DB51I 2 2 3 3 5 6 8 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出、歸口、解釋并組織實(shí)施。本文件主要起草人：張煥容、楊發(fā)龍、張凱、陳果。1鵝星狀病毒病診斷與防控技術(shù)規(guī)范病變、分子生物學(xué)診斷、病毒分離鑒定等診斷依據(jù)，以GB/T45093水禽新型星狀病毒病診斷NY/T541獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范鵝星狀病毒病gooseastrovirusdisease該病毒主要感染1周~3周齡雛鵝，病鵝主要表現(xiàn)為4縮略語Ct值：循環(huán)閾值（CycleThresGoAstV：鵝星狀病毒（GooseAstroviLMH：雞肝癌細(xì)胞系（ChickenHepatomaCellLPBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSalineBuffRNA：核糖核酸（RibonucleicRT-PCR：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReverseTranscription-PolymeraseChainReacRT-qPCR：實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（Real-TimeQuantitativeReverseTranscriptioTAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸緩沖液(Tris-aceticacid-EDTABuffe2病鵝、隱性帶毒鵝、帶毒種蛋是主要傳染源，自然感染潛伏期3d左右，既可垂直傳播，也可水平RNA保存液中，-20℃或以下保存。所有樣品應(yīng)在48h內(nèi)完成運(yùn)輸。隨后，按照附錄A或使用等效的商業(yè)（W/V)比例混合并磨碎，反復(fù)凍融三次，8000r/m、4℃離心15min后取上清，3吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用無菌PBS洗滌細(xì)胞3次后，將7.5.1處理好的樣品1mL接種到25cm2細(xì)胞瓶的單取7.5.1中處理的樣品液每胚0.5mL接種鵝胚尿囊腔，同時(shí)設(shè)生理鹽水接種對(duì)照胚，置于孵化器中37℃下孵育并每天觀察鵝胚2次～3次。棄未死亡鵝胚觀察5d后，于4℃冰箱過夜后收獲合成cDNA后作為模板，用7.3或7.4的方法檢測，其余尿囊液和胚體樣品Ct值在30.0～35.0之間，若重復(fù)雙孔病鵝癥狀與6.1、6.2和6.3中所描述相符或部分相符，且實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果陽性者，判定為鵝星狀病49.1預(yù)防措施9.1.1加強(qiáng)飼養(yǎng)管理9.2疫情處置對(duì)病鵝污染的場所、用具、物品等徹底消毒。對(duì)鵝舍地面和糞便溝槽清潔后消毒，可采用3%～5%的來蘇爾溶液噴霧消毒，或用20%的生石灰涂墻和地面消毒。飼養(yǎng)用具、料槽和水槽等可采用5%～10%的熱堿水或3%的苛性鈉溶液或3%～5%的來蘇爾溶液洗滌消毒，消毒后2h～9.2.3無害化處理病死鵝必須按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于《病死及病害動(dòng)物無害5A.1.1取300μL樣品處理液置于1.5mL去酶EP管中，加入700μA.1.3棄上清，加入1mL75%DEPC冰乙醇洗滌一次，4℃12000r/m離心10min；A.1.4盡量吸除上清，室溫干燥5min~10min，用20μLDEPC水溶解，-注：也可采用等效的RNA提取試劑盒提取RNA。A.2反轉(zhuǎn)錄5×反應(yīng)緩沖液4μL、反轉(zhuǎn)錄酶混合物3μL。將配制好的反應(yīng)體系置于PCR擴(kuò)增儀中，按照以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：25℃10min，55℃15min，85℃5min，4℃保溫或立即取出，進(jìn)行后續(xù)6B.1.1上游引物F:5'-AAGCCTCTTTTCTGGCGGAB.1.2下游引物R:5'-GACACAAGCCTATCATCG凝膠，同時(shí)依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子；將盤中，膠板厚5mm左右。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形），符合8.3的條件，被檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物電泳出現(xiàn)約330bp目標(biāo)條帶，則判為樣品無擴(kuò)增條帶，則為陰性。若對(duì)照未達(dá)標(biāo)，則本78C.1.1上游引物F:5'-TGAAGCAACAGACAGAACC.1.2下游引物R:5'-GGACAGGAAAAAGTAACGRT-qPCR反應(yīng)體系總體積為20μL，包括2×FastSYBR和下游引物（10μmol/L）各0.4μL、模板1μL，加入陽性對(duì)照Ct值<30.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線陰性對(duì)照無Ct值，且無典型擴(kuò)增曲線；或陰性對(duì)照Ct值>35.0，出現(xiàn)擴(kuò)增樣品檢測無Ct值；或雖有Ct值，但熔解曲線于8Ct值<30.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，熔解曲線于80℃左右出現(xiàn)明顯的峰值，表示樣品中存在病毒核疑樣本進(jìn)行雙孔重復(fù)試驗(yàn)，若任一孔