大腸桿菌檢測(cè)方法步驟2025-12-05匯報(bào)人：目錄樣品采集與處理培養(yǎng)基制備與選擇接種與培養(yǎng)菌落特征鑒定分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析與報(bào)告樣品采集與處理01樣品采集方法無(wú)菌操作規(guī)范采集水樣、食品或臨床標(biāo)本時(shí)需使用滅菌容器和工具，避免環(huán)境微生物污染。水樣采集需選擇代表性點(diǎn)位，食品樣本應(yīng)從不同部位取樣；臨床標(biāo)本如糞便、尿液需用專(zhuān)用無(wú)菌容器，血液培養(yǎng)需消毒皮膚后靜脈穿刺。采樣量控制液體樣品通常需100-250ml，固體食品取25-50g，血液培養(yǎng)成人每次8-10ml。糞便樣本選取黏液或膿血部分，尿液需清潔中段尿，采樣后立即密封并標(biāo)記信息，防止交叉污染或變質(zhì)。微生物易降解的樣品（如糞便、尿液）需4℃冷藏運(yùn)輸，時(shí)間不超過(guò)24小時(shí)；血液培養(yǎng)瓶需室溫避光保存，避免冷凍導(dǎo)致細(xì)胞破裂。水樣若含余氯需加入硫代硫酸鈉中和，食品樣本需防止溫度波動(dòng)導(dǎo)致微生物增殖或死亡。冷鏈運(yùn)輸要求糞便樣本2小時(shí)內(nèi)送檢，尿液冷藏保存不超過(guò)6小時(shí)；食品和水樣在4℃下保存不超過(guò)30小時(shí)。特殊檢測(cè)（如PCR）需-70℃冷凍保存核酸提取物，避免反復(fù)凍融降解DNA。保存時(shí)限控制樣品運(yùn)輸與保存樣品前處理步驟選擇性增菌部分檢測(cè)需預(yù)增菌（如乳糖肉湯37℃培養(yǎng)6-8小時(shí)），提高目標(biāo)菌濃度。水樣可通過(guò)膜過(guò)濾法富集細(xì)菌，食品樣本可能需添加抗生素抑制雜菌，臨床標(biāo)本直接接種選擇性培養(yǎng)基（如麥康凱瓊脂）。均質(zhì)化處理固體食品需加入無(wú)菌緩沖液勻漿（如磷酸鹽緩沖液），液體樣品振蕩混勻。糞便樣本用生理鹽水稀釋后過(guò)濾去除殘?jiān)?，尿液樣本離心取沉淀，血液樣本直接注入培養(yǎng)瓶無(wú)需處理。培養(yǎng)基制備與選擇02常用培養(yǎng)基類(lèi)型含有伊紅Y和美藍(lán)染料，能抑制革蘭陽(yáng)性菌生長(zhǎng)，大腸桿菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸形成黑色帶金屬光澤菌落，是腸道菌分離鑒定的首選培養(yǎng)基。01含膽鹽和結(jié)晶紫選擇性抑制非腸道菌，中性紅指示劑使乳糖發(fā)酵菌落呈粉紅色，常用于區(qū)分致病性大腸桿菌與非致病性菌株。02營(yíng)養(yǎng)瓊脂基礎(chǔ)非選擇性培養(yǎng)基，用于細(xì)菌增殖和菌落形態(tài)觀察，需結(jié)合生化試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定大腸桿菌。03含5%-10%脫纖維羊血，可觀察溶血現(xiàn)象，用于分離苛養(yǎng)菌或檢測(cè)大腸桿菌的溶血特性。04強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基含膽鹽、枸櫞酸鹽和煌綠，抑制非沙門(mén)菌屬細(xì)菌，用于糞便樣本中致病性大腸桿菌的分離。05麥康凱瓊脂SS瓊脂血瓊脂平板伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）培養(yǎng)基配制方法成分稱(chēng)量與溶解精確稱(chēng)量培養(yǎng)基干粉（如EMB瓊脂40g/L），加入蒸餾水加熱煮沸至完全溶解，避免局部焦化影響營(yíng)養(yǎng)成分。pH調(diào)節(jié)與分裝冷卻至50℃時(shí)用pH計(jì)校準(zhǔn)至7.2±0.2，分裝至無(wú)菌培養(yǎng)皿或試管，每平皿15-20ml保證厚度均勻。高壓滅菌處理121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘，含糖培養(yǎng)基需115℃滅菌10分鐘以防止碳化，滅菌后立即取出避免過(guò)熱。無(wú)菌檢查與保存隨機(jī)抽取5%滅菌培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24小時(shí)確認(rèn)無(wú)菌生長(zhǎng)，密封后4℃避光保存不超過(guò)1個(gè)月。培養(yǎng)基質(zhì)量控制生長(zhǎng)性能測(cè)試接種標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌ATCC25922，37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)后應(yīng)呈現(xiàn)典型菌落形態(tài)（如EMB上金屬光澤菌落），菌落計(jì)數(shù)需達(dá)預(yù)期回收率。理化指標(biāo)檢測(cè)包括pH值（7.2-7.6）、含水量（≤10%）、凝膠強(qiáng)度（≥300g/cm2）等，確保培養(yǎng)基物理特性符合標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)接種金黃色葡萄球菌ATCC25923，觀察是否被有效抑制，合格標(biāo)準(zhǔn)為非目標(biāo)菌落數(shù)減少≥99%。選擇性驗(yàn)證接種與培養(yǎng)03接種方法（涂布/劃線）將稀釋后的樣品均勻涂布在固體培養(yǎng)基表面，適用于菌落計(jì)數(shù)和分離單一菌落。涂布法通過(guò)分區(qū)劃線逐步稀釋樣品，最終獲得單菌落，常用于純化菌種或分離混合菌群。劃線法將樣品與熔化的瓊脂培養(yǎng)基混合后傾注平皿，適用于厭氧菌或需均勻分布的菌落檢測(cè)。傾注法恒溫控制必須使用精度±0.5℃的培養(yǎng)箱，37℃最適合大腸桿菌生長(zhǎng)，溫度超過(guò)40℃會(huì)導(dǎo)致菌體蛋白變性。培養(yǎng)時(shí)間常規(guī)培養(yǎng)18-24小時(shí)，延時(shí)至48小時(shí)可觀察典型菌落特征。血液標(biāo)本需先增菌培養(yǎng)12小時(shí)再轉(zhuǎn)種平板。氣體環(huán)境普通需氧培養(yǎng)即可，苛養(yǎng)菌株需補(bǔ)充5%CO?。厭氧培養(yǎng)需使用厭氧罐配合產(chǎn)氣袋。濕度維持培養(yǎng)箱內(nèi)放置無(wú)菌蒸餾水保持70%濕度，防止培養(yǎng)基干裂影響菌落形態(tài)觀察。避光要求伊紅美藍(lán)等光敏培養(yǎng)基需用錫箔紙包裹平板，避免紫外線分解染料影響顯色。培養(yǎng)條件（溫度/時(shí)間）0102030405培養(yǎng)過(guò)程觀察生長(zhǎng)曲線每2小時(shí)測(cè)定OD600值，繪制對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期曲線，標(biāo)準(zhǔn)菌株代時(shí)應(yīng)為20-30分鐘。溶血特征在血瓊脂平板上呈現(xiàn)β溶血環(huán)（完全透明溶血）或γ溶血（不溶血）。菌落形態(tài)學(xué)觀察黑色帶金屬光澤的典型菌落（直徑2-3mm），邊緣整齊濕潤(rùn)，EMB平板上呈虹彩狀反光。菌落特征鑒定04典型菌落形態(tài)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基菌落為灰白色，圓形凸起，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，直徑約2-4mm。EMB瓊脂培養(yǎng)基菌落呈黑色或深紫色，帶有金屬光澤，中心顏色較深，邊緣較淺。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基大腸桿菌菌落呈粉紅色至紅色，直徑約1-3mm，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)。吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性大腸桿菌能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，加入柯凡克試劑后形成玫瑰紅色復(fù)合物，此為鑒別大腸桿菌的重要指標(biāo)之一。糖發(fā)酵試驗(yàn)?zāi)馨l(fā)酵葡萄糖、乳糖等多種糖類(lèi)并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在糖發(fā)酵管中可見(jiàn)培養(yǎng)基變黃且倒置小管內(nèi)出現(xiàn)氣泡，此特性可與志賀菌等非產(chǎn)氣菌區(qū)分。甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性大腸桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生穩(wěn)定酸性終產(chǎn)物，使甲基紅指示劑在pH≤4.5時(shí)保持紅色，區(qū)別于產(chǎn)氣腸桿菌等甲基紅陰性菌。IMViC試驗(yàn)?zāi)Ｊ降湫徒Y(jié)果為++--（吲哚+、甲基紅+、VP-、檸檬酸鹽-），此組合可用于與腸桿菌科其他菌屬的鑒別診斷。生化反應(yīng)檢測(cè)選擇性培養(yǎng)基驗(yàn)證麥康凱瓊脂選擇性含膽鹽和結(jié)晶紫能抑制革蘭陽(yáng)性菌生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)乳糖發(fā)酵和中性紅指示劑區(qū)分乳糖發(fā)酵菌（如大腸桿菌）與非發(fā)酵菌（如沙門(mén)菌）。伊紅和美藍(lán)染料不僅抑制革蘭陽(yáng)性菌，還能與乳糖發(fā)酵產(chǎn)物反應(yīng)形成特征性金屬光澤，是分離腸道致病菌的經(jīng)典培養(yǎng)基。新型顯色培養(yǎng)基如ChromID大腸桿菌瓊脂，通過(guò)酶底物反應(yīng)使大腸桿菌呈現(xiàn)藍(lán)色菌落，顯著提高鑒定效率和準(zhǔn)確性。EMB瓊脂特異性顯色培養(yǎng)基應(yīng)用分子生物學(xué)檢測(cè)05PCR擴(kuò)增檢測(cè)采用CTAB法或商業(yè)試劑盒從樣本中提取高質(zhì)量DNA，注意避免核酸酶污染，提取后需用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度（A260/A280比值1.8-2.0為佳）。模板DNA提取針對(duì)大腸桿菌uidA或stx基因設(shè)計(jì)引物，Mg2?濃度通?？刂圃?.5-3.0mM，dNTPs濃度為200μM，Taq酶用量0.5-1U/μl，循環(huán)參數(shù)設(shè)置94℃預(yù)變性5分鐘，后續(xù)30-40個(gè)循環(huán)（94℃30秒→55-60℃30秒→72℃1分鐘）。反應(yīng)體系優(yōu)化通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段大小，陽(yáng)性樣本應(yīng)出現(xiàn)預(yù)期條帶，必要時(shí)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證以確保擴(kuò)增特異性，避免非特異性條帶干擾結(jié)果判定。產(chǎn)物分析與驗(yàn)證測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建原始數(shù)據(jù)經(jīng)Trimmomatic質(zhì)控后，使用Bowtie2比對(duì)到大腸桿菌參考基因組（如K-12MG1655），SNP檢測(cè)采用GATK流程，毒力基因鑒定需比對(duì)VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)，耐藥基因分析參考CARD數(shù)據(jù)庫(kù)。生物信息學(xué)分析結(jié)果解讀與報(bào)告重點(diǎn)關(guān)注毒力基因（如stx1/stx2、eae）、耐藥基因（如blaCTX-M、mcr-1）的攜帶情況，結(jié)合MLST分型結(jié)果（如ST131型）評(píng)估菌株致病潛力，報(bào)告需注明檢測(cè)靈敏度和覆蓋度等質(zhì)控參數(shù)。使用Illumina平臺(tái)需進(jìn)行DNA片段化、末端修復(fù)、加A尾和接頭連接，片段大小選擇300-500bp，文庫(kù)濃度需達(dá)到2nM以上，質(zhì)檢合格后方可上機(jī)測(cè)序。基因測(cè)序分析選擇保守且特異的基因區(qū)域（如uidA編碼β-葡萄糖醛酸酶），通過(guò)BLAST比對(duì)排除與其他菌種的同源性（E值<1e-5），毒力株檢測(cè)需額外針對(duì)stx、eae等毒力因子設(shè)計(jì)引物。特異性引物設(shè)計(jì)靶基因篩選長(zhǎng)度18-22bp，GC含量40-60%，Tm值55-65℃（上下游差值≤2℃），避免連續(xù)4個(gè)以上相同堿基或3'端發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使用Primer-BLAST驗(yàn)證特異性，必要時(shí)添加GC夾提高擴(kuò)增效率。引物參數(shù)優(yōu)化通過(guò)梯度PCR確定最佳退火溫度，用10?-10?CFU/ml梯度稀釋菌液驗(yàn)證檢測(cè)限，交叉試驗(yàn)驗(yàn)證與志賀菌、沙門(mén)菌等近緣菌的無(wú)交叉反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）確保實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果可比性。驗(yàn)證與標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果分析與報(bào)告06通過(guò)概率統(tǒng)計(jì)處理多管發(fā)酵結(jié)果，使用三稀釋度（如0.1g/mL、0.01g/mL、0.001g/mL）的陽(yáng)性管數(shù)查MPN檢索表。當(dāng)陽(yáng)性管組合為3-2-1時(shí)，對(duì)應(yīng)95%置信區(qū)間為15-54MPN/g。MPN法計(jì)算原理選取菌落數(shù)30-300CFU的平板，按公式（∑C/[n1+0.1n2]×d）計(jì)算。其中C為各平板菌落數(shù)，n1為低稀釋度平板數(shù)，n2為高稀釋度平板數(shù)，d為最低稀釋度因子。平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)0102數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法陽(yáng)性/陰性判定標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣雙重指標(biāo)在LST肉湯中發(fā)酵管需同時(shí)出現(xiàn)黃色（pH≤6.0）和杜氏小管氣泡聚集，且革蘭染色為無(wú)芽孢陰性短桿菌。BGLB驗(yàn)證管產(chǎn)氣量需≥10%管體積。排除假陽(yáng)性干擾對(duì)氧化酶陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性的菌株需進(jìn)一步做IMViC試驗(yàn)（++--或-+-+為典型大腸菌群），排除假單胞菌等干擾菌。酶底物反應(yīng)閾值β-半乳糖苷酶分解MUGal產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度需≥100RLU（相對(duì)光單位），或Aliz-gal顯色需在37℃培養(yǎng)18h內(nèi)形成直徑≥0.