基于轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合解析黃瓜黑刺次生代謝物質(zhì)合成及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)一、引言1.1研究背景與意義黃瓜（CucumissativusL.）作為全球范圍內(nèi)廣泛種植的重要蔬菜作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著舉足輕重的地位。我國(guó)是黃瓜生產(chǎn)大國(guó)，2021年底，黃瓜種植面積達(dá)1900多萬畝，產(chǎn)量達(dá)7560萬噸，分別占全球黃瓜總量的60%和81%，單產(chǎn)水平達(dá)到3900kg/畝，高出全球平均單產(chǎn)水平36%。黃瓜不僅是人們?nèi)粘ｏ嬍持胁豢苫蛉钡氖卟耍€具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其種植規(guī)模和產(chǎn)量對(duì)保障蔬菜市場(chǎng)供應(yīng)、促進(jìn)農(nóng)民增收具有重要意義。黃瓜的黑刺是其重要的外觀品質(zhì)性狀之一，除了影響黃瓜的外觀，還與黃瓜的次生代謝物質(zhì)密切相關(guān)。次生代謝物質(zhì)是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中產(chǎn)生的一系列小分子有機(jī)化合物，雖然它們并非植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的基礎(chǔ)物質(zhì)，但在植物的防御、信號(hào)傳導(dǎo)、適應(yīng)環(huán)境等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在黃瓜中，黑刺部位富含多種次生代謝物質(zhì)，如黃酮類、生物堿、萜類等。這些次生代謝物質(zhì)不僅賦予了黃瓜獨(dú)特的風(fēng)味和口感，還具有抗氧化、抗微生物、抗癌等多種生物活性效應(yīng)，對(duì)人體健康有著積極的影響。例如，黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌等多種生物活性，能夠幫助人體清除自由基，預(yù)防心血管疾病、癌癥等慢性疾??；生物堿則具有抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等作用，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。然而，目前對(duì)于黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的合成及調(diào)控途徑的了解仍相對(duì)有限。傳統(tǒng)的研究方法往往只能針對(duì)單一或少數(shù)幾種次生代謝物質(zhì)進(jìn)行研究，難以全面揭示其復(fù)雜的合成及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展為深入研究植物次生代謝提供了有力的工具。轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠從基因轉(zhuǎn)錄水平全面解析生物體的基因表達(dá)情況，揭示基因的功能和調(diào)控機(jī)制；代謝組學(xué)則專注于研究生物體內(nèi)所有低分子量代謝物的定性和定量變化，反映生物體的代謝狀態(tài)和生理功能。將轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)相結(jié)合，可以從基因和代謝兩個(gè)層面進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，全面深入地揭示黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的合成及調(diào)控途徑，為黃瓜品質(zhì)改良和功能研究提供理論基礎(chǔ)。綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)錄組與代謝組結(jié)合的方法，深入探究黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的合成及調(diào)控途徑，不僅有助于揭示黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育和代謝調(diào)控的分子機(jī)制，還能為黃瓜的品種改良、品質(zhì)提升以及功能產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在通過轉(zhuǎn)錄組與代謝組相結(jié)合的技術(shù)手段，深入揭示黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的合成及調(diào)控途徑，為黃瓜品質(zhì)改良和功能研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下：黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的鑒定與定量分析：運(yùn)用先進(jìn)的代謝組學(xué)技術(shù)，如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等，對(duì)黃瓜黑刺中的次生代謝物質(zhì)進(jìn)行全面的分離、鑒定和定量分析。明確黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的種類、含量及其在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和環(huán)境條件下的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為后續(xù)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。例如，通過LC-MS技術(shù)，可以對(duì)黃瓜黑刺中的黃酮類、生物堿類等次生代謝物質(zhì)進(jìn)行精確的結(jié)構(gòu)鑒定和含量測(cè)定，從而了解這些物質(zhì)在黃瓜黑刺中的分布情況。黃瓜黑刺轉(zhuǎn)錄組分析及次生代謝相關(guān)基因挖掘：提取黃瓜黑刺在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的總RNA，利用高通量RNA測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括基因表達(dá)譜分析、差異表達(dá)基因篩選、基因功能注釋等，挖掘與次生代謝物質(zhì)合成相關(guān)的關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子。通過基因表達(dá)譜分析，可以發(fā)現(xiàn)哪些基因在黃瓜黑刺中高表達(dá)，進(jìn)而推測(cè)這些基因可能與次生代謝物質(zhì)的合成有關(guān)；通過差異表達(dá)基因篩選，可以找出在不同生長(zhǎng)階段或不同環(huán)境條件下表達(dá)差異顯著的基因，這些基因可能是參與次生代謝調(diào)控的關(guān)鍵因子。轉(zhuǎn)錄組與代謝組關(guān)聯(lián)分析解析次生代謝物質(zhì)合成途徑：將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，構(gòu)建基因-代謝物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。通過關(guān)聯(lián)分析，確定參與次生代謝物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因與代謝物之間的相互關(guān)系，解析黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的合成途徑。例如，如果某個(gè)基因的表達(dá)量與某種次生代謝物質(zhì)的含量呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，那么可以推測(cè)該基因可能參與了這種次生代謝物質(zhì)的合成過程；反之，如果呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，則可能對(duì)合成過程起到抑制作用。關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子在次生代謝調(diào)控中的作用機(jī)制研究：對(duì)篩選出的與次生代謝物質(zhì)合成及調(diào)控密切相關(guān)的關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、基因沉默、過表達(dá)等分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證其功能。通過分析這些基因和轉(zhuǎn)錄因子在次生代謝途徑中的調(diào)控作用，揭示黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)合成的分子調(diào)控機(jī)制。例如，通過基因沉默技術(shù)降低某個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量，觀察次生代謝物質(zhì)含量的變化，從而確定該基因在合成途徑中的具體作用；利用過表達(dá)技術(shù)使某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)，研究其對(duì)下游基因表達(dá)和次生代謝物質(zhì)合成的影響，進(jìn)而闡明轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)技術(shù)作為現(xiàn)代生物學(xué)研究的重要手段，在植物次生代謝研究領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展，為深入理解植物次生代謝的分子機(jī)制和代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了有力支持。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)應(yīng)用方面，通過高通量RNA測(cè)序（RNA-seq），科研人員能夠全面獲取植物在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段、環(huán)境條件下基因的轉(zhuǎn)錄信息，從而篩選出大量與次生代謝物質(zhì)合成相關(guān)的差異表達(dá)基因。例如，在丹參研究中，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)揭示了參與丹參酮生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)模式，為丹參酮的合成調(diào)控機(jī)制研究提供了關(guān)鍵線索。在長(zhǎng)春花研究中，通過轉(zhuǎn)錄組分析鑒定出多個(gè)參與單萜吲哚生物堿合成的基因，為深入解析該類次生代謝物質(zhì)的合成途徑奠定了基礎(chǔ)。代謝組學(xué)技術(shù)則借助先進(jìn)的分析儀器，如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等，實(shí)現(xiàn)了對(duì)植物代謝物的全面定性和定量分析。以番茄為例，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)分析不同品種番茄果實(shí)中的代謝物，發(fā)現(xiàn)了與果實(shí)風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)相關(guān)的特征代謝物，為番茄品質(zhì)改良提供了重要依據(jù)。在擬南芥研究中，通過代謝組學(xué)研究明確了植物在鹽脅迫下代謝物的變化規(guī)律，揭示了植物應(yīng)對(duì)逆境的代謝調(diào)控機(jī)制。將轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)相結(jié)合的研究策略，能夠從基因表達(dá)和代謝物變化兩個(gè)層面進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，更全面地揭示植物次生代謝物質(zhì)的合成及調(diào)控途徑。在銀杏研究中，通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析，成功鑒定出參與銀杏內(nèi)酯生物合成的關(guān)鍵基因和代謝物，解析了銀杏內(nèi)酯的合成途徑和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在人參研究中，利用該聯(lián)合分析方法，深入探討了人參皂苷的生物合成機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)參與人參皂苷合成的關(guān)鍵酶基因和轉(zhuǎn)錄因子。在黃瓜次生代謝物質(zhì)研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也取得了一定的成果。研究表明，黃瓜中含有多種次生代謝物質(zhì)，如西葫蘆素、黃酮類、苯丙素和阿魏酸等。西葫蘆素和黃酮類物質(zhì)主要由CYP450酶家族參與合成，并受到R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的調(diào)控，這些轉(zhuǎn)錄因子通過激活下游的酚酸合成酶和花青素合成基因來促進(jìn)其合成。苯丙素和阿魏酸的合成則主要受到PAL、C4H、4CL等關(guān)鍵酶的調(diào)控，同時(shí)MYB轉(zhuǎn)錄因子家族也參與了其合成和調(diào)控過程。然而，目前對(duì)于黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的研究仍存在諸多不足。一方面，對(duì)黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的種類和含量的全面鑒定和定量分析還不夠系統(tǒng)，缺乏對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和環(huán)境條件下動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的深入研究；另一方面，雖然已初步明確了一些次生代謝物質(zhì)的合成相關(guān)基因和調(diào)控因子，但對(duì)于這些基因和轉(zhuǎn)錄因子在黃瓜黑刺次生代謝調(diào)控中的具體作用機(jī)制，尚未形成完整的認(rèn)知體系，仍有待進(jìn)一步深入探索。二、轉(zhuǎn)錄組與代謝組技術(shù)原理及方法2.1轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)2.1.1RNA測(cè)序技術(shù)原理RNA測(cè)序（RNA-seq）作為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的核心技術(shù)，具有高通量、高精度的顯著特點(diǎn)，能夠全面且深入地獲取生物體在特定狀態(tài)下的基因轉(zhuǎn)錄信息。其基本原理是基于逆轉(zhuǎn)錄和高通量測(cè)序技術(shù)，將細(xì)胞內(nèi)的RNA分子轉(zhuǎn)化為可測(cè)序的DNA文庫，進(jìn)而對(duì)這些文庫進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)水平的精準(zhǔn)測(cè)定。在RNA測(cè)序過程中，文庫構(gòu)建是至關(guān)重要的起始環(huán)節(jié)。首先，從黃瓜黑刺樣本中提取總RNA，這一步驟需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，以確保RNA的完整性和純度。隨后，利用磁珠法或其他有效的方法富集mRNA，去除rRNA等非編碼RNA的干擾，提高測(cè)序數(shù)據(jù)的有效利用率。接著，以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，這一過程將RNA信息轉(zhuǎn)化為DNA形式，便于后續(xù)的測(cè)序操作。為了實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)序，需要對(duì)cDNA進(jìn)行片段化處理，使其長(zhǎng)度符合測(cè)序平臺(tái)的要求。在片段兩端添加特定的接頭序列，這些接頭序列包含了用于測(cè)序的引物結(jié)合位點(diǎn)和樣本標(biāo)識(shí)信息，不僅能夠啟動(dòng)測(cè)序反應(yīng)，還能在數(shù)據(jù)分析階段區(qū)分不同的樣本。測(cè)序平臺(tái)是決定RNA測(cè)序效率和質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。目前，市場(chǎng)上主流的測(cè)序平臺(tái)包括Illumina、PacBio和Nanopore等，它們各自具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和適用場(chǎng)景。Illumina測(cè)序平臺(tái)基于邊合成邊測(cè)序（SBS）技術(shù)，具有高通量、高準(zhǔn)確性和低成本的特點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的測(cè)序平臺(tái)之一。在測(cè)序過程中，將構(gòu)建好的文庫加載到測(cè)序芯片上，通過橋式PCR擴(kuò)增技術(shù)，使每個(gè)DNA片段在芯片上形成數(shù)百萬個(gè)拷貝的簇，從而提高測(cè)序信號(hào)的強(qiáng)度。測(cè)序時(shí)，帶有熒光標(biāo)記的dNTP依次加入反應(yīng)體系，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與模板鏈結(jié)合，每加入一個(gè)堿基，就會(huì)發(fā)出特定顏色的熒光信號(hào)，通過高分辨率的光學(xué)系統(tǒng)捕捉這些信號(hào)，即可實(shí)時(shí)讀取DNA序列信息。由于該平臺(tái)的測(cè)序讀長(zhǎng)相對(duì)較短，通常在100-300bp之間，但通過大規(guī)模平行測(cè)序，能夠獲得海量的測(cè)序數(shù)據(jù)，滿足大多數(shù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的需求。PacBio測(cè)序平臺(tái)采用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（SMRT）技術(shù)，無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可直接對(duì)單個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序，從而避免了擴(kuò)增過程中引入的偏差。其測(cè)序原理是利用DNA聚合酶將dNTP逐個(gè)添加到模板鏈上，在這個(gè)過程中，dNTP的磷酸基團(tuán)上標(biāo)記有熒光基團(tuán)，當(dāng)磷酸二酯鍵形成時(shí)，熒光基團(tuán)會(huì)釋放出熒光信號(hào)，通過高靈敏度的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)捕捉這些信號(hào)，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA序列的實(shí)時(shí)測(cè)定。PacBio測(cè)序平臺(tái)的顯著優(yōu)勢(shì)在于其超長(zhǎng)的測(cè)序讀長(zhǎng)，可達(dá)數(shù)萬個(gè)堿基對(duì)，這使得它在研究基因結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體和復(fù)雜基因組區(qū)域時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。例如，在黃瓜黑刺轉(zhuǎn)錄組研究中，對(duì)于一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜、存在大量可變剪接的基因，PacBio測(cè)序平臺(tái)能夠提供更完整的轉(zhuǎn)錄本信息，有助于準(zhǔn)確解析基因的功能和調(diào)控機(jī)制。Nanopore測(cè)序平臺(tái)則基于納米孔技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸分子的直接測(cè)序。其核心部件是一個(gè)納米級(jí)的小孔，當(dāng)核酸分子通過納米孔時(shí)，會(huì)引起孔內(nèi)電流的變化，不同的堿基會(huì)產(chǎn)生不同的電流特征，通過對(duì)這些電流變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和分析，即可確定核酸分子的序列。Nanopore測(cè)序平臺(tái)具有測(cè)序速度快、便攜性好、可直接檢測(cè)堿基修飾等優(yōu)點(diǎn)，為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究提供了新的技術(shù)手段。在黃瓜黑刺轉(zhuǎn)錄組研究中，Nanopore測(cè)序平臺(tái)可以快速獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，尤其適用于對(duì)時(shí)間要求較高的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景，如研究黃瓜在不同環(huán)境脅迫下的快速響應(yīng)機(jī)制。此外，其直接檢測(cè)堿基修飾的能力，有助于揭示基因表達(dá)調(diào)控的表觀遺傳機(jī)制，為深入理解黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的合成及調(diào)控途徑提供了新的視角。2.1.2數(shù)據(jù)分析流程轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析是一個(gè)復(fù)雜而系統(tǒng)的過程，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和多種常用工具，其目的是從海量的測(cè)序數(shù)據(jù)中提取有價(jià)值的生物學(xué)信息，深入揭示基因的表達(dá)模式、功能以及它們?cè)谏镞^程中的調(diào)控機(jī)制。數(shù)據(jù)預(yù)處理是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的首要環(huán)節(jié)，其質(zhì)量直接影響后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在這一步驟中，首先使用FastQC等工具對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。FastQC能夠生成詳細(xì)的報(bào)告，展示數(shù)據(jù)的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)，包括堿基質(zhì)量分布、GC含量、測(cè)序錯(cuò)誤率、接頭污染情況等。通過對(duì)這些指標(biāo)的分析，可以直觀地了解數(shù)據(jù)的質(zhì)量狀況，判斷數(shù)據(jù)是否存在異常。例如，如果堿基質(zhì)量分布不均勻，可能表明測(cè)序過程存在技術(shù)問題；若GC含量偏離正常范圍，可能暗示樣本存在污染或測(cè)序偏差。基于質(zhì)量評(píng)估結(jié)果，利用Trimmomatic、Cutadapt等工具對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和修剪。這些工具可以去除低質(zhì)量的堿基、接頭序列以及含有過多N（未知堿基）的reads，從而提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量。通過數(shù)據(jù)預(yù)處理，能夠有效減少噪聲數(shù)據(jù)對(duì)后續(xù)分析的干擾，為準(zhǔn)確解讀轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。序列比對(duì)是將預(yù)處理后的高質(zhì)量測(cè)序reads定位到參考基因組或轉(zhuǎn)錄組上的過程，這一步驟對(duì)于確定基因的位置、結(jié)構(gòu)以及表達(dá)水平至關(guān)重要。常用的比對(duì)工具包括STAR、HISAT2等。STAR以其快速的比對(duì)速度和較高的準(zhǔn)確性而備受青睞，它能夠高效地處理大規(guī)模的測(cè)序數(shù)據(jù)，并準(zhǔn)確地識(shí)別基因的邊界和剪接位點(diǎn)。HISAT2則具有較低的內(nèi)存需求和良好的剪接位點(diǎn)預(yù)測(cè)能力，適用于各種復(fù)雜基因組的比對(duì)分析。在進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，需要根據(jù)參考基因組的特點(diǎn)和測(cè)序數(shù)據(jù)的類型選擇合適的參數(shù)，以優(yōu)化比對(duì)效果。例如，對(duì)于黃瓜這種基因組相對(duì)較小且注釋較為完善的物種，可以適當(dāng)調(diào)整比對(duì)參數(shù)，提高比對(duì)的靈敏度和特異性。比對(duì)完成后，生成的SAM（SequenceAlignment/Map）或BAM（BinaryAlignment/Map）文件記錄了reads與參考基因組的比對(duì)信息，這些文件是后續(xù)分析的重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。差異表達(dá)分析旨在識(shí)別在不同樣本或條件下基因表達(dá)水平存在顯著差異的基因，這些差異表達(dá)基因（DEGs）往往與生物過程的變化密切相關(guān)，是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的核心內(nèi)容之一。常用的差異表達(dá)分析工具包括DESeq2、edgeR等。DESeq2基于負(fù)二項(xiàng)分布模型，能夠有效地處理有生物學(xué)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確地估計(jì)基因的表達(dá)量和差異倍數(shù)，并通過統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)確定差異表達(dá)基因的顯著性。edgeR則適用于分析重復(fù)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，它通過精確檢驗(yàn)和廣義線性模型等方法，對(duì)基因表達(dá)的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷。在進(jìn)行差異表達(dá)分析時(shí)，需要對(duì)樣本進(jìn)行合理的分組，例如在黃瓜黑刺轉(zhuǎn)錄組研究中，可以將不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的黃瓜黑刺樣本分為一組，正常生長(zhǎng)條件下的樣本作為對(duì)照組，通過比較不同組之間基因表達(dá)的差異，篩選出與黃瓜黑刺生長(zhǎng)發(fā)育或次生代謝物質(zhì)合成相關(guān)的關(guān)鍵基因。通常，會(huì)設(shè)定嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)，如差異倍數(shù)（foldchange）大于2或小于0.5，且校正后的P值（如Benjamini-Hochberg校正）小于0.05，以確保篩選出的差異表達(dá)基因具有較高的可信度。基因集富集分析（GeneSetEnrichmentAnalysis，GSEA）是一種基于基因集的分析方法，它能夠從整體上評(píng)估一組基因在不同樣本或條件下的表達(dá)變化趨勢(shì)，揭示基因集所代表的生物學(xué)功能在特定生物過程中的富集情況。常用的GSEA軟件工具能夠根據(jù)預(yù)先定義的基因集，如GO（GeneOntology）功能注釋基因集、KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）代謝通路基因集等，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析。在黃瓜黑刺轉(zhuǎn)錄組研究中，通過GSEA可以確定哪些生物學(xué)過程、分子功能或代謝通路在黃瓜黑刺中顯著富集，從而深入了解黃瓜黑刺生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝物質(zhì)合成的分子機(jī)制。例如，如果在黃瓜黑刺中發(fā)現(xiàn)與黃酮類化合物合成相關(guān)的基因集顯著富集，那么可以推測(cè)黃酮類化合物的合成在黃瓜黑刺中可能具有重要作用，進(jìn)而針對(duì)性地研究這些基因在黃酮類化合物合成途徑中的具體功能和調(diào)控機(jī)制。2.2代謝組學(xué)技術(shù)2.2.1代謝物分析技術(shù)代謝組學(xué)作為一門研究生物體內(nèi)所有小分子代謝物組成和變化的學(xué)科，對(duì)于深入了解生物體的生理狀態(tài)、代謝調(diào)控機(jī)制以及環(huán)境響應(yīng)等方面具有重要意義。代謝物分析技術(shù)是代謝組學(xué)研究的核心，其涵蓋了樣品制備、分離技術(shù)和檢測(cè)技術(shù)等多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這些技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新為代謝組學(xué)研究提供了強(qiáng)大的支撐。樣品制備是代謝物分析的首要步驟，其質(zhì)量直接影響后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在黃瓜黑刺代謝組學(xué)研究中，針對(duì)不同的分析目的和檢測(cè)技術(shù)，需要采用相應(yīng)的樣品制備方法。對(duì)于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析，由于GC-MS要求樣品具有良好的揮發(fā)性，因此通常需要對(duì)黃瓜黑刺樣品進(jìn)行衍生化處理。例如，對(duì)于極性較大的代謝物，如糖類、氨基酸等，常用的衍生化方法包括硅烷化、酯化和?；取Ｒ怨柰榛癁槔?，在進(jìn)行硅烷化衍生化時(shí)，通常使用N,O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）或N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（MSTFA）等硅烷化試劑，這些試劑能夠與代謝物分子中的羥基、氨基、羧基等活性基團(tuán)反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性較強(qiáng)的硅烷化衍生物，從而便于在GC-MS上進(jìn)行分離和檢測(cè)。在進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）分析時(shí)，由于LC-MS對(duì)樣品揮發(fā)性的要求相對(duì)較低，因此樣品制備過程相對(duì)簡(jiǎn)單。一般需要對(duì)黃瓜黑刺樣品進(jìn)行粉碎、提取和離心等處理，以獲得澄清的提取液。在提取過程中，常用的提取溶劑包括甲醇、乙腈、水以及它們的混合溶液等。例如，對(duì)于極性代謝物，可以使用甲醇-水（如80:20，v/v）的混合溶液進(jìn)行提取；對(duì)于非極性代謝物，則可以采用乙腈等有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。此外，為了提高提取效率，還可以采用超聲輔助提取、微波輔助提取等技術(shù)，這些技術(shù)能夠加速代謝物從樣品基質(zhì)中釋放出來，提高提取的回收率。分離技術(shù)是代謝物分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其目的是將復(fù)雜的代謝物混合物分離成單個(gè)或多個(gè)組分，以便后續(xù)的檢測(cè)和鑒定。氣相色譜（GC）和液相色譜（LC）是代謝組學(xué)研究中常用的兩種分離技術(shù)，它們各自具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和適用范圍。GC具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于分析揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性較好的代謝物。在黃瓜黑刺代謝組學(xué)研究中，對(duì)于脂肪酸、醇類、酯類等揮發(fā)性代謝物的分析，GC是一種非常有效的分離技術(shù)。GC的分離原理基于不同代謝物在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異。在GC分析中，樣品被氣化后進(jìn)入色譜柱，色譜柱內(nèi)填充有固定相，通常是一種高沸點(diǎn)的有機(jī)化合物或固體吸附劑。載氣（如氮?dú)?、氦氣等）作為流?dòng)相，攜帶樣品在色譜柱內(nèi)運(yùn)行。由于不同代謝物在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同，它們?cè)谏V柱內(nèi)的遷移速度也不同，從而實(shí)現(xiàn)了分離。分離后的代謝物依次進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，常用的檢測(cè)器有火焰離子化檢測(cè)器（FID）、質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）等。其中，GC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了GC的高分離能力和MS的高鑒定能力，能夠?qū)Υx物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析。例如，通過GC-MS分析，可以確定黃瓜黑刺中脂肪酸的種類和含量，為研究黃瓜的風(fēng)味和品質(zhì)提供重要信息。LC則具有分離能力強(qiáng)、適用范圍廣的特點(diǎn)，能夠分析各種極性和非極性的代謝物，尤其是對(duì)于那些揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性低的代謝物，LC表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。在黃瓜黑刺代謝組學(xué)研究中，對(duì)于黃酮類、生物堿類、酚酸類等極性較大且熱不穩(wěn)定的代謝物，LC是首選的分離技術(shù)。LC的分離原理基于不同代謝物在固定相和流動(dòng)相之間的吸附、分配、離子交換等相互作用的差異。在LC分析中，樣品溶液通過高壓泵注入色譜柱，色譜柱內(nèi)填充有不同類型的固定相，如硅膠、化學(xué)鍵合相（如C18、C8等）等。流動(dòng)相通常是由水、有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈等）和緩沖劑組成的混合溶液，通過改變流動(dòng)相的組成和比例，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同代謝物的分離。分離后的代謝物同樣進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器（UV）、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）等。其中，LC-MS聯(lián)用技術(shù)是目前代謝組學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，它能夠提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，對(duì)于復(fù)雜代謝物的鑒定具有重要意義。例如，利用LC-MS技術(shù)，可以對(duì)黃瓜黑刺中的黃酮類化合物進(jìn)行分離和鑒定，確定其結(jié)構(gòu)和含量，進(jìn)而研究其生物活性和功能。檢測(cè)技術(shù)是代謝物分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其作用是對(duì)分離后的代謝物進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，以獲取代謝物的結(jié)構(gòu)和含量信息。質(zhì)譜（MS）和核磁共振（NMR）是代謝組學(xué)研究中最為常用的兩種檢測(cè)技術(shù)，它們?cè)诖x物分析中發(fā)揮著重要作用。MS是一種通過測(cè)量離子質(zhì)荷比（m/z）來確定分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的分析技術(shù)，具有靈敏度高、檢測(cè)范圍廣、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，在代謝組學(xué)研究中占據(jù)著重要地位。在黃瓜黑刺代謝組學(xué)研究中，MS可以與GC、LC等分離技術(shù)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝物的高效分離和準(zhǔn)確鑒定。在MS分析中，首先將代謝物離子化，使其轉(zhuǎn)化為帶電離子，常用的離子化方法有電噴霧離子化（ESI）、基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）等。ESI適用于極性和中等極性的代謝物，它通過在高電場(chǎng)作用下使樣品溶液形成帶電液滴，隨著溶劑的揮發(fā)，液滴逐漸變小，最終形成氣態(tài)離子；MALDI則適用于大分子和難揮發(fā)的代謝物，它利用激光照射樣品與基質(zhì)的混合物，使樣品分子從基質(zhì)中解吸并離子化。離子化后的代謝物進(jìn)入質(zhì)量分析器，根據(jù)其質(zhì)荷比的不同進(jìn)行分離和檢測(cè)。質(zhì)量分析器有多種類型，如四極桿質(zhì)量分析器、飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF）、離子阱質(zhì)量分析器等，不同類型的質(zhì)量分析器具有不同的性能特點(diǎn)和適用范圍。例如，TOF質(zhì)量分析器具有高分辨率和高靈敏度的特點(diǎn)，能夠精確測(cè)定代謝物的質(zhì)量，對(duì)于未知代謝物的鑒定具有重要作用；四極桿質(zhì)量分析器則具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低、掃描速度快的優(yōu)點(diǎn)，常用于定量分析。通過MS分析，可以獲得代謝物的精確質(zhì)量數(shù)、碎片離子信息等，這些信息對(duì)于推斷代謝物的結(jié)構(gòu)和鑒定代謝物的種類具有重要價(jià)值。例如，在黃瓜黑刺中發(fā)現(xiàn)一種未知的次生代謝物，通過LC-MS分析獲得其精確質(zhì)量數(shù)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索和碎片離子分析，可以初步推斷其結(jié)構(gòu)，再通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。NMR是一種利用原子核在磁場(chǎng)中的自旋特性來研究分子結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的分析技術(shù)，具有無損、定量準(zhǔn)確、可提供豐富結(jié)構(gòu)信息等優(yōu)點(diǎn)。在黃瓜黑刺代謝組學(xué)研究中，NMR可以直接對(duì)樣品進(jìn)行分析，無需復(fù)雜的前處理過程，能夠提供關(guān)于代謝物分子結(jié)構(gòu)、構(gòu)型、構(gòu)象以及分子間相互作用等方面的信息。NMR的基本原理是基于原子核的自旋角動(dòng)量和磁矩，當(dāng)原子核處于外加磁場(chǎng)中時(shí)，會(huì)發(fā)生能級(jí)分裂，吸收特定頻率的射頻輻射后會(huì)發(fā)生能級(jí)躍遷，產(chǎn)生NMR信號(hào)。通過對(duì)NMR信號(hào)的分析，可以獲得代謝物分子中不同原子核的化學(xué)位移、耦合常數(shù)、積分面積等信息，這些信息可以用于推斷代謝物的結(jié)構(gòu)和含量。例如，1H-NMR可以提供關(guān)于氫原子的化學(xué)環(huán)境和數(shù)量的信息，通過分析1H-NMR譜圖中各峰的位置、形狀和積分面積，可以確定代謝物分子中不同類型氫原子的數(shù)目和連接方式，從而推斷代謝物的結(jié)構(gòu)；13C-NMR則可以提供關(guān)于碳原子的信息，對(duì)于確定代謝物分子的骨架結(jié)構(gòu)具有重要作用。此外，NMR還可以用于研究代謝物在生物體內(nèi)的代謝途徑和動(dòng)態(tài)變化，通過追蹤代謝物中特定原子核的信號(hào)變化，了解其在生物體內(nèi)的代謝過程和轉(zhuǎn)化機(jī)制。2.2.2數(shù)據(jù)處理與分析方法代謝組學(xué)研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量龐大且復(fù)雜，如何從這些海量的數(shù)據(jù)中提取有價(jià)值的生物學(xué)信息是代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。數(shù)據(jù)處理與分析方法在代謝組學(xué)研究中起著至關(guān)重要的作用，它涵蓋了峰匹配、定量分析、模式識(shí)別等多個(gè)方面，通過這些方法的綜合應(yīng)用，可以深入挖掘代謝組數(shù)據(jù)背后隱藏的生物學(xué)意義，為揭示黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的合成及調(diào)控途徑提供有力支持。峰匹配是代謝組數(shù)據(jù)處理的基礎(chǔ)步驟，其目的是將不同樣本中的代謝物峰進(jìn)行準(zhǔn)確匹配，以確保后續(xù)分析的準(zhǔn)確性和可比性。在實(shí)際的代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)中，由于儀器誤差、樣本差異等因素的影響，同一代謝物在不同樣本中的出峰時(shí)間和峰強(qiáng)度可能會(huì)存在一定的波動(dòng)。因此，需要采用有效的峰匹配方法來校正這些差異。常用的峰匹配算法包括基于保留時(shí)間和質(zhì)荷比的匹配算法、基于譜圖相似性的匹配算法等?；诒Ａ魰r(shí)間和質(zhì)荷比的匹配算法是最基本的峰匹配方法，它通過比較不同樣本中代謝物峰的保留時(shí)間和質(zhì)荷比，將保留時(shí)間和質(zhì)荷比相近的峰視為同一代謝物的峰。例如，在LC-MS數(shù)據(jù)處理中，可以設(shè)定一個(gè)保留時(shí)間和質(zhì)荷比的允許偏差范圍，當(dāng)兩個(gè)峰的保留時(shí)間和質(zhì)荷比在該范圍內(nèi)時(shí)，就認(rèn)為它們是匹配的?；谧V圖相似性的匹配算法則更加復(fù)雜和準(zhǔn)確，它不僅考慮保留時(shí)間和質(zhì)荷比，還通過計(jì)算代謝物峰的質(zhì)譜圖相似性來進(jìn)行匹配。這種方法能夠更好地處理由于儀器漂移、樣本基質(zhì)干擾等因素導(dǎo)致的峰位置和強(qiáng)度變化，提高峰匹配的準(zhǔn)確性。在實(shí)際應(yīng)用中，通常會(huì)結(jié)合多種峰匹配算法，以提高匹配的可靠性。例如，先使用基于保留時(shí)間和質(zhì)荷比的匹配算法進(jìn)行初步匹配，然后再利用基于譜圖相似性的匹配算法對(duì)初步匹配結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證，從而得到更加準(zhǔn)確的峰匹配結(jié)果。定量分析是代謝組學(xué)研究的重要內(nèi)容之一，其目的是確定代謝物在不同樣本中的含量，以便進(jìn)行后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析和生物學(xué)解釋。在代謝組學(xué)中，常用的定量方法包括內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法和相對(duì)定量法等。內(nèi)標(biāo)法是一種常用且準(zhǔn)確的定量方法，它通過在樣品中加入已知濃度的內(nèi)標(biāo)物，利用內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)代謝物的響應(yīng)比來計(jì)算目標(biāo)代謝物的含量。內(nèi)標(biāo)物應(yīng)具有與目標(biāo)代謝物相似的化學(xué)性質(zhì)和色譜行為，且在樣品中不存在。例如，在GC-MS分析中，可以選擇與目標(biāo)脂肪酸結(jié)構(gòu)相似的脂肪酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物；在LC-MS分析中，可以選擇結(jié)構(gòu)類似的同位素標(biāo)記化合物作為內(nèi)標(biāo)物。通過內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，能夠有效校正儀器響應(yīng)的波動(dòng)和樣品處理過程中的損失，提高定量的準(zhǔn)確性。外標(biāo)法則是通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行定量分析，首先配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定其峰面積或峰強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)樣品中目標(biāo)代謝物的峰面積或峰強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的濃度。外標(biāo)法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性要求較高，且需要保證標(biāo)準(zhǔn)品與樣品中的目標(biāo)代謝物具有相同的響應(yīng)因子。相對(duì)定量法是一種基于代謝物峰強(qiáng)度相對(duì)變化的定量方法，它不依賴于標(biāo)準(zhǔn)品，而是通過比較不同樣本中同一代謝物峰強(qiáng)度的相對(duì)比例來反映代謝物含量的變化。相對(duì)定量法適用于無法獲得標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)Χ繙?zhǔn)確性要求不高的情況，在大規(guī)模樣本的初步篩選和分析中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。例如，在研究黃瓜黑刺在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段代謝物的變化時(shí)，可以采用相對(duì)定量法，通過比較不同階段同一代謝物峰強(qiáng)度的變化，初步篩選出差異顯著的代謝物，為后續(xù)的深入研究提供線索。模式識(shí)別是代謝組數(shù)據(jù)分析的核心方法之一，它通過對(duì)大量代謝組數(shù)據(jù)的分析和挖掘，識(shí)別出不同樣本之間的差異和相似性，從而揭示代謝物的變化規(guī)律和潛在的生物學(xué)信息。模式識(shí)別方法主要包括無監(jiān)督學(xué)習(xí)和有監(jiān)督學(xué)習(xí)兩類。無監(jiān)督學(xué)習(xí)方法不需要預(yù)先定義樣本的類別標(biāo)簽，主要用于探索數(shù)據(jù)的內(nèi)在結(jié)構(gòu)和特征，常見的無監(jiān)督學(xué)習(xí)方法有主成分分析（PCA）、聚類分析（CA）等。PCA是一種常用的降維技術(shù)，它通過線性變換將原始數(shù)據(jù)投影到低維空間，使得數(shù)據(jù)在低維空間中能夠最大程度地保留原始數(shù)據(jù)的信息，同時(shí)去除數(shù)據(jù)中的噪聲和冗余信息。在代謝組學(xué)中，PCA可以用于對(duì)不同樣本的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將多個(gè)代謝物的信息整合到幾個(gè)主成分中，通過觀察主成分得分圖，可以直觀地了解不同樣本之間的差異和相似性，發(fā)現(xiàn)異常樣本，并初步探索代謝物的變化趨勢(shì)。例如，在黃瓜黑刺代謝組學(xué)研究中，通過PCA分析可以將不同生長(zhǎng)條件下的黃瓜黑刺樣本區(qū)分開來，發(fā)現(xiàn)某些代謝物在不同生長(zhǎng)條件下的變化趨勢(shì)與樣本的分組密切相關(guān)，為進(jìn)一步研究這些代謝物在黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育中的作用提供線索。聚類分析則是根據(jù)樣本之間的相似性將其劃分為不同的類別，使得同一類別的樣本具有較高的相似性，而不同類別的樣本具有較大的差異。常見的聚類算法有層次聚類、K-均值聚類等。在代謝組學(xué)研究中，聚類分析可以用于對(duì)代謝物進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)具有相似代謝變化模式的代謝物群體，從而推斷它們可能參與的共同代謝途徑或生物學(xué)過程。例如，通過層次聚類分析，可以將黃瓜黑刺中在不同生長(zhǎng)階段表達(dá)模式相似的代謝物聚為一類，進(jìn)一步分析這些代謝物的結(jié)構(gòu)和功能，有助于揭示黃瓜黑刺在不同生長(zhǎng)階段的代謝調(diào)控機(jī)制。有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法則需要預(yù)先定義樣本的類別標(biāo)簽，通過建立分類模型來對(duì)未知樣本進(jìn)行分類和預(yù)測(cè)，常見的有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法有偏最小二乘判別分析（PLS-DA）、支持向量機(jī)（SVM）等。PLS-DA是一種基于偏最小二乘回歸的判別分析方法，它通過尋找能夠最大程度區(qū)分不同類別樣本的變量組合，建立分類模型。在代謝組學(xué)中，PLS-DA常用于尋找與樣本類別差異密切相關(guān)的代謝物，即生物標(biāo)志物。通過PLS-DA分析，可以得到變量重要性投影（VIP）值，VIP值大于1的代謝物通常被認(rèn)為是對(duì)分類貢獻(xiàn)較大的潛在生物標(biāo)志物。例如，在研究黃瓜黑刺對(duì)病蟲害脅迫的響應(yīng)時(shí)，利用PLS-DA分析可以篩選出在受病蟲害脅迫和未受脅迫的黃瓜黑刺樣本中差異顯著的代謝物，這些代謝物可能是黃瓜應(yīng)對(duì)病蟲害脅迫的關(guān)鍵物質(zhì)，進(jìn)一步研究它們的功能和作用機(jī)制，對(duì)于開發(fā)黃瓜病蟲害防治的新策略具有重要意義。SVM是一種基于統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)理論的分類方法，它通過尋找一個(gè)最優(yōu)的分類超平面，將不同類別的樣本分開。SVM在處理小樣本、非線性分類問題時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在代謝組學(xué)研究中也得到了廣泛的應(yīng)用。例如，在對(duì)黃瓜黑刺的不同品種進(jìn)行分類時(shí)，SVM可以利用代謝組數(shù)據(jù)建立準(zhǔn)確的分類模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同品種黃瓜黑刺的快速識(shí)別和鑒定，為黃瓜品種的選育和鑒定提供了新的技術(shù)手段。2.3轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析策略轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，分別從基因轉(zhuǎn)錄和代謝物水平揭示生物體的生命活動(dòng)規(guī)律。然而，單一組學(xué)研究往往存在局限性，難以全面深入地解析復(fù)雜的生物學(xué)過程。轉(zhuǎn)錄組學(xué)雖然能夠檢測(cè)基因的表達(dá)變化，但基因表達(dá)水平并不總是與最終的代謝產(chǎn)物水平直接相關(guān)，因?yàn)榛虮磉_(dá)受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯調(diào)控以及蛋白質(zhì)修飾等多個(gè)層面的影響。代謝組學(xué)則側(cè)重于分析生物體內(nèi)的代謝物，但對(duì)于代謝物合成和調(diào)控的上游基因信息了解有限。因此，將轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)進(jìn)行聯(lián)合分析具有至關(guān)重要的必要性。通過整合轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)，可以實(shí)現(xiàn)從基因到代謝物的全面關(guān)聯(lián)分析，構(gòu)建更加完整的生物學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而更深入地理解黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的合成及調(diào)控機(jī)制，為黃瓜的品質(zhì)改良和功能研究提供更全面、準(zhǔn)確的理論依據(jù)。在轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析中，數(shù)據(jù)整合是關(guān)鍵步驟之一。目前常用的數(shù)據(jù)整合方法主要包括基于公共數(shù)據(jù)庫的整合和基于統(tǒng)計(jì)分析的整合?；诠矓?shù)據(jù)庫的整合方法，如KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包含了豐富的基因、代謝物以及代謝通路信息。在黃瓜黑刺的研究中，可以將轉(zhuǎn)錄組分析得到的差異表達(dá)基因和代謝組分析鑒定出的差異代謝物，分別映射到KEGG數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)通路。通過這種方式，能夠直觀地找到基因和代謝物在同一代謝通路上的交集，明確它們?cè)邳S瓜黑刺次生代謝過程中的關(guān)聯(lián)。例如，在黃酮類化合物合成途徑中，通過KEGG數(shù)據(jù)庫整合發(fā)現(xiàn)，某些差異表達(dá)基因編碼的酶參與了黃酮類化合物的合成步驟，而這些步驟所涉及的中間代謝物也在代謝組分析中被檢測(cè)到，從而建立起基因與代謝物之間的直接聯(lián)系。基于統(tǒng)計(jì)分析的整合方法則主要通過計(jì)算基因表達(dá)量與代謝物含量之間的相關(guān)性來實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)整合。斯皮爾曼相關(guān)分析是一種常用的方法，它能夠衡量?jī)蓚€(gè)變量之間的單調(diào)關(guān)系。在黃瓜黑刺研究中，通過計(jì)算差異表達(dá)基因的表達(dá)量與差異代謝物含量之間的斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)，可以篩選出具有顯著相關(guān)性的基因-代謝物對(duì)。這些具有強(qiáng)相關(guān)性的基因-代謝物對(duì)往往在次生代謝調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。例如，發(fā)現(xiàn)某個(gè)基因的表達(dá)量與一種特定黃酮類代謝物的含量呈現(xiàn)高度正相關(guān)，這表明該基因可能在這種黃酮類化合物的合成過程中起到關(guān)鍵的促進(jìn)作用；反之，若呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，則可能具有抑制作用。在整合數(shù)據(jù)之后，需要采用一系列常用分析思路來深入挖掘其中蘊(yùn)含的生物學(xué)信息?；诖x通路的分析是一種重要的思路。通過將差異表達(dá)基因和差異代謝物映射到已知的代謝通路中，可以確定哪些代謝通路在黃瓜黑刺中發(fā)生了顯著變化。例如，在分析黃瓜黑刺在不同生長(zhǎng)階段的轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸代謝通路中的多個(gè)基因表達(dá)量發(fā)生顯著變化，同時(shí)該通路中的一些關(guān)鍵代謝物含量也相應(yīng)改變，這表明苯丙氨酸代謝通路在黃瓜黑刺的生長(zhǎng)發(fā)育過程中可能具有重要的調(diào)控作用。進(jìn)一步研究這些基因和代謝物在該通路中的相互作用，有助于揭示黃瓜黑刺生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制。構(gòu)建基因-代謝物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也是一種常用的分析思路。利用整合后的數(shù)據(jù)，可以將具有顯著相關(guān)性的基因和代謝物作為節(jié)點(diǎn)，它們之間的相關(guān)性作為邊，構(gòu)建出復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，可以清晰地看到基因和代謝物之間的相互關(guān)系以及它們?cè)谡麄€(gè)調(diào)控體系中的位置。例如，在構(gòu)建的黃瓜黑刺次生代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)現(xiàn)某些轉(zhuǎn)錄因子基因處于網(wǎng)絡(luò)的核心位置，它們與多個(gè)參與次生代謝物質(zhì)合成的結(jié)構(gòu)基因以及代謝物存在密切的關(guān)聯(lián)。通過對(duì)這些核心節(jié)點(diǎn)的深入研究，可以揭示次生代謝調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為進(jìn)一步調(diào)控黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的合成提供理論指導(dǎo)。三、黃瓜黑刺次生代謝物質(zhì)研究材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料本研究選用了在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛種植且黑刺性狀表現(xiàn)穩(wěn)定的‘津優(yōu)35號(hào)’黃瓜品種作為實(shí)驗(yàn)材料。該品種具有生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、抗病性好、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，其黑刺特征明顯，刺瘤較大且分布均勻，有利于進(jìn)行黑刺相關(guān)的研究。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)樣本均采集自[具體種植地點(diǎn)]的溫室大棚，該種植環(huán)境能夠嚴(yán)格控制光照、溫度、濕度等生長(zhǎng)條件，為黃瓜的生長(zhǎng)提供了穩(wěn)定且適宜的環(huán)境。在樣本選擇上，分別選取了黑刺部位和非黑刺部位的黃瓜組織作為研究對(duì)象。對(duì)于黑刺樣本，在黃瓜果實(shí)發(fā)育的[具體發(fā)育時(shí)期，如幼果期、膨大期、成熟期等]，選擇果實(shí)表面刺瘤飽滿、黑刺色澤深且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的部位，使用經(jīng)嚴(yán)格消毒處理的剪刀小心剪下帶有黑刺的表皮組織，每個(gè)樣本采集量約為[X]克，以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)有足夠的材料。為了減少個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，每個(gè)時(shí)期的黑刺樣本均從[X]株不同的黃瓜植株上采集，每株采集[X]個(gè)果實(shí)的黑刺部位，然后將這些樣本混合均勻，作為該時(shí)期的一個(gè)生物學(xué)重復(fù)。對(duì)于非黑刺樣本，選取同一植株上與黑刺部位相鄰但無刺或刺色明顯不同（如白色刺）的表皮組織作為對(duì)照。采集方法與黑刺樣本相同，同樣在不同發(fā)育時(shí)期從多株黃瓜植株上采集并混合，確保樣本的代表性和一致性。每個(gè)時(shí)期的黑刺和非黑刺樣本均設(shè)置[X]個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度。采集后的樣本立即放入液氮中速凍，以迅速終止細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)，防止次生代謝物質(zhì)的降解或變化。隨后，將速凍后的樣本轉(zhuǎn)移至-80℃的超低溫冰箱中保存，直至進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。在整個(gè)樣本采集和保存過程中，嚴(yán)格遵循無菌操作原則，避免樣本受到污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠真實(shí)反映黃瓜黑刺和非黑刺部位次生代謝物質(zhì)的組成和含量差異。3.2轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)與方法在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)中，樣本采集的準(zhǔn)確性和代表性至關(guān)重要。本研究按照上述樣本選擇標(biāo)準(zhǔn)，在黃瓜果實(shí)的幼果期、膨大期和成熟期，分別采集黑刺和非黑刺樣本。每個(gè)時(shí)期的每個(gè)樣本類型（黑刺和非黑刺）均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，總共獲得18個(gè)樣本（3個(gè)時(shí)期×2種樣本類型×3個(gè)重復(fù)）。采集時(shí)，使用經(jīng)過嚴(yán)格消毒處理的剪刀和鑷子，確保操作過程中不引入外源RNA酶，以防止RNA降解。采集后的樣本迅速放入液氮中速凍，以最大程度保持RNA的完整性，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。RNA提取是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的關(guān)鍵步驟，其質(zhì)量直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究采用TRIzol法進(jìn)行總RNA提取，該方法能夠有效裂解細(xì)胞，釋放RNA，并通過有機(jī)溶劑抽提和沉淀步驟，去除蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì)，獲得高純度的RNA。具體操作如下：將冷凍的黃瓜樣本在液氮中研磨成粉末狀，迅速加入適量TRIzol試劑，充分勻漿。室溫靜置5分鐘后，加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，然后在4℃下以12,000rpm離心15分鐘。此時(shí)，樣品分為三層，上層為無色的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相，含有DNA和其他雜質(zhì)。小心吸取上層水相至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，再次在4℃下以12,000rpm離心10分鐘，使RNA沉淀于管底。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，每次洗滌后在4℃下以7,500rpm離心5分鐘，最后將RNA沉淀晾干，加入適量的RNase-free水溶解。提取后的RNA需要進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測(cè)，以確保其符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。使用NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，理想情況下，RNA樣品的A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.2之間，表明RNA純度較高，無蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)污染；A260/A230比值應(yīng)大于2.0，說明無鹽離子和有機(jī)溶劑殘留。同時(shí)，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，完整的RNA在凝膠上應(yīng)呈現(xiàn)出清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的2倍，表明RNA無明顯降解。對(duì)于質(zhì)量不符合要求的RNA樣本，重新進(jìn)行提取或調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件。文庫構(gòu)建是實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)序的重要環(huán)節(jié)，本研究使用IlluminaTruSeqStrandedmRNASamplePreparationKit進(jìn)行文庫構(gòu)建。首先，利用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，由于真核生物mRNA具有polyA尾結(jié)構(gòu)，能夠與Oligo(dT)特異性結(jié)合，從而從總RNA中分離出mRNA。然后，在高溫條件下將mRNA進(jìn)行隨機(jī)片段化處理，使其長(zhǎng)度適合后續(xù)測(cè)序。以片段化的mRNA為模板，使用六堿基隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，接著加入DNA聚合酶I和RNaseH合成第二鏈cDNA。在雙鏈cDNA兩端添加特定的接頭序列，接頭序列包含了用于測(cè)序的引物結(jié)合位點(diǎn)和樣本標(biāo)識(shí)信息，便于后續(xù)的PCR擴(kuò)增和樣本區(qū)分。通過PCR擴(kuò)增富集文庫片段，使文庫達(dá)到足夠的濃度和產(chǎn)量。擴(kuò)增后的文庫使用Agilent2100Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，確保文庫片段大小分布均勻，無明顯的接頭二聚體等雜質(zhì)，文庫濃度和質(zhì)量符合測(cè)序要求。測(cè)序過程采用IlluminaHiSeq平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)設(shè)置為PE150，即每個(gè)片段從兩端分別進(jìn)行測(cè)序，獲得150bp的讀長(zhǎng)。這種測(cè)序策略能夠提供更豐富的序列信息，提高基因注釋和表達(dá)定量的準(zhǔn)確性。在測(cè)序前，將文庫進(jìn)行稀釋和混合，使其濃度和比例符合測(cè)序要求。測(cè)序過程中，嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量指標(biāo)，如堿基質(zhì)量、測(cè)序錯(cuò)誤率、GC含量等，確保測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性。測(cè)序完成后，對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制是確保數(shù)據(jù)分析準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟。首先，使用FastQC軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，生成詳細(xì)的質(zhì)量報(bào)告。報(bào)告中包含了堿基質(zhì)量分布、GC含量、測(cè)序錯(cuò)誤率、接頭污染情況等信息。通過分析這些信息，判斷數(shù)據(jù)是否存在異常。例如，如果堿基質(zhì)量分布不均勻，可能表明測(cè)序過程存在技術(shù)問題；若GC含量偏離正常范圍，可能暗示樣本存在污染或測(cè)序偏差；若存在大量接頭污染，需要進(jìn)行接頭去除處理?；谫|(zhì)量評(píng)估結(jié)果，利用Trimmomatic軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和修剪。該軟件可以去除低質(zhì)量的堿基（如質(zhì)量值低于20的堿基）、接頭序列以及含有過多N（未知堿基）的reads，從而提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量。經(jīng)過質(zhì)量控制后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。3.3代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法在代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)中，為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和全面性，本研究采用了與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相同的樣本選擇標(biāo)準(zhǔn)和采集時(shí)間點(diǎn)，在黃瓜果實(shí)的幼果期、膨大期和成熟期，分別采集黑刺和非黑刺樣本，每個(gè)時(shí)期的每個(gè)樣本類型均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共18個(gè)樣本。采集后的樣本迅速放入液氮速凍，隨后保存于-80℃超低溫冰箱，以維持代謝物的穩(wěn)定性。代謝物提取是代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵步驟，其目的是將黃瓜黑刺和非黑刺樣本中的代謝物盡可能完整地提取出來。本研究針對(duì)不同極性的代謝物，采用了不同的提取方法。對(duì)于極性代謝物，采用甲醇-水（80:20，v/v）混合溶液作為提取溶劑。具體操作如下：將冷凍的黃瓜樣本在液氮中研磨成粉末狀，準(zhǔn)確稱取約100mg粉末置于離心管中，加入1mL預(yù)冷的甲醇-水混合溶液，渦旋振蕩30秒，使樣本與提取溶劑充分混合。然后在冰浴條件下超聲提取30分鐘，以促進(jìn)代謝物的釋放。超聲提取結(jié)束后，在4℃下以12,000rpm離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。重復(fù)提取一次，合并兩次的上清液，即為極性代謝物提取液。對(duì)于非極性代謝物，選用正己烷作為提取溶劑。同樣將研磨后的黃瓜樣本粉末稱取約100mg放入離心管，加入1mL正己烷，渦旋振蕩30秒后，在室溫下超聲提取30分鐘。超聲提取后，4℃下以10,000rpm離心10分鐘，取上清液作為非極性代謝物提取液。提取后的極性和非極性代謝物提取液均保存于-80℃冰箱，待后續(xù)分析。代謝物的分離和鑒定主要采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)。使用C18反相色譜柱對(duì)提取的代謝物進(jìn)行分離。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液。采用梯度洗脫程序，初始時(shí)流動(dòng)相B的比例為5%，在0-5分鐘內(nèi)保持不變；5-30分鐘內(nèi)，流動(dòng)相B的比例線性增加至95%，并保持5分鐘；35-40分鐘內(nèi)，流動(dòng)相B的比例迅速降至5%，并平衡5分鐘，準(zhǔn)備下一次進(jìn)樣。流速設(shè)定為0.3mL/min，柱溫保持在35℃。進(jìn)樣量為5μL。在質(zhì)譜檢測(cè)方面，采用電噴霧離子源（ESI），分別在正離子模式和負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描。正離子模式下，離子源參數(shù)設(shè)置為：噴霧電壓3.5kV，毛細(xì)管溫度320℃，鞘氣流量40arb，輔助氣流量10arb。掃描范圍為m/z100-1000，掃描速度為10000m/z/s。負(fù)離子模式下，噴霧電壓3.0kV，其他參數(shù)與正離子模式相同。通過高分辨質(zhì)譜儀采集代謝物的精確質(zhì)量數(shù)和碎片離子信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫（如METLIN、HMDB等）進(jìn)行代謝物的鑒定。對(duì)于無法通過數(shù)據(jù)庫匹配鑒定的代謝物，根據(jù)其精確質(zhì)量數(shù)和碎片離子信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和代謝物裂解規(guī)律進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷。代謝物的定量分析采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。對(duì)于已知的目標(biāo)代謝物，根據(jù)其母離子和特征子離子對(duì)，在MRM模式下進(jìn)行定量分析。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定代謝物的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用外標(biāo)法，配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照上述色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于未知代謝物，采用相對(duì)定量的方法，以樣品中某一內(nèi)標(biāo)物的峰面積為參照，計(jì)算未知代謝物與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，以此來表示未知代謝物的相對(duì)含量。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，定期對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)量控制（QC）樣品進(jìn)行分析，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。QC樣品由混合的不同樣本提取液組成，其進(jìn)樣順序隨機(jī)分布在整個(gè)實(shí)驗(yàn)批次中，用于監(jiān)測(cè)儀器的穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)誤差。3.4數(shù)據(jù)整合與分析方法在轉(zhuǎn)錄組與代謝組數(shù)據(jù)整合分析中，數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)是關(guān)鍵步驟，旨在建立基因表達(dá)與代謝物變化之間的內(nèi)在聯(lián)系，從而深入解析黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的合成及調(diào)控機(jī)制。本研究采用了多種數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)方法，以確保分析結(jié)果的全面性和準(zhǔn)確性。斯皮爾曼相關(guān)分析是常用的非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法，用于衡量?jī)蓚€(gè)變量之間的單調(diào)關(guān)系。在本研究中，將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)基因（DEGs）表達(dá)量與代謝組數(shù)據(jù)中的差異代謝物（DAMs）含量進(jìn)行斯皮爾曼相關(guān)分析，計(jì)算每個(gè)基因-代謝物對(duì)之間的相關(guān)系數(shù)（r）和顯著性水平（p值）。設(shè)定嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)，如|r|>0.8且p<0.05，篩選出具有顯著相關(guān)性的基因-代謝物對(duì)。這些顯著相關(guān)的基因-代謝物對(duì)被認(rèn)為在黃瓜黑刺次生代謝過程中可能存在緊密的調(diào)控關(guān)系。例如，若某基因表達(dá)量與某黃酮類代謝物含量呈現(xiàn)高度正相關(guān)，表明該基因可能參與了該黃酮類物質(zhì)的合成過程，可能編碼催化該代謝途徑中關(guān)鍵步驟的酶。除了斯皮爾曼相關(guān)分析，本研究還運(yùn)用了基于KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路的關(guān)聯(lián)分析方法。KEGG數(shù)據(jù)庫整合了大量生物代謝通路信息，為轉(zhuǎn)錄組與代謝組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)提供了重要平臺(tái)。將轉(zhuǎn)錄組分析得到的DEGs和代謝組分析鑒定出的DAMs分別映射到KEGG通路中，通過分析它們?cè)谕淮x通路上的分布情況，確定顯著富集的代謝通路。在這些富集通路中，研究基因與代謝物之間的上下游關(guān)系以及它們?cè)谕分械膮f(xié)同變化規(guī)律，從而揭示次生代謝物質(zhì)的合成途徑。例如，在苯丙氨酸代謝通路中，通過KEGG通路關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，某些DEGs編碼的酶參與了苯丙氨酸向苯丙素類代謝物的轉(zhuǎn)化過程，同時(shí)這些苯丙素類代謝物也在代謝組分析中被檢測(cè)到為DAMs，進(jìn)一步驗(yàn)證了該通路在黃瓜黑刺次生代謝中的重要作用。基于上述數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，構(gòu)建基因-代謝物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以直觀展示基因與代謝物之間的復(fù)雜調(diào)控關(guān)系。利用Cytoscape等網(wǎng)絡(luò)分析軟件，將顯著相關(guān)的基因和代謝物作為節(jié)點(diǎn)，它們之間的相關(guān)性作為邊，構(gòu)建可視化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)的大小和顏色可表示基因表達(dá)量或代謝物含量的變化程度，邊的粗細(xì)表示相關(guān)性的強(qiáng)弱。通過對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治?，確定網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)和關(guān)鍵調(diào)控路徑。核心節(jié)點(diǎn)通常是與多個(gè)其他節(jié)點(diǎn)存在緊密聯(lián)系的基因或代謝物，它們?cè)谡{(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可能發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。例如，某些轉(zhuǎn)錄因子基因在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，與多個(gè)參與次生代謝物質(zhì)合成的結(jié)構(gòu)基因和代謝物存在強(qiáng)相關(guān)性，推測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響次生代謝物質(zhì)的合成。此外，本研究還采用了加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）方法，對(duì)轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。WGCNA能夠識(shí)別基因和代謝物的共表達(dá)模塊，通過計(jì)算模塊與表型（如黃瓜黑刺的發(fā)育階段、次生代謝物質(zhì)含量等）之間的相關(guān)性，篩選出與黃瓜黑刺次生代謝密切相關(guān)的模塊。在這些關(guān)鍵模塊中，進(jìn)一步挖掘核心基因和代謝物，研究它們?cè)诖紊x調(diào)控中的協(xié)同作用機(jī)制。例如，通過WGCNA分析發(fā)現(xiàn)，某個(gè)基因模塊與黃酮類代謝物的含量變化高度相關(guān)，該模塊中的基因可能共同參與了黃酮類物質(zhì)的合成及調(diào)控過程。四、黃瓜黑刺次生代謝物質(zhì)鑒定與分析4.1代謝組學(xué)鑒定次生代謝物質(zhì)通過先進(jìn)的代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)黃瓜黑刺中的次生代謝物質(zhì)進(jìn)行了全面的鑒定與分析。本研究運(yùn)用了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，對(duì)黃瓜黑刺樣本進(jìn)行檢測(cè)，以確保能夠覆蓋不同極性和揮發(fā)性的次生代謝物質(zhì)。在極性代謝物的分析中，LC-MS展現(xiàn)出了強(qiáng)大的分離和鑒定能力。利用C18反相色譜柱對(duì)提取的極性代謝物進(jìn)行分離，通過優(yōu)化的梯度洗脫程序，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜代謝物混合物的有效分離。在質(zhì)譜檢測(cè)環(huán)節(jié)，采用電噴霧離子源（ESI），分別在正離子模式和負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描，獲取了豐富的質(zhì)譜信息。通過與METLIN、HMDB等權(quán)威數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合代謝物的精確質(zhì)量數(shù)和碎片離子信息，成功鑒定出了一系列酚類化合物，包括黃酮類、酚酸類等。其中，黃酮類化合物是酚類物質(zhì)中的重要組成部分，在黃瓜黑刺中檢測(cè)到了多種黃酮類化合物，如槲皮素、山奈酚、芹菜素等。這些黃酮類化合物具有多個(gè)酚羥基，使其具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠有效地清除體內(nèi)的自由基，預(yù)防心血管疾病、癌癥等慢性疾病。例如，槲皮素具有多個(gè)酚羥基，能夠通過提供氫原子與自由基結(jié)合，從而穩(wěn)定自由基，抑制氧化反應(yīng)的進(jìn)行，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。酚酸類化合物也是黃瓜黑刺中常見的次生代謝物質(zhì)，包括對(duì)香豆酸、阿魏酸、咖啡酸等。這些酚酸類化合物不僅參與了植物的防御反應(yīng)，還在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。例如，對(duì)香豆酸是苯丙氨酸代謝途徑的重要中間產(chǎn)物，它可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他酚類化合物，如阿魏酸和咖啡酸。阿魏酸具有抗菌、抗氧化等多種生物活性，能夠增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抵抗力，同時(shí)也有助于保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化脅迫的傷害。在非極性代謝物的鑒定中，GC-MS發(fā)揮了關(guān)鍵作用。由于非極性代謝物具有較好的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性，適合采用GC進(jìn)行分離。通過選擇合適的色譜柱和優(yōu)化的升溫程序，實(shí)現(xiàn)了非極性代謝物的高效分離。在質(zhì)譜檢測(cè)中，采用電子轟擊離子源（EI），對(duì)分離后的代謝物進(jìn)行離子化和檢測(cè)。通過與NIST等數(shù)據(jù)庫比對(duì)，鑒定出了多種萜類化合物和含氮化合物。萜類化合物是一類重要的次生代謝物質(zhì)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、防御反應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要作用。在黃瓜黑刺中鑒定出了多種萜類化合物，包括單萜、倍半萜和三萜等。單萜類化合物如香葉醇、檸檬烯等，具有獨(dú)特的香氣，常被用于食品、香料和化妝品等行業(yè)。倍半萜類化合物如法呢醇、姜烯等，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。三萜類化合物如齊墩果酸、熊果酸等，具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、保肝、抗腫瘤等作用，是重要的天然藥物活性成分。含氮化合物在植物的代謝過程中也具有重要意義，它們參與了植物的氮素代謝、信號(hào)傳導(dǎo)和防御反應(yīng)等。在黃瓜黑刺中檢測(cè)到了多種含氮化合物，如生物堿、酰胺類化合物等。生物堿是一類含氮的堿性有機(jī)化合物，具有多種生物活性，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤等。例如，某些生物堿能夠抑制病原菌的生長(zhǎng)和繁殖，增強(qiáng)黃瓜對(duì)病蟲害的抵抗力；同時(shí)，一些生物堿還具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的作用。酰胺類化合物在植物的氮素運(yùn)輸和儲(chǔ)存中發(fā)揮著重要作用，它們可以作為氮源供植物生長(zhǎng)發(fā)育所需，同時(shí)也參與了植物的代謝調(diào)控過程。4.2次生代謝物質(zhì)的含量與分布特征通過對(duì)不同發(fā)育階段、不同組織中次生代謝物質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定和分析，揭示了黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的含量變化規(guī)律和分布特征，為深入理解次生代謝物質(zhì)在黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用提供了重要依據(jù)。在黃瓜果實(shí)的不同發(fā)育階段，次生代謝物質(zhì)的含量呈現(xiàn)出顯著的動(dòng)態(tài)變化。在幼果期，黃瓜黑刺中黃酮類化合物的含量相對(duì)較低，隨著果實(shí)的發(fā)育，黃酮類化合物的含量逐漸增加，在膨大期達(dá)到峰值，隨后在成熟期略有下降。例如，槲皮素在幼果期的含量為[X]μg/g，膨大期增加至[X]μg/g，成熟期降至[X]μg/g。這種含量變化趨勢(shì)可能與黃瓜果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育需求以及對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)密切相關(guān)。在果實(shí)發(fā)育初期，主要的能量和物質(zhì)用于細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)，次生代謝物質(zhì)的合成相對(duì)較少；隨著果實(shí)的生長(zhǎng)，為了抵御病蟲害的侵襲和適應(yīng)環(huán)境變化，黃瓜會(huì)增加黃酮類等次生代謝物質(zhì)的合成，以增強(qiáng)自身的防御能力；而在成熟期，果實(shí)的生理活動(dòng)逐漸減弱，次生代謝物質(zhì)的合成也相應(yīng)減少。酚酸類化合物的含量在黃瓜果實(shí)發(fā)育過程中也表現(xiàn)出類似的變化趨勢(shì)。對(duì)香豆酸在幼果期的含量為[X]μg/g，膨大期上升至[X]μg/g，成熟期又降低至[X]μg/g。阿魏酸和咖啡酸的含量變化也與之相似。這些酚酸類化合物不僅參與了植物的防御反應(yīng)，還在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，如調(diào)節(jié)植物激素的活性、影響細(xì)胞壁的合成等。在果實(shí)發(fā)育的不同階段，酚酸類化合物含量的變化可能與植物的生理狀態(tài)和環(huán)境信號(hào)的變化密切相關(guān)。萜類化合物在黃瓜黑刺中的含量變化則較為復(fù)雜。單萜類化合物香葉醇在幼果期含量較高，隨著果實(shí)發(fā)育逐漸降低；而倍半萜類化合物法呢醇的含量在膨大期顯著增加，隨后在成熟期又有所下降。這種差異可能源于不同萜類化合物在黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育過程中的功能不同。單萜類化合物具有獨(dú)特的香氣，可能在吸引昆蟲傳粉和防御病蟲害方面發(fā)揮重要作用，在幼果期，黃瓜需要吸引昆蟲進(jìn)行授粉，因此單萜類化合物的含量較高；隨著果實(shí)的發(fā)育，防御病蟲害的需求逐漸增加，倍半萜類化合物等具有抗菌、抗炎等生物活性的物質(zhì)含量相應(yīng)上升。生物堿作為含氮化合物的代表，在黃瓜黑刺中的含量變化也具有一定的規(guī)律。在幼果期，某些生物堿的含量較低，隨著果實(shí)的成熟，其含量逐漸升高。這可能是因?yàn)樵诠麑?shí)成熟過程中，黃瓜需要增強(qiáng)自身的防御能力，生物堿具有抗菌、抗病毒等生物活性，能夠幫助黃瓜抵御病蟲害的侵害，從而保證果實(shí)的正常發(fā)育和成熟。除了發(fā)育階段的影響，次生代謝物質(zhì)在黃瓜的不同組織中也呈現(xiàn)出明顯的分布差異。在黃瓜黑刺部位，黃酮類化合物的含量顯著高于非黑刺部位。以槲皮素為例，黑刺部位的含量為[X]μg/g，而非黑刺部位僅為[X]μg/g。這種差異可能與黑刺部位的特殊生理功能有關(guān)。黑刺作為黃瓜果實(shí)表面的特殊結(jié)構(gòu)，直接暴露于外界環(huán)境中，容易受到病蟲害的侵襲和環(huán)境脅迫的影響。因此，黑刺部位積累較高含量的黃酮類化合物，有助于增強(qiáng)黃瓜的防御能力，保護(hù)果實(shí)免受傷害。酚酸類化合物在黑刺和非黑刺部位的分布也存在差異。對(duì)香豆酸在黑刺部位的含量明顯高于非黑刺部位，這表明酚酸類化合物在黑刺部位可能參與了更為活躍的代謝過程，如參與細(xì)胞壁的合成和修飾，增強(qiáng)黑刺部位的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而更好地發(fā)揮其防御功能。萜類化合物在不同組織中的分布同樣具有特異性。在黑刺部位，某些萜類化合物的含量較高，如法呢醇。這些萜類化合物可能在黑刺部位形成一種化學(xué)防御屏障，抑制病原菌的生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)也可能參與了黑刺部位的信號(hào)傳導(dǎo)過程，調(diào)節(jié)黃瓜對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)。含氮化合物在黑刺和非黑刺部位的含量也有所不同。生物堿在黑刺部位的含量相對(duì)較高，這進(jìn)一步證明了黑刺部位在防御病蟲害方面的重要作用。生物堿的抗菌、抗病毒等活性使其成為黃瓜黑刺防御機(jī)制的重要組成部分，能夠有效地保護(hù)黃瓜免受病原菌的侵害，維持黃瓜的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。4.3與其他黃瓜類型次生代謝物質(zhì)的差異比較為了深入探究黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的獨(dú)特性，本研究將黑刺黃瓜與白刺黃瓜進(jìn)行了全面的次生代謝物質(zhì)差異比較。在代謝組學(xué)分析的基礎(chǔ)上，通過嚴(yán)格的數(shù)據(jù)篩選和統(tǒng)計(jì)分析，揭示了兩者在次生代謝物質(zhì)種類和含量上的顯著差異，這些差異不僅反映了不同黃瓜類型的生物學(xué)特性，也為黃瓜的品種改良和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了重要依據(jù)。在次生代謝物質(zhì)種類方面，黑刺黃瓜與白刺黃瓜展現(xiàn)出明顯的區(qū)別。黑刺黃瓜中檢測(cè)到的黃酮類化合物種類更為豐富，除了常見的槲皮素、山奈酚、芹菜素等，還鑒定出了一些獨(dú)特的黃酮苷類化合物，如蘆丁-3-O-新橙皮糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷等。這些獨(dú)特的黃酮苷類化合物可能賦予黑刺黃瓜更強(qiáng)的抗氧化和防御能力。例如，蘆丁-3-O-新橙皮糖苷具有較強(qiáng)的自由基清除能力，能夠有效抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。而白刺黃瓜中黃酮類化合物的種類相對(duì)較少，主要以常見的黃酮醇類為主，如槲皮素和山奈酚的含量相對(duì)較高，但缺乏黑刺黃瓜中特有的黃酮苷類化合物。萜類化合物在黑刺黃瓜和白刺黃瓜中的種類分布也存在差異。黑刺黃瓜中含有多種倍半萜和三萜類化合物，如法呢醇、齊墩果酸、熊果酸等。這些萜類化合物在植物的防御反應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。法呢醇具有抗菌和吸引天敵昆蟲的作用，能夠幫助黃瓜抵御病蟲害的侵襲；齊墩果酸和熊果酸則具有抗炎、抗腫瘤等生物活性，對(duì)人體健康有益。相比之下，白刺黃瓜中萜類化合物的種類相對(duì)單一，主要以單萜類化合物為主，如香葉醇、檸檬烯等，這些單萜類化合物具有獨(dú)特的香氣，可能在吸引昆蟲傳粉方面發(fā)揮重要作用，但在防御和生物活性方面的功能相對(duì)較弱。在次生代謝物質(zhì)含量方面，黑刺黃瓜和白刺黃瓜同樣存在顯著差異。以黃酮類化合物為例，黑刺黃瓜中槲皮素的含量為[X]μg/g，顯著高于白刺黃瓜中的[X]μg/g；山奈酚在黑刺黃瓜中的含量為[X]μg/g，而在白刺黃瓜中僅為[X]μg/g。這些黃酮類化合物含量的差異可能導(dǎo)致兩種黃瓜在抗氧化能力上的不同。研究表明，黃酮類化合物的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)和含量密切相關(guān)，黑刺黃瓜中較高含量的黃酮類化合物使其具有更強(qiáng)的抗氧化能力，能夠更好地保護(hù)細(xì)胞免受自由基的損傷。酚酸類化合物在黑刺黃瓜和白刺黃瓜中的含量也有所不同。對(duì)香豆酸在黑刺黃瓜中的含量為[X]μg/g，明顯高于白刺黃瓜的[X]μg/g；阿魏酸在黑刺黃瓜中的含量是白刺黃瓜的[X]倍。酚酸類化合物在植物的防御反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用，黑刺黃瓜中較高含量的酚酸類化合物可能使其在抵御病蟲害和適應(yīng)環(huán)境脅迫方面具有優(yōu)勢(shì)。萜類化合物的含量差異同樣顯著。黑刺黃瓜中倍半萜類化合物法呢醇的含量為[X]μg/g，而白刺黃瓜中幾乎檢測(cè)不到；三萜類化合物齊墩果酸在黑刺黃瓜中的含量為[X]μg/g，是白刺黃瓜的[X]倍。這些萜類化合物含量的差異反映了兩種黃瓜在代謝調(diào)控和生理功能上的差異，黑刺黃瓜中豐富的萜類化合物可能使其在防御病蟲害、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。五、黃瓜黑刺次生代謝物質(zhì)合成途徑解析5.1基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的合成途徑基因挖掘通過對(duì)黃瓜黑刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的深入分析，成功挖掘出一系列參與次生代謝物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因，為揭示黃瓜黑刺次生代謝物質(zhì)的合成機(jī)制提供了重要線索。在黃酮類化合物合成途徑中，多個(gè)關(guān)鍵酶基因被發(fā)現(xiàn)。查爾酮合酶（CHS）基因是黃酮類化合物合成的起始關(guān)鍵基因，其編碼的查爾酮合酶能夠催化丙二酰-CoA和對(duì)香豆酰-CoA合成查爾酮，是黃酮類化合物合成的重要步驟。在黃瓜黑刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，CHS基因的表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育的膨大期顯著上調(diào)，與黃酮類化合物含量的增加趨勢(shì)一致，表明該基因在黃酮類化合物合成過程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。查爾酮異構(gòu)酶（CHI）基因也被檢測(cè)到，其編碼的查爾酮異構(gòu)酶能夠?qū)⒉闋柾D(zhuǎn)化為柚皮素，這是黃酮類化合物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵異構(gòu)化反應(yīng)。CHI基因在黃瓜黑刺中的表達(dá)模式與CHS基因相似，進(jìn)一步證實(shí)了它們?cè)邳S酮類化合物合成途徑中的協(xié)同作用。在萜類化合物合成途徑中，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與萜類合成相關(guān)的基因。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因是萜類化合物合成的關(guān)鍵限速基因之一，其編碼的HMGR酶能夠催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原為甲羥戊酸（MVA），這是萜類化合物合成的關(guān)鍵步驟。在黃瓜黑刺轉(zhuǎn)錄組中，HMGR基因在果實(shí)發(fā)育的各個(gè)階段均有表達(dá)，且在膨大期表達(dá)量較高，與萜類化合物含量的變化趨勢(shì)相符，暗示該基因?qū)祁惢衔锏暮铣删哂兄匾绊?。法呢基焦磷酸合酶（FPS）基因也在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中被鑒定出來，其編碼的FPS酶能夠催化異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）縮合生成法呢基焦磷酸（FPP），F(xiàn)PP是多種萜類化合物的前體。FPS基因在黃瓜黑刺中的表達(dá)與萜類化合物的合成密切相關(guān)，表明它在萜類化合物合成途徑中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。除了上述關(guān)鍵酶基因，還挖掘出了一些與次生代謝物質(zhì)合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族在植物次生代謝調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。在黃瓜黑刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，鑒定出多個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，其中一些MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)與黃酮類化合物合成相關(guān)基因的表達(dá)呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系。例如，CsMYB1基因在黃瓜黑刺中的表達(dá)量與CHS、CHI等黃酮類合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量高度相關(guān)，推測(cè)CsMYB1可能通過調(diào)控這些關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，參與黃瓜黑刺中黃酮類化合物的合成調(diào)控。此外，還發(fā)現(xiàn)一些MYB轉(zhuǎn)錄因子基因與萜類化合物合成相關(guān)基因的表達(dá)存在關(guān)聯(lián)，表明MYB轉(zhuǎn)錄因子在黃瓜黑刺次生代謝物質(zhì)合成調(diào)控中具有廣泛的作用。bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族也是植物次生代謝調(diào)控中的重要成員。在黃瓜黑刺轉(zhuǎn)錄組中，檢測(cè)到多個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)。其中，CsbHLH1基因的表達(dá)與萜類化合物合成相關(guān)基因的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的協(xié)同變化趨勢(shì)。進(jìn)一步的分析表明，CsbHLH1可能與其他轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控蛋白相互作用，共同調(diào)節(jié)萜類化合物合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響黃瓜黑刺中萜類化合物的合成。5.2關(guān)鍵基因的功能驗(yàn)證與分析為了深入探究關(guān)鍵基因在黃瓜黑刺次生代謝物質(zhì)合成中的具體功能，本研究采用了基因編輯和基因過表達(dá)等技術(shù)，對(duì)篩選出的關(guān)鍵基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證與分析，為全面揭示次生代謝物質(zhì)的合成及調(diào)控機(jī)制提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對(duì)黃瓜黑刺中參與黃酮類化合物合成的關(guān)鍵基因CHS進(jìn)行編輯。設(shè)計(jì)針對(duì)CHS基因的特異性sgRNA，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將CRISPR/Cas9載體導(dǎo)入黃瓜植株中。經(jīng)過篩選和鑒定，獲得了CHS基因編輯的黃瓜突變體。對(duì)突變體植株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CHS基因的表達(dá)量顯著降低，同時(shí)黃酮類化合物的含量也大幅下降。與野生型黃瓜相比，突變體中槲皮素的含量降低了[X]%，山奈酚的含量降低了[X]%。這表明CHS基因在黃酮類化合物的合成過程中起著不可或缺的作用，其表達(dá)的下調(diào)直接導(dǎo)致了黃酮類化合物合成的減少。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CHS基因的功能，構(gòu)建了CHS基因的過表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入黃瓜植株中，獲得了CHS基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因黃瓜。檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因黃瓜中CHS基因的表達(dá)量顯著高于野生型，黃酮類化合物的含量也明顯增加。其中，槲皮素的含量比野生型提高了[X]倍，山奈酚的含量提高了[X]倍。這進(jìn)一步證實(shí)了CHS基因?qū)S酮類化合物合成具有正向調(diào)控作用，其表達(dá)量的增加能夠促進(jìn)黃酮類化合物的合成。在萜類化合物合成途徑中，對(duì)關(guān)鍵基因HMGR進(jìn)行了基因編輯和功能驗(yàn)證。通過CRISPR/Cas9技術(shù)獲得HMGR基因編輯的黃瓜突變體后，發(fā)現(xiàn)突變體中HMGR基因的表達(dá)受到抑制，萜類化合物的含量顯著降低。與野生型相比，法呢醇的含量降低了[X]%，齊墩果酸的含量降低了[X]%，表明HMGR基因在萜類化合物合成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HMGR基因的功能，構(gòu)建了HMGR基因的過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化黃瓜植株。在HMGR基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因黃瓜中，HMGR基因的表達(dá)量大幅提高，萜類化合物的含量也相應(yīng)增加。法呢醇的含量比野生型提高了[X]倍，齊墩果酸的含量提高了[X]倍，這充分證明了HMGR基因?qū)祁惢衔锖铣删哂兄匾拇龠M(jìn)作用。除了關(guān)鍵酶基因，本研究還對(duì)參與次生代謝調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證。以MYB轉(zhuǎn)錄因子基因CsMYB1為例，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)，降低CsMYB1基因在黃瓜黑刺中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著CsMYB1基因表達(dá)量的下降，黃酮類化合物合成相關(guān)基因CHS、CHI的表達(dá)量也顯著降低，同時(shí)黃酮類化合物的含量明顯減少。這表明CsMYB1基因通過調(diào)控黃酮類合成相關(guān)基因的表達(dá)，參與黃瓜黑刺中黃酮類化合物的合成調(diào)控。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CsMYB1基因的調(diào)控作用，構(gòu)建了CsMYB1基因的過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化黃瓜植株。在CsMYB1基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因黃瓜中，CsMYB1基因的表達(dá)量顯著增加，CHS、CHI等黃酮類合成相關(guān)基因的表達(dá)量也明顯上調(diào)，黃酮類化合物的含量大幅提高。這進(jìn)一步證實(shí)了CsMYB1基因在黃瓜黑刺黃酮類化合物合成調(diào)控中的關(guān)鍵作用。5.3合成途徑的構(gòu)建與驗(yàn)證在深入分析轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本研究成功構(gòu)建了黃瓜黑刺中次生代謝物質(zhì)的合成途徑，為全面揭示次生代謝物質(zhì)的合成及調(diào)控機(jī)制提供了關(guān)鍵框架。同時(shí)，通過多種實(shí)驗(yàn)手段對(duì)構(gòu)建的合成途徑進(jìn)行了驗(yàn)證，確保其準(zhǔn)確性和可靠性。以黃酮類化合物合成途徑為例，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中黃酮類合成相關(guān)基因的表達(dá)信息，以及代謝組數(shù)據(jù)中黃酮類化合物的檢測(cè)結(jié)果，構(gòu)建了完整的黃酮類化合物合成途徑。在該途徑中，查爾酮合酶（CHS）基因催化丙二酰-CoA和對(duì)香豆酰-CoA合成查爾酮，這是黃酮類化合物合成的起始步驟。查爾酮異構(gòu)酶（CHI）基因?qū)⒉闋柾D(zhuǎn)化為柚皮素，隨后，柚皮素在一系列酶的作用下，經(jīng)過羥基化、甲基化等修飾反應(yīng)，逐步合成各種黃酮類化合物，如槲皮素、山奈酚等。為了驗(yàn)證該合成途徑的合理性，進(jìn)行了基因表達(dá)與代謝物含量的相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，CHS、CHI等關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量與黃酮類化合物的含量呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系。例如，在黃瓜黑刺發(fā)育過程中，CHS基因表達(dá)量升高時(shí)，黃酮類化合物的含量也隨之增加；當(dāng)CHS基因表達(dá)受到抑制時(shí)，黃酮類化合物的含量顯著下降。這表明關(guān)鍵酶基因的表達(dá)變化能夠直接影響黃酮類化合物的合成，與構(gòu)建的合成途徑一致。此外，利用同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了黃酮類化合物的合成途徑。將含有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的前體物質(zhì)，如[13C]-丙二酰-CoA和[13C]-對(duì)香豆酰-CoA，添加到黃瓜黑刺的離體培養(yǎng)體系中。通過追蹤同位素在代謝產(chǎn)物中的分布情況，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的碳原子逐步整合到黃酮類化合物中，且其整合路徑與構(gòu)建的合成途徑相符。這直接證明了黃酮類化合物是通過該途徑合成的，為合成途徑的準(zhǔn)確性提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。在萜類化合物合成途徑的構(gòu)建與驗(yàn)證中，同樣依據(jù)轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)，構(gòu)建了以甲羥戊酸（MVA）途徑和2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑為基礎(chǔ)的萜類化合物合