或酶聯(lián)免疫吸附等方法進(jìn)行檢測(cè)，可判斷細(xì)胞是否處于增殖狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)過程中，將細(xì)胞與BrdU孵育一段時(shí)間，然后固定細(xì)胞，用DNA酶處理使DNA變性，暴露BrdU抗原決定簇，再加入抗BrdU抗體，結(jié)合相應(yīng)的檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)。若某成分處理組中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，則提示該成分可能抑制了細(xì)胞增殖。Transwell小室法常用于檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。Transwell小室由上下兩層組成，上層為聚碳酸酯膜，膜上有許多小孔，下層為培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將血管平滑肌細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上層，下層加入含趨化因子（如高濃度血清或生長(zhǎng)因子）的培養(yǎng)基。細(xì)胞在趨化因子的作用下，會(huì)穿過小孔向底層遷移。培養(yǎng)一定時(shí)間后，用棉簽輕輕擦去小室上層未遷移的細(xì)胞，將遷移到下層的細(xì)胞固定、染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞的數(shù)量。若某成分處理組的遷移細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，則說明該成分可能抑制了細(xì)胞遷移。劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單直觀的檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的方法。在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞至融合狀態(tài)，用無菌槍頭在細(xì)胞單層上劃一道“劃痕”，然后更換為含不同處理因素（如待篩選成分）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)（如0h、24h、48h），通過顯微鏡觀察并拍照記錄劃痕寬度的變化。根據(jù)劃痕愈合的程度，可評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。若某成分處理組的劃痕愈合速度明顯慢于對(duì)照組，則表明該成分可能對(duì)細(xì)胞遷移具有抑制作用。免疫熒光染色可用于檢測(cè)細(xì)胞表型標(biāo)志物的表達(dá)，從而判斷血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化情況。針對(duì)收縮型標(biāo)志物（如α-SMA、SM22α）和合成型標(biāo)志物（如OPN、Vimentin），分別使用相應(yīng)的特異性一抗與細(xì)胞孵育，然后加入熒光標(biāo)記的二抗，在熒光顯微鏡下觀察。正常收縮型血管平滑肌細(xì)胞中，α-SMA和SM22α表達(dá)較高，呈現(xiàn)強(qiáng)熒光信號(hào)；而在發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的合成型細(xì)胞中，OPN和Vimentin表達(dá)上調(diào)，熒光信號(hào)增強(qiáng)。通過比較不同處理組細(xì)胞中這些標(biāo)志物的熒光強(qiáng)度和分布，可判斷細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的程度。若某成分處理組中收縮型標(biāo)志物熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，合成型標(biāo)志物熒光強(qiáng)度減弱，則提示該成分可能抑制了細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)從蛋白質(zhì)水平定量檢測(cè)細(xì)胞表型標(biāo)志物以及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化。提取不同處理組血管平滑肌細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜或硝酸纖維素膜上。用特異性抗體與膜上的目標(biāo)蛋白結(jié)合，再用相應(yīng)的二抗孵育，最后通過化學(xué)發(fā)光法或顯色法檢測(cè)條帶。根據(jù)條帶的灰度值，可對(duì)目標(biāo)蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析。在抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分研究中，通過檢測(cè)與細(xì)胞增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，可深入探討成分的作用機(jī)制。例如，檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）等與細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)；檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等與細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)；檢測(cè)α-SMA、OPN等細(xì)胞表型標(biāo)志物的表達(dá)。若某成分處理后，Cyclins、CDKs表達(dá)下調(diào)，CKIs表達(dá)上調(diào)，提示該成分可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白抑制細(xì)胞增殖；若MMPs表達(dá)下調(diào)，可能抑制了細(xì)胞遷移；若α-SMA表達(dá)上調(diào)，OPN表達(dá)下調(diào)，則可能抑制了細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。3.2候選功效成分來源與選擇依據(jù)3.2.1天然產(chǎn)物來源天然產(chǎn)物來源廣泛，涵蓋植物、動(dòng)物和微生物等多個(gè)領(lǐng)域，為抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分的篩選提供了豐富的資源。植物作為天然產(chǎn)物的重要來源之一，含有多種具有抗動(dòng)脈粥樣硬化活性的化學(xué)成分。黃酮類化合物是植物中廣泛存在的一類次生代謝產(chǎn)物，具有多種生物活性。槲皮素作為一種常見的黃酮類化合物，在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面表現(xiàn)出顯著的效果。研究表明，槲皮素可通過抑制氧化應(yīng)激，減少活性氧（ROS）的產(chǎn)生，降低脂質(zhì)過氧化水平，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化損傷。槲皮素還能抑制炎癥反應(yīng)，下調(diào)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。在對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的作用方面，槲皮素可抑制其增殖和遷移，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而減少細(xì)胞增殖；同時(shí)，槲皮素還能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移。萜類化合物也是植物中重要的抗動(dòng)脈粥樣硬化成分。丹參中的丹參酮屬于萜類化合物，具有多種藥理作用。丹參酮能夠抗氧化，清除體內(nèi)的自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。它還具有抗炎作用，可抑制核因子-κB