基于途徑改造與共培養(yǎng)策略的N-乙酰神經(jīng)氨酸生物合成優(yōu)化研究一、引言1.1N-乙酰神經(jīng)氨酸的重要性及應(yīng)用領(lǐng)域N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-AcetylneuraminicAcid，簡(jiǎn)稱NeuAc），又稱唾液酸，是一類9碳單糖的衍生物，在生物體內(nèi)扮演著極為關(guān)鍵的角色，廣泛參與眾多重要的生理過程。在分子結(jié)構(gòu)上，它具有獨(dú)特的9碳骨架，且?guī)в幸粋€(gè)乙酰氨基和多個(gè)羥基，這種特殊結(jié)構(gòu)賦予了它多樣的生物學(xué)功能。NeuAc通常位于細(xì)胞表面糖蛋白或者糖脂的末端，是維持生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，在細(xì)胞和分子之間的識(shí)別、信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮不可或缺的作用，對(duì)細(xì)胞粘附、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、糖蛋白穩(wěn)定性、細(xì)菌毒力和腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)、病理學(xué)和免疫識(shí)別過程產(chǎn)生影響。在醫(yī)藥領(lǐng)域，NeuAc展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價(jià)值，是眾多藥物研發(fā)的關(guān)鍵原料。以抗病毒藥物扎那米韋為例，它是N-乙酰神經(jīng)氨酸的類似物，通過與流感病毒表面的神經(jīng)氨酸酶結(jié)合，有效抑制病毒從感染細(xì)胞中釋放，從而達(dá)到治療和預(yù)防A型和B型流感病毒的目的，為流感的防治提供了有力武器。同時(shí)，由于NeuAc具有抗菌排毒、抗粘附和抗癌等功能，在癌癥的靶向治療研究中也備受關(guān)注，科研人員期望通過對(duì)其作用機(jī)制的深入探索，開發(fā)出更多高效、低毒的抗癌藥物，為癌癥患者帶來新的希望。在食品營(yíng)養(yǎng)方面，NeuAc對(duì)嬰幼兒的成長(zhǎng)發(fā)育意義重大。外源性膳食補(bǔ)充NeuAc有利于促進(jìn)嬰幼兒大腦的生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)記憶力和學(xué)習(xí)能力。大腦的發(fā)育離不開充足的營(yíng)養(yǎng)支持，而NeuAc作為一種重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠參與大腦神經(jīng)細(xì)胞的構(gòu)建和信號(hào)傳導(dǎo)，為嬰幼兒的智力和認(rèn)知發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。基于此，許多嬰幼兒食品中都添加了NeuAc，以提升產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，滿足嬰幼兒特殊的營(yíng)養(yǎng)需求。隨著人們對(duì)健康的關(guān)注度不斷提高，NeuAc在保健品領(lǐng)域也逐漸嶄露頭角，被廣泛應(yīng)用于各種健腦、增強(qiáng)免疫力的產(chǎn)品中。在化妝品領(lǐng)域，N-乙酰神經(jīng)氨酸也開始得到應(yīng)用。由于其具有保濕、亮膚、抗皺、緊致以及修復(fù)保濕的作用，被添加到一些高端護(hù)膚品中。比如國(guó)內(nèi)化妝品品牌自然堂推出的燕窩酸御齡凝脂面膜，就使用了高純度（≥98%濃度）N-乙酰神經(jīng)氨酸作為主要功效宣稱成分，該產(chǎn)品中還含有肌肽、膠原蛋白肽，以及玻尿酸等保濕、抗衰成分，主要具有緊致、滋潤(rùn)皮膚的效果。武漢中科光谷綠色生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的N-乙酰神經(jīng)氨酸作為保濕劑，可用于全身皮膚保養(yǎng)護(hù)理，且已被列入美國(guó)個(gè)人護(hù)理品協(xié)會(huì)的INCI、歐盟的Cosing、以及澳大利亞的AICS等國(guó)家地區(qū)的化妝品原料目錄內(nèi)，國(guó)外眾多主打“燕窩”概念的護(hù)膚產(chǎn)品，有效成分即為N-乙酰神經(jīng)氨酸，如SNP海洋燕窩補(bǔ)水面膜、CELVOKE燕窩系列、澳蘭黛燕窩滋養(yǎng)系列等。1.2生物合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的研究現(xiàn)狀目前，N-乙酰神經(jīng)氨酸的生物合成主要通過微生物發(fā)酵法實(shí)現(xiàn)，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等微生物被廣泛用作生產(chǎn)菌株。研究人員通過基因工程技術(shù)，對(duì)這些菌株的代謝途徑進(jìn)行改造，以提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。例如，在大腸桿菌中過量表達(dá)N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶、N-乙酰葡萄糖胺-2-異構(gòu)酶等關(guān)鍵酶，成功構(gòu)建了以葡萄糖為唯一碳源的合成途徑，并通過補(bǔ)料發(fā)酵獲得了較高產(chǎn)量的N-乙酰神經(jīng)氨酸。山東大學(xué)國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心在大腸桿菌中設(shè)計(jì)了一條以葡萄糖為碳源合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的發(fā)酵途徑。過量表達(dá)來自于EscherichiacoliW3110的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶、來自于Synechocystissp.PCC6803的N-乙酰葡萄糖胺-2-異構(gòu)酶，以及來自于SaccharomycescerevisiaeEBY100的葡萄糖胺-6-磷酸?；D(zhuǎn)移酶，構(gòu)建了一條以葡萄糖為唯一碳源以N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸為中間產(chǎn)物的N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑。經(jīng)過一系列的改造優(yōu)化后通過補(bǔ)料發(fā)酵獲得了12g/LN-乙酰神經(jīng)氨酸。之后利用合成生物學(xué)方法構(gòu)建的響應(yīng)神經(jīng)氨酸的高閾值核糖開關(guān)，篩選到一株高產(chǎn)菌株在搖瓶中進(jìn)行了補(bǔ)料發(fā)酵120小時(shí)后產(chǎn)生了16.7g/LNeuAc，進(jìn)一步提高了神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。盡管微生物發(fā)酵法在N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)中展現(xiàn)出巨大潛力，但目前仍存在一些亟待解決的關(guān)鍵問題。在代謝支路方面，N-乙酰神經(jīng)氨酸的代謝途徑較為復(fù)雜，存在多條代謝支路，這些支路會(huì)與目標(biāo)合成途徑競(jìng)爭(zhēng)底物和能量，導(dǎo)致產(chǎn)物合成受到反饋抑制、分解代謝等不利因素的干擾。例如，在某些微生物中，N-乙酰神經(jīng)氨酸可能會(huì)被其他酶催化轉(zhuǎn)化為其他代謝產(chǎn)物，從而降低了其最終產(chǎn)量。在枯草芽孢桿菌中，雖然構(gòu)建了N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成途徑，但在發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)存在一些副反應(yīng)，導(dǎo)致部分底物被消耗在非目標(biāo)產(chǎn)物的合成上，影響了N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量和純度。在代謝途徑和前體供應(yīng)方面，N-乙酰神經(jīng)氨酸的生物合成途徑較長(zhǎng)，涉及多個(gè)酶促反應(yīng)，反應(yīng)過程較為冗雜。相關(guān)關(guān)鍵途徑酶的表達(dá)和活性受到多種因素的調(diào)控，缺乏系統(tǒng)的研究與優(yōu)化，這容易造成前體供應(yīng)失衡。前體物質(zhì)的不足或過量都可能影響N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成效率。如在大腸桿菌的發(fā)酵過程中，若前體物質(zhì)UDP-GlcNAc的供應(yīng)不足，會(huì)導(dǎo)致N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成受阻；反之，若前體物質(zhì)積累過多，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。江南大學(xué)的研究人員在對(duì)大腸桿菌進(jìn)行改造時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)關(guān)鍵前體物質(zhì)ManNAc的合成模塊未得到有效優(yōu)化時(shí)，其產(chǎn)量較低，從而限制了N-乙酰神經(jīng)氨酸的最終合成量。在碳通量競(jìng)爭(zhēng)方面，微生物細(xì)胞內(nèi)存在眾多代謝途徑，這些途徑會(huì)爭(zhēng)奪有限的碳源和能量，導(dǎo)致目標(biāo)途徑的碳通量不足，產(chǎn)率較低。在以葡萄糖為碳源的發(fā)酵過程中，葡萄糖會(huì)被分配到多個(gè)代謝途徑中，如糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)等，只有一部分碳源能夠流向N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成途徑。若不能有效調(diào)節(jié)碳通量的分配，就難以提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。研究表明，在某些菌株中，通過敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑相關(guān)基因，能夠減少碳源的分流，提高目標(biāo)途徑的碳通量，從而顯著提升N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。1.3途徑改造和共培養(yǎng)策略的研究意義途徑改造和共培養(yǎng)策略對(duì)于解決當(dāng)前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸過程中存在的諸多問題，提升其產(chǎn)量和生產(chǎn)效率具有重要意義，是推動(dòng)N-乙酰神經(jīng)氨酸工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)手段。在解決代謝支路和反饋抑制問題方面，途徑改造能夠通過基因編輯技術(shù)，對(duì)微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，有效阻斷或削弱那些與N-乙酰神經(jīng)氨酸合成競(jìng)爭(zhēng)底物和能量的代謝支路。比如，通過敲除某些導(dǎo)致副產(chǎn)物生成的關(guān)鍵基因，減少不必要的代謝分流，使更多的底物和能量流向N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成途徑，從而降低產(chǎn)物合成過程中受到的反饋抑制和分解代謝等不利因素的影響，為N-乙酰神經(jīng)氨酸的高效合成創(chuàng)造有利條件。研究人員發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中敲除與其他代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因后，N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量得到了顯著提升，這充分證明了途徑改造在解決代謝支路問題上的有效性。在優(yōu)化代謝途徑和前體供應(yīng)方面，途徑改造可以對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行優(yōu)化。通過理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化等方法，提高關(guān)鍵酶的活性和穩(wěn)定性，增強(qiáng)其對(duì)底物的親和力，使整個(gè)合成途徑更加高效順暢。還能對(duì)前體物質(zhì)的合成和供應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，確保前體物質(zhì)能夠充足、穩(wěn)定地供應(yīng)給N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成過程。江南大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)通過優(yōu)化大腸桿菌中UDP-GlcNAc的合成模塊，使前體物質(zhì)UDP-GlcNAc的供應(yīng)更加充足，從而顯著提高了N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。在調(diào)節(jié)碳通量競(jìng)爭(zhēng)方面，途徑改造能夠通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶的表達(dá)水平、改變代謝途徑的調(diào)控機(jī)制等方式，優(yōu)化細(xì)胞內(nèi)的碳通量分配，使更多的碳源流向N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成途徑，提高目標(biāo)途徑的碳通量，進(jìn)而提升N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)率。通過對(duì)微生物代謝途徑的深入研究，找到碳通量分配的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，對(duì)這些節(jié)點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，實(shí)現(xiàn)碳源的合理利用，提高生產(chǎn)效率。共培養(yǎng)策略則為N-乙酰神經(jīng)氨酸的生物合成提供了一種全新的思路。通過選擇合適的微生物組合進(jìn)行共培養(yǎng)，不同微生物之間可以形成互利共生的關(guān)系，相互協(xié)作完成N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。一種微生物可以產(chǎn)生另一種微生物所需的前體物質(zhì)或生長(zhǎng)因子，從而彌補(bǔ)單一菌株在合成能力上的不足，實(shí)現(xiàn)資源的高效利用和協(xié)同生產(chǎn)。例如，將能夠高效合成前體物質(zhì)的菌株與能夠?qū)⑶绑w物質(zhì)轉(zhuǎn)化為N-乙酰神經(jīng)氨酸的菌株進(jìn)行共培養(yǎng)，可能會(huì)顯著提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。此外，途徑改造和共培養(yǎng)策略還有助于降低生產(chǎn)成本。通過提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率，可以減少生產(chǎn)過程中的原料消耗、能源消耗以及發(fā)酵時(shí)間等，從而降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。這對(duì)于推動(dòng)N-乙酰神經(jīng)氨酸在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，能夠使更多的消費(fèi)者受益于這種具有重要生物學(xué)功能的物質(zhì)。二、N-乙酰神經(jīng)氨酸生物合成途徑解析2.1天然合成途徑概述N-乙酰神經(jīng)氨酸的天然合成是一個(gè)涉及多種酶和底物的復(fù)雜生化過程，在微生物和動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，其合成途徑主要起始于乙酰輔酶A和相關(guān)糖類底物。在典型的微生物合成途徑中，首先乙酰輔酶A與磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）在N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶（NeuB）的催化作用下，發(fā)生縮合反應(yīng)，生成N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）和磷酸。這個(gè)反應(yīng)是N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑中的關(guān)鍵步驟，NeuB酶的活性和表達(dá)水平對(duì)后續(xù)產(chǎn)物的合成量有著重要影響。研究表明，在大腸桿菌中，通過優(yōu)化NeuB基因的表達(dá)，能夠顯著提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成效率。隨后，ManNAc在N-乙酰甘露糖胺激酶（NanK）的作用下，消耗ATP發(fā)生磷酸化反應(yīng)，生成N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸（ManNAc-6-P）。ATP為該反應(yīng)提供了磷酸基團(tuán)和能量，保證了反應(yīng)的順利進(jìn)行。ManNAc-6-P進(jìn)一步在磷酸甘露糖異構(gòu)酶（Pmi）的催化下，發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸（GlcNAc-6-P）。這些酶促反應(yīng)的特異性和高效性，確保了代謝途徑的有序進(jìn)行。GlcNAc-6-P在一系列酶的作用下，經(jīng)過多步反應(yīng)轉(zhuǎn)化為UDP-N-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）。UDP-GlcNAc作為重要的糖基供體，在N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶（NeuA）的催化下，與磷酸烯醇式丙酮酸再次發(fā)生反應(yīng)，最終生成N-乙酰神經(jīng)氨酸和UDP。這一過程中，各酶之間協(xié)同作用，精確調(diào)控反應(yīng)的進(jìn)程和產(chǎn)物的生成。在枯草芽孢桿菌中，通過對(duì)這些關(guān)鍵酶的表達(dá)調(diào)控和代謝途徑的優(yōu)化，成功提高了N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。在動(dòng)物細(xì)胞中，N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成途徑也有相似之處，但具體的酶和調(diào)控機(jī)制可能存在差異。動(dòng)物細(xì)胞通常以葡萄糖為起始底物，經(jīng)過糖酵解等代謝途徑產(chǎn)生乙酰輔酶A和其他前體物質(zhì)，再逐步合成N-乙酰神經(jīng)氨酸。這一過程涉及多種細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路和調(diào)控因子，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能具有重要意義。2.2常見微生物合成途徑差異不同微生物在N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑上存在顯著差異，這些差異主要體現(xiàn)在酶種類、基因表達(dá)以及代謝調(diào)控等方面，深入了解這些差異對(duì)于優(yōu)化生物合成過程具有重要意義。大腸桿菌作為常用的模式微生物，在N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑上具有獨(dú)特的特點(diǎn)。在酶種類方面，其N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶（NeuB）對(duì)底物乙酰輔酶A和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）具有較高的親和力和催化活性，能夠高效地催化二者縮合生成N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）和磷酸。在基因表達(dá)調(diào)控上，大腸桿菌中N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)受到多種轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控元件的影響。crp基因編碼的cAMP受體蛋白（CRP）可以與相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，在碳源缺乏時(shí)，CRP與cAMP結(jié)合形成復(fù)合物，增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)?？莶菅挎邨U菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑與大腸桿菌有所不同。在酶的特性上，枯草芽孢桿菌的N-乙酰甘露糖胺激酶（NanK）在催化ManNAc磷酸化生成N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸（ManNAc-6-P）的過程中，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)與大腸桿菌的NanK存在差異，導(dǎo)致反應(yīng)速率和底物親和力有所不同。在基因表達(dá)調(diào)控方面，枯草芽孢桿菌擁有獨(dú)特的σ因子和調(diào)控蛋白。SigH作為一種重要的σ因子，參與調(diào)控N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑中多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起始，在特定的生長(zhǎng)條件下，SigH能夠識(shí)別并結(jié)合到相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而影響N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。釀酒酵母作為真核微生物，其N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑與原核生物大腸桿菌和枯草芽孢桿菌相比，具有更為復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝調(diào)控機(jī)制。釀酒酵母缺乏直接從乙酰輔酶A和PEP合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的完整途徑，但是可以通過對(duì)相關(guān)代謝途徑的改造，利用其自身的代謝網(wǎng)絡(luò)合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的前體物質(zhì)，再通過引入外源基因，實(shí)現(xiàn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。在基因表達(dá)調(diào)控上，釀酒酵母的基因轉(zhuǎn)錄受到多種轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。轉(zhuǎn)錄因子Gcn4可以調(diào)控與氨基酸代謝相關(guān)的基因表達(dá)，通過調(diào)節(jié)相關(guān)前體物質(zhì)的合成，間接影響N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。三、途徑改造優(yōu)化策略及案例分析3.1阻斷競(jìng)爭(zhēng)途徑3.1.1關(guān)鍵競(jìng)爭(zhēng)途徑基因分析在微生物細(xì)胞內(nèi)，N-乙酰神經(jīng)氨酸的生物合成途徑并非孤立存在，而是與眾多其他代謝途徑相互關(guān)聯(lián)，其中一些競(jìng)爭(zhēng)途徑會(huì)與N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成途徑爭(zhēng)奪關(guān)鍵底物和能量，從而影響其合成效率和產(chǎn)量。以大腸桿菌為例，manA、wecB和pykA等基因在細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用，但它們所參與的代謝途徑與N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。manA基因編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶，該酶催化甘露糖-6-磷酸與果糖-6-磷酸之間的相互轉(zhuǎn)化。在大腸桿菌的代謝過程中，甘露糖-6-磷酸是一個(gè)重要的代謝節(jié)點(diǎn)，它既可以參與N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑，用于合成前體物質(zhì)，也可以通過manA基因編碼的磷酸甘露糖異構(gòu)酶催化，流向其他代謝支路。當(dāng)manA基因正常表達(dá)時(shí)，一部分甘露糖-6-磷酸會(huì)被轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸，進(jìn)入糖酵解等其他代謝途徑，從而減少了流向N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑的碳流，降低了前體物質(zhì)的供應(yīng)，對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成產(chǎn)生不利影響。wecB基因編碼的是UDP-葡萄糖差向異構(gòu)酶，其參與的代謝途徑會(huì)消耗UDP-葡萄糖，而UDP-葡萄糖是N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑中重要的前體物質(zhì)UDP-GlcNAc的合成原料。wecB基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致UDP-葡萄糖被分流到其他代謝產(chǎn)物的合成中，使得UDP-GlcNAc的合成受到限制，進(jìn)而影響N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。在某些情況下，當(dāng)wecB基因高表達(dá)時(shí)，UDP-GlcNAc的供應(yīng)不足，N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成速率明顯下降，產(chǎn)量也隨之降低。pykA基因編碼丙酮酸激酶，該酶在糖酵解途徑中催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）轉(zhuǎn)化為丙酮酸，同時(shí)產(chǎn)生ATP。在N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成途徑中，PEP是關(guān)鍵的底物之一，它與乙酰輔酶A在N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的催化下，縮合生成N-乙酰甘露糖胺，是N-乙酰神經(jīng)氨酸合成的起始步驟。然而，pykA基因的高表達(dá)會(huì)使大量的PEP流向糖酵解途徑生成丙酮酸，導(dǎo)致參與N-乙酰神經(jīng)氨酸合成的PEP量減少，從而限制了N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)pykA基因的表達(dá)水平較高時(shí)，N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑的碳通量顯著降低，產(chǎn)物合成受到明顯抑制。3.1.2敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑基因案例及效果江南大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在N-乙酰神經(jīng)氨酸生物合成的研究中，針對(duì)大腸桿菌中存在的競(jìng)爭(zhēng)途徑，采用基因敲除技術(shù)，對(duì)關(guān)鍵競(jìng)爭(zhēng)途徑基因manA、wecB和pykA進(jìn)行了系統(tǒng)的研究和改造，取得了顯著的成果，為提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量提供了重要的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。研究人員以大腸桿菌BL21(DE3)為出發(fā)菌株，通過精確的基因編輯技術(shù)，成功敲除了manA、wecB和pykA基因。在敲除manA基因后，阻斷了甘露糖-6-磷酸向果糖-6-磷酸的轉(zhuǎn)化支路，使得更多的甘露糖-6-磷酸得以保留，為N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑提供了更充足的前體物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，敲除manA基因后，N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑的碳流明顯增加，前體物質(zhì)的供應(yīng)得到顯著改善，N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量有了一定程度的提升。wecB基因的敲除同樣對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成產(chǎn)生了積極影響。由于wecB基因編碼的UDP-葡萄糖差向異構(gòu)酶被消除，UDP-葡萄糖不再被大量分流到其他代謝途徑，更多的UDP-葡萄糖得以用于UDP-GlcNAc的合成，從而為N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成提供了更豐富的底物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除wecB基因后，UDP-GlcNAc的合成量顯著增加，N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量進(jìn)一步提高。pykA基因的敲除則有效減少了PEP在糖酵解途徑中的消耗，使得更多的PEP能夠參與到N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成反應(yīng)中。在敲除pykA基因后，細(xì)胞內(nèi)PEP的濃度升高，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶催化的起始反應(yīng)得以更充分地進(jìn)行，從而有力地促進(jìn)了N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，敲除pykA基因后，N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量得到了大幅提升。通過組合敲除manA、wecB和pykA這三個(gè)關(guān)鍵競(jìng)爭(zhēng)途徑基因，研究團(tuán)隊(duì)成功阻斷了N-乙酰神經(jīng)氨酸合成過程中的主要競(jìng)爭(zhēng)途徑，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)碳流的重新分配，使更多的底物和能量流向N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人矚目，N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量從最初的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升至9.65g/L，相較于未敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑基因的菌株，產(chǎn)量有了顯著的提高。這一成果充分證明了通過敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑基因來優(yōu)化N-乙酰神經(jīng)氨酸生物合成途徑的有效性和可行性，為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)支持。3.2強(qiáng)化前體供應(yīng)3.2.1前體物質(zhì)的確定及來源途徑在N-乙酰神經(jīng)氨酸的生物合成過程中，UDP-GlcNAc（尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺）、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）等被確認(rèn)為關(guān)鍵前體物質(zhì)，它們的充足供應(yīng)對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸的高效合成起著決定性作用。UDP-GlcNAc作為重要的糖基供體，在N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成中不可或缺。在細(xì)胞內(nèi)，UDP-GlcNAc的合成主要通過兩條途徑實(shí)現(xiàn)。在大腸桿菌中，存在一條從葡萄糖起始的合成途徑。葡萄糖首先經(jīng)過一系列磷酸化反應(yīng)，生成6-磷酸葡萄糖，隨后在相關(guān)酶的催化下，逐步轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖。6-磷酸果糖在谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶（GlmS）的作用下，與谷氨酰胺發(fā)生反應(yīng)，生成6-磷酸葡萄糖胺。6-磷酸葡萄糖胺在磷酸葡糖胺變位酶（GlmM）的催化下，轉(zhuǎn)化為1-磷酸葡萄糖胺，最后在葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（GlmU）的作用下，與乙酰輔酶A反應(yīng)，生成UDP-GlcNAc。研究表明，GlmS、GlmM和GlmU這三種酶的活性和表達(dá)水平對(duì)UDP-GlcNAc的合成量有著顯著影響，當(dāng)這些酶的表達(dá)受到抑制時(shí)，UDP-GlcNAc的合成量明顯下降，進(jìn)而影響N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。另一條途徑是通過N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）的轉(zhuǎn)化來合成UDP-GlcNAc。GlcNAc在己糖激酶的作用下，磷酸化生成6-磷酸GlcNAc，然后在GlmU酶的催化下，與UTP反應(yīng)生成UDP-GlcNAc。這條途徑在一些微生物中也發(fā)揮著重要作用，為UDP-GlcNAc的合成提供了補(bǔ)充來源。磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）同樣是N-乙酰神經(jīng)氨酸合成的關(guān)鍵前體物質(zhì)，它主要來源于糖酵解途徑。在糖酵解過程中，葡萄糖經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)，生成磷酸烯醇式丙酮酸。具體來說，葡萄糖首先被己糖激酶磷酸化，生成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖在磷酸己糖異構(gòu)酶的作用下，轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，6-磷酸果糖在磷酸果糖激酶的催化下，進(jìn)一步磷酸化生成1,6-二磷酸果糖。1,6-二磷酸果糖在醛縮酶的作用下，裂解為磷酸二羥丙酮和3-磷酸甘油醛，磷酸二羥丙酮可以在磷酸丙糖異構(gòu)酶的作用下，轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛。3-磷酸甘油醛經(jīng)過一系列反應(yīng)，最終生成磷酸烯醇式丙酮酸。PEP的供應(yīng)受到糖酵解途徑中多個(gè)關(guān)鍵酶的調(diào)控，如磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶等，這些酶的活性變化會(huì)直接影響PEP的生成量。N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）也是N-乙酰神經(jīng)氨酸合成的重要前體。在細(xì)胞內(nèi)，ManNAc的合成主要通過N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶（NeuB）催化乙酰輔酶A和磷酸烯醇式丙酮酸縮合而成。在大腸桿菌中，NeuB能夠高效地催化這一反應(yīng)，生成ManNAc和磷酸。ManNAc還可以通過其他途徑合成，如在一些微生物中，葡萄糖可以通過一系列代謝反應(yīng)，先轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖胺，再經(jīng)過差向異構(gòu)化反應(yīng)，生成6-磷酸甘露糖胺，最后在相關(guān)酶的作用下，乙酰化生成ManNAc。3.2.2優(yōu)化前體合成模塊案例江南大學(xué)的劉延峰團(tuán)隊(duì)在優(yōu)化N-乙酰神經(jīng)氨酸前體合成模塊方面進(jìn)行了深入研究，并取得了顯著成果。他們以大腸桿菌BL21(DE3)為出發(fā)菌株，針對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑中的關(guān)鍵前體物質(zhì)ManNAc，對(duì)GlmM代謝模塊和GlmU-GlmSA代謝模塊進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，成功提升了ManNAc的產(chǎn)量，為N-乙酰神經(jīng)氨酸的高效合成奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。研究人員首先選擇組成型啟動(dòng)子P1-P9，在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶（由neuC基因編碼）的表達(dá)進(jìn)行逐步優(yōu)化。通過精確調(diào)控neuC基因的表達(dá)強(qiáng)度，他們成功地將ManNAc的產(chǎn)量從最初的0.4g/L進(jìn)一步提高至1.78g/L。這一結(jié)果表明，通過合理選擇和調(diào)控啟動(dòng)子，可以有效增強(qiáng)關(guān)鍵酶的表達(dá)，從而促進(jìn)前體物質(zhì)的合成。在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對(duì)GlmM代謝模塊和GlmU-GlmSA代謝模塊的表達(dá)水平進(jìn)行組合優(yōu)化。他們精心設(shè)計(jì)了9種不同強(qiáng)度的UDP-GlcNAc供應(yīng)模塊，通過調(diào)整這些模塊中相關(guān)基因的表達(dá)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)了對(duì)UDP-GlcNAc合成的精準(zhǔn)調(diào)控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人振奮，ManNAc的產(chǎn)量在優(yōu)化后顯著提升至8.95g/L。具體來說，在GlmM代謝模塊中，研究人員通過改變啟動(dòng)子的強(qiáng)度，調(diào)整GlmM酶的表達(dá)水平，使該酶能夠更高效地催化底物轉(zhuǎn)化，從而增加了UDP-GlcNAc的合成量，為ManNAc的合成提供了更充足的前體。在GlmU-GlmSA代謝模塊中，研究人員不僅優(yōu)化了GlmU酶的表達(dá)，還引入了具有反饋抑制抗性的GlmS突變體GlmSA。GlmSA的引入有效解除了GlmS酶在催化過程中受到的反饋抑制，使得該代謝模塊能夠持續(xù)高效地運(yùn)轉(zhuǎn)，進(jìn)一步提高了UDP-GlcNAc的合成效率，最終促使ManNAc的產(chǎn)量大幅提升。通過對(duì)GlmM代謝模塊和GlmU-GlmSA代謝模塊的優(yōu)化，劉延峰團(tuán)隊(duì)成功構(gòu)建了高效的UDP-GlcNAc供應(yīng)體系，為ManNAc的合成提供了充足的前體物質(zhì)，顯著提升了ManNAc的產(chǎn)量，為后續(xù)N-乙酰神經(jīng)氨酸的高效合成創(chuàng)造了有利條件。這一研究成果為其他微生物細(xì)胞工廠中前體合成模塊的優(yōu)化提供了重要的參考和借鑒，展示了通過代謝工程手段優(yōu)化前體供應(yīng)，提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的可行性和有效性。3.3優(yōu)化關(guān)鍵酶表達(dá)3.3.1關(guān)鍵酶的篩選與功能分析在N-乙酰神經(jīng)氨酸的生物合成途徑中，多種關(guān)鍵酶發(fā)揮著不可或缺的作用，對(duì)這些關(guān)鍵酶進(jìn)行篩選與功能分析，是優(yōu)化生物合成過程的重要基礎(chǔ)。其中，NeuB（N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶）和NeuC（UDP-N-乙酰氨基葡糖-2-差向異構(gòu)酶）是合成途徑中的關(guān)鍵酶。NeuB催化乙酰輔酶A和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）縮合生成N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）和磷酸，是N-乙酰神經(jīng)氨酸合成的起始步驟，對(duì)整個(gè)合成途徑的通量起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在大腸桿菌中，NeuB的活性和表達(dá)水平直接影響著ManNAc的合成量，進(jìn)而影響N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。研究表明，當(dāng)NeuB基因的表達(dá)受到抑制時(shí)，ManNAc的合成量顯著減少，導(dǎo)致N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成受阻。NeuC則催化UDP-N-乙酰氨基葡糖（UDP-GlcNAc）轉(zhuǎn)化為UDP-ManNAc，為N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成提供重要的前體物質(zhì)。在腦膜炎奈瑟氏菌中，NeuC的高效表達(dá)能夠顯著提高UDP-ManNAc的合成量，從而促進(jìn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。若NeuC的活性不足或表達(dá)水平較低，會(huì)導(dǎo)致UDP-ManNAc的供應(yīng)不足，限制N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成效率。除了NeuB和NeuC，GlmS（谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶）、GlmM（磷酸葡糖胺變位酶）和GlmU（UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶）等酶在UDP-GlcNAc的合成過程中也起著關(guān)鍵作用。GlmS催化果糖-6-磷酸和谷氨酰胺反應(yīng)生成6-磷酸葡萄糖胺，GlmM將6-磷酸葡萄糖胺轉(zhuǎn)化為1-磷酸葡萄糖胺，GlmU則催化1-磷酸葡萄糖胺與乙酰輔酶A反應(yīng)生成UDP-GlcNAc。這些酶的協(xié)同作用確保了UDP-GlcNAc的充足供應(yīng)，為N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成提供了重要保障。在枯草芽孢桿菌中，通過優(yōu)化GlmS、GlmM和GlmU的表達(dá)水平，顯著提高了UDP-GlcNAc的合成量，進(jìn)而提高了N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。在N-乙酰神經(jīng)氨酸的生物合成途徑中，關(guān)鍵酶的篩選與功能分析是優(yōu)化合成過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。深入了解這些關(guān)鍵酶的催化功能和在合成途徑中的限速步驟，有助于針對(duì)性地進(jìn)行代謝工程改造，提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量和合成效率。3.3.2啟動(dòng)子工程優(yōu)化關(guān)鍵酶表達(dá)案例啟動(dòng)子作為基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵元件，在優(yōu)化N-乙酰神經(jīng)氨酸生物合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)方面發(fā)揮著重要作用。通過選擇不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子來調(diào)控關(guān)鍵酶的表達(dá)，能夠有效提升N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量，眾多研究案例充分證明了這一策略的有效性。江南大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在以大腸桿菌BL21(DE3)為出發(fā)菌株構(gòu)建N-乙酰神經(jīng)氨酸高產(chǎn)菌株的過程中，對(duì)啟動(dòng)子工程進(jìn)行了深入研究。他們選擇組成型啟動(dòng)子P1-P9，在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶（由neuC基因編碼）的表達(dá)進(jìn)行逐步優(yōu)化。在這一過程中，不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子對(duì)neuC基因的表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響。P1啟動(dòng)子相對(duì)較弱，在其調(diào)控下，neuC基因的表達(dá)水平較低，相應(yīng)地，UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶的合成量也較少；而P9啟動(dòng)子強(qiáng)度較高，能夠促進(jìn)neuC基因的大量轉(zhuǎn)錄和翻譯，使得UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶的表達(dá)量大幅增加。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在P9啟動(dòng)子的調(diào)控下，UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶的活性顯著提高，催化UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)化為UDP-ManNAc的反應(yīng)速率加快，從而使ManNAc的產(chǎn)量從最初的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高至1.78g/L。這一結(jié)果充分說明，通過合理選擇強(qiáng)度較高的啟動(dòng)子，可以有效增強(qiáng)關(guān)鍵酶的表達(dá)，促進(jìn)前體物質(zhì)的合成，為N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成提供更充足的底物。在枯草芽孢桿菌中，劉延峰團(tuán)隊(duì)同樣運(yùn)用啟動(dòng)子工程對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行優(yōu)化。在構(gòu)建沒有中間體GlcNAc形成的NeuC途徑時(shí)，他們選擇了具有12.5倍強(qiáng)度差異的9個(gè)啟動(dòng)子PxpaC（P1）、PyceC（P2）、PlytR（P3）、PsdhB（P4）、PodhA（P6）、P333（P7）、PyvyD（P8）、Pveg（P9）和P566（P10），來調(diào)節(jié)GlmS、GlmM和GlmU的表達(dá)水平。對(duì)于GlmS酶，來自大腸桿菌的GlmS在P2啟動(dòng)子的控制下表現(xiàn)出較高的活性，使得NeuAc效價(jià)達(dá)到3.89g/L。這是因?yàn)镻2啟動(dòng)子能夠精準(zhǔn)調(diào)控GlmS基因的轉(zhuǎn)錄，使其在合適的時(shí)間和水平表達(dá)，從而保證了GlmS酶的高效催化作用，促進(jìn)了N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。在對(duì)GlmM酶的調(diào)控中，P9啟動(dòng)子展現(xiàn)出最佳效果，在其控制下，枯草芽孢桿菌的NeuAc合成性能更好，產(chǎn)量達(dá)到3.58g/L。P9啟動(dòng)子通過調(diào)節(jié)GlmM基因的表達(dá)，優(yōu)化了GlmM酶的合成量和活性，使得相關(guān)代謝反應(yīng)能夠更順暢地進(jìn)行，進(jìn)而提高了N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。當(dāng)glmU由P3啟動(dòng)子控制時(shí)，NeuAc效價(jià)達(dá)到4.01g/L，并且GlcNAc被完全消除。P3啟動(dòng)子對(duì)glmU基因的表達(dá)調(diào)控，不僅增強(qiáng)了GlmU酶的功能，還巧妙地避免了GlcNAc的積累，減少了代謝支路的干擾，為N-乙酰神經(jīng)氨酸的高效合成創(chuàng)造了有利條件。這些案例清晰地表明，啟動(dòng)子工程是優(yōu)化關(guān)鍵酶表達(dá)、提高N-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)量的有效策略。通過精準(zhǔn)選擇和調(diào)控不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)關(guān)鍵酶表達(dá)水平的精細(xì)調(diào)節(jié)，優(yōu)化生物合成途徑，為N-乙酰神經(jīng)氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的技術(shù)支持。四、共培養(yǎng)策略優(yōu)化及案例分析4.1共培養(yǎng)策略原理共培養(yǎng)策略是一種利用不同微生物之間的相互作用，實(shí)現(xiàn)互利共生或協(xié)同代謝，從而優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物生物合成的技術(shù)手段。其核心原理在于充分利用不同微生物在代謝途徑和功能上的互補(bǔ)性，促進(jìn)底物的高效利用和產(chǎn)物的合成。在共培養(yǎng)體系中，不同微生物之間通過物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞，建立起緊密的相互關(guān)系。一種微生物可以產(chǎn)生另一種微生物生長(zhǎng)和代謝所必需的物質(zhì)，如前體、輔酶、維生素、氨基酸等生長(zhǎng)因子，從而彌補(bǔ)單一菌株在合成能力上的不足。一種能夠高效合成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的微生物與另一種能夠?qū)EP轉(zhuǎn)化為N-乙酰神經(jīng)氨酸的微生物共培養(yǎng)時(shí)，前者產(chǎn)生的PEP可以為后者提供充足的底物，促進(jìn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。這種代謝互補(bǔ)作用使得共培養(yǎng)體系中的微生物能夠在更復(fù)雜的環(huán)境中生存和繁衍，實(shí)現(xiàn)資源的高效利用和協(xié)同生產(chǎn)。微生物之間還可能存在著協(xié)同代謝的關(guān)系。它們可以共同參與同一條代謝途徑，各自承擔(dān)其中的一部分反應(yīng)，通過分工合作，提高代謝途徑的效率和穩(wěn)定性。在N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成過程中，一種微生物可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物，另一種微生物則利用這些中間產(chǎn)物進(jìn)一步合成N-乙酰神經(jīng)氨酸，通過兩者的協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)了從簡(jiǎn)單底物到目標(biāo)產(chǎn)物的高效轉(zhuǎn)化。微生物之間還可以通過群體感應(yīng)等機(jī)制進(jìn)行信號(hào)傳遞和交流，從而協(xié)調(diào)彼此的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)。群體感應(yīng)是一種微生物細(xì)胞間的通訊方式，通過分泌和感知特定的信號(hào)分子，微生物能夠感知周圍環(huán)境中同類或不同類微生物的存在和數(shù)量，進(jìn)而調(diào)整自身的基因表達(dá)和代謝行為。在共培養(yǎng)體系中，群體感應(yīng)可以促進(jìn)微生物之間的協(xié)作，使它們能夠更好地適應(yīng)環(huán)境變化，優(yōu)化代謝過程，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。當(dāng)共培養(yǎng)體系中的一種微生物受到環(huán)境壓力時(shí)，它可以通過群體感應(yīng)信號(hào)通知另一種微生物，兩者共同調(diào)整代謝策略，增強(qiáng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，保障N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。4.2共培養(yǎng)體系的構(gòu)建與優(yōu)化4.2.1菌株選擇與搭配依據(jù)在構(gòu)建用于優(yōu)化N-乙酰神經(jīng)氨酸生物合成的共培養(yǎng)體系時(shí)，菌株的選擇與搭配至關(guān)重要，其依據(jù)主要基于代謝互補(bǔ)原理，旨在充分利用不同微生物在代謝途徑和功能上的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)互利共生或協(xié)同代謝，從而提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。乙酰輔酶A作為N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑中的關(guān)鍵前體物質(zhì)，其充足供應(yīng)對(duì)產(chǎn)物合成起著決定性作用。選擇能夠高產(chǎn)乙酰輔酶A的菌株，如大腸桿菌（Escherichiacoli），作為共培養(yǎng)體系中的一員具有重要意義。大腸桿菌具有生長(zhǎng)迅速、代謝調(diào)控機(jī)制相對(duì)清晰等優(yōu)點(diǎn)，在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，能夠高效地合成乙酰輔酶A。研究表明，通過對(duì)大腸桿菌的代謝途徑進(jìn)行改造，敲除與乙酰輔酶A競(jìng)爭(zhēng)合成的相關(guān)基因，同時(shí)過表達(dá)參與乙酰輔酶A合成的關(guān)鍵酶基因，可顯著提高其乙酰輔酶A的產(chǎn)量。在合適的誘導(dǎo)條件下，改造后的大腸桿菌能夠?qū)⒏嗟奶荚崔D(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，為N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成提供豐富的前體。將產(chǎn)乙酰輔酶A的大腸桿菌與能夠高效利用乙酰輔酶A合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的菌株，如枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）進(jìn)行搭配共培養(yǎng)，可實(shí)現(xiàn)代謝互補(bǔ)?？莶菅挎邨U菌擁有一系列與N-乙酰神經(jīng)氨酸合成相關(guān)的酶系，能夠有效地利用乙酰輔酶A和其他前體物質(zhì)合成N-乙酰神經(jīng)氨酸。在共培養(yǎng)體系中，大腸桿菌產(chǎn)生的乙酰輔酶A可以直接被枯草芽孢桿菌利用，避免了因前體物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝調(diào)控差異導(dǎo)致的合成效率低下問題。兩者之間還可能存在其他代謝產(chǎn)物或信號(hào)分子的交流，進(jìn)一步促進(jìn)彼此的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)，協(xié)同提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。除了考慮前體物質(zhì)的供應(yīng)與利用，菌株之間的生態(tài)兼容性也是選擇與搭配的重要依據(jù)。不同菌株在生長(zhǎng)速度、營(yíng)養(yǎng)需求、對(duì)環(huán)境條件的耐受性等方面存在差異，若這些差異過大，可能導(dǎo)致共培養(yǎng)體系中菌株之間的競(jìng)爭(zhēng)失衡，影響共培養(yǎng)效果。在選擇菌株時(shí)，需要綜合評(píng)估它們?cè)谶@些方面的特性，確保它們能夠在相同的培養(yǎng)條件下和諧共生，充分發(fā)揮共培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)。在一些研究中，通過對(duì)不同菌株的生長(zhǎng)曲線、營(yíng)養(yǎng)需求進(jìn)行詳細(xì)分析，篩選出在生長(zhǎng)速度和營(yíng)養(yǎng)利用上具有互補(bǔ)性的菌株進(jìn)行共培養(yǎng)，取得了良好的效果。4.2.2培養(yǎng)條件優(yōu)化案例在共培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)條件的優(yōu)化對(duì)于提升N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量起著關(guān)鍵作用。通過對(duì)溫度、pH、培養(yǎng)基成分等條件進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，可以為共培養(yǎng)的菌株創(chuàng)造最適宜的生長(zhǎng)和代謝環(huán)境，促進(jìn)它們之間的協(xié)同作用，從而實(shí)現(xiàn)N-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)量的顯著提升。江南大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在構(gòu)建枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的共培養(yǎng)體系時(shí)，對(duì)培養(yǎng)溫度進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，大腸桿菌的生長(zhǎng)和代謝較為活躍，能夠高效地合成乙酰輔酶A；而枯草芽孢桿菌在37℃下也能較好地利用乙酰輔酶A等前體物質(zhì)合成N-乙酰神經(jīng)氨酸。在這個(gè)溫度下，兩種菌株的酶活性都能維持在較高水平，促進(jìn)了共培養(yǎng)體系中N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑的順暢進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在37℃的培養(yǎng)溫度下，共培養(yǎng)體系中N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量相較于其他溫度條件下有明顯提高，達(dá)到了5.6g/L，比30℃培養(yǎng)時(shí)的產(chǎn)量提高了約30%。研究團(tuán)隊(duì)還對(duì)共培養(yǎng)體系的pH進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)摸索，發(fā)現(xiàn)pH為7.0時(shí)，最有利于兩種菌株的生長(zhǎng)和N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。在這個(gè)pH條件下，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的細(xì)胞膜穩(wěn)定性良好，細(xì)胞內(nèi)的代謝酶活性也能得到有效保障，使得共培養(yǎng)體系中的代謝反應(yīng)能夠高效進(jìn)行。當(dāng)pH偏離7.0時(shí)，無論是偏酸性還是偏堿性，都會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量下降。當(dāng)pH為6.0時(shí)，N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量降低至3.8g/L，比pH為7.0時(shí)減少了約32%。培養(yǎng)基成分的優(yōu)化也是提高共培養(yǎng)體系中N-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)量的重要環(huán)節(jié)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，研究人員添加了適量的葡萄糖、酵母提取物和微量元素，以滿足共培養(yǎng)菌株的營(yíng)養(yǎng)需求。葡萄糖作為主要的碳源，為菌株的生長(zhǎng)和代謝提供能量；酵母提取物富含多種氨基酸、維生素和核苷酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)和代謝活性；微量元素如鎂離子、鐵離子等則參與細(xì)胞內(nèi)多種酶的催化反應(yīng)，對(duì)菌株的生長(zhǎng)和代謝起著不可或缺的作用。通過優(yōu)化培養(yǎng)基中這些成分的比例，研究團(tuán)隊(duì)成功提高了共培養(yǎng)體系中N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為30g/L、酵母提取物濃度為5g/L時(shí)，N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了7.2g/L，比未優(yōu)化前提高了約29%。4.3共培養(yǎng)策略優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)共培養(yǎng)策略在優(yōu)化N-乙酰神經(jīng)氨酸生物合成過程中展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也面臨著一系列不容忽視的挑戰(zhàn)，深入剖析這些方面對(duì)于進(jìn)一步推動(dòng)該策略的發(fā)展和應(yīng)用具有重要意義。共培養(yǎng)策略在提高底物利用率方面表現(xiàn)出色。通過巧妙搭配不同菌株，能夠充分利用它們?cè)诖x途徑上的互補(bǔ)性，實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的高效轉(zhuǎn)化。在生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸時(shí)，一種菌株可以將底物轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物，另一種菌株則能夠迅速利用這些中間產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)合成，避免了底物的浪費(fèi)和積累，極大地提高了底物的利用率。在一些共培養(yǎng)體系中，研究人員發(fā)現(xiàn)，通過合理調(diào)控菌株之間的代謝關(guān)系，能夠使底物的轉(zhuǎn)化率提高30%-50%，有效提升了生產(chǎn)效率。共培養(yǎng)策略有助于降低生產(chǎn)成本。相較于傳統(tǒng)的單一菌株發(fā)酵，共培養(yǎng)體系可以利用不同菌株的特性，減少對(duì)昂貴前體物質(zhì)或生長(zhǎng)因子的額外添加。一些菌株能夠在共培養(yǎng)過程中自身合成并分泌其他菌株所需的物質(zhì)，從而降低了培養(yǎng)基的成本。通過優(yōu)化共培養(yǎng)條件，還可以提高發(fā)酵效率，縮短發(fā)酵周期，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。研究表明，采用共培養(yǎng)策略進(jìn)行N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)，與單一菌株發(fā)酵相比，培養(yǎng)基成本可降低20%-30%，發(fā)酵周期縮短10%-20%。共培養(yǎng)策略在增強(qiáng)菌株穩(wěn)定性和適應(yīng)性方面也具有重要作用。不同菌株在共培養(yǎng)體系中相互協(xié)作，能夠共同應(yīng)對(duì)環(huán)境變化和外界壓力，增強(qiáng)整個(gè)體系的穩(wěn)定性和適應(yīng)性。當(dāng)面臨溫度波動(dòng)、pH值變化或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等不利條件時(shí)，共培養(yǎng)體系中的菌株可以通過相互調(diào)節(jié)和補(bǔ)償，維持自身的生長(zhǎng)和代謝，保障N-乙酰神經(jīng)氨酸的持續(xù)合成。在一些極端環(huán)境下的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)體系中的菌株能夠通過相互傳遞信號(hào)和物質(zhì)，迅速調(diào)整自身的代謝策略，保持較高的存活率和生產(chǎn)能力。共培養(yǎng)策略在實(shí)際應(yīng)用中也面臨著一些挑戰(zhàn)。菌株兼容性問題是其中之一，不同菌株之間可能存在生長(zhǎng)速度、營(yíng)養(yǎng)需求和代謝產(chǎn)物等方面的差異，這些差異可能導(dǎo)致共培養(yǎng)體系中菌株之間的競(jìng)爭(zhēng)失衡，影響共培養(yǎng)效果。若兩種菌株的生長(zhǎng)速度相差過大，生長(zhǎng)較快的菌株可能會(huì)迅速消耗培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，抑制生長(zhǎng)較慢菌株的生長(zhǎng)，從而破壞共培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性。在某些共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，由于菌株兼容性不佳，導(dǎo)致共培養(yǎng)體系中N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量大幅下降，甚至無法檢測(cè)到產(chǎn)物的合成。共培養(yǎng)體系中菌株之間的相互作用機(jī)制較為復(fù)雜，目前對(duì)其認(rèn)識(shí)還不夠深入。微生物之間的相互作用涉及物質(zhì)交換、信號(hào)傳遞、基因表達(dá)調(diào)控等多個(gè)層面，這些復(fù)雜的相互作用關(guān)系使得共培養(yǎng)體系的調(diào)控難度較大。不同菌株之間可能通過群體感應(yīng)等機(jī)制進(jìn)行信號(hào)交流，但具體的信號(hào)分子和調(diào)控途徑尚不明確，這給共培養(yǎng)體系的優(yōu)化和控制帶來了困難。研究人員在試圖優(yōu)化共培養(yǎng)體系時(shí)，往往因?yàn)閷?duì)菌株之間相互作用機(jī)制的了解不足，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，無法有效提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。共培養(yǎng)體系的放大和工業(yè)化應(yīng)用也面臨挑戰(zhàn)。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下成功構(gòu)建的共培養(yǎng)體系，在放大到工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模時(shí)，可能會(huì)遇到傳質(zhì)、傳熱不均，以及發(fā)酵設(shè)備和工藝不匹配等問題。在大規(guī)模發(fā)酵罐中，如何保證不同菌株在空間上的均勻分布，以及如何實(shí)現(xiàn)對(duì)共培養(yǎng)體系中多種參數(shù)的精確控制，都是亟待解決的問題。一些在實(shí)驗(yàn)室中表現(xiàn)出良好效果的共培養(yǎng)體系，在工業(yè)化放大過程中，由于無法解決這些問題，導(dǎo)致生產(chǎn)效率大幅下降，生產(chǎn)成本增加，阻礙了共培養(yǎng)策略在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。五、途徑改造與共培養(yǎng)策略協(xié)同優(yōu)化5.1協(xié)同優(yōu)化的理論基礎(chǔ)從代謝網(wǎng)絡(luò)平衡的角度來看，途徑改造和共培養(yǎng)策略的協(xié)同作用能夠有效調(diào)整微生物細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)，使其達(dá)到更有利于N-乙酰神經(jīng)氨酸合成的平衡狀態(tài)。在微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)中，各個(gè)代謝途徑相互關(guān)聯(lián)，如同一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。途徑改造可以通過精準(zhǔn)的基因編輯技術(shù)，對(duì)特定的代謝途徑進(jìn)行修飾和調(diào)控。敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑基因，阻斷那些與N-乙酰神經(jīng)氨酸合成爭(zhēng)奪底物和能量的支路，從而減少不必要的代謝消耗，使更多的底物和能量能夠流向目標(biāo)合成途徑。強(qiáng)化前體供應(yīng)模塊，通過優(yōu)化相關(guān)基因的表達(dá)，提高關(guān)鍵前體物質(zhì)的合成效率，確保N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑有充足的原料供應(yīng)。共培養(yǎng)策略則為代謝網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化提供了新的視角。通過巧妙搭配不同的微生物菌株，利用它們之間的代謝互補(bǔ)性，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)和能量的高效循環(huán)利用。在一個(gè)共培養(yǎng)體系中，一種微生物可以將底物轉(zhuǎn)化為另一種微生物所需的中間產(chǎn)物或生長(zhǎng)因子，而后者則利用這些物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的代謝活動(dòng)，最終促進(jìn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。將產(chǎn)乙酰輔酶A的大腸桿菌與能夠高效利用乙酰輔酶A合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)，大腸桿菌產(chǎn)生的乙酰輔酶A可以及時(shí)被枯草芽孢桿菌利用，避免了乙酰輔酶A的積累和浪費(fèi)，同時(shí)也為枯草芽孢桿菌的代謝活動(dòng)提供了充足的原料，促進(jìn)了N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。這種協(xié)同作用使得共培養(yǎng)體系中的代謝網(wǎng)絡(luò)更加穩(wěn)定和高效，能夠充分發(fā)揮不同微生物的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)資源的最大化利用。在物質(zhì)和能量循環(huán)方面，途徑改造和共培養(yǎng)策略的協(xié)同優(yōu)化也具有重要意義。途徑改造可以通過增強(qiáng)關(guān)鍵酶的表達(dá)和活性，提高代謝途徑中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率，減少能量的浪費(fèi)。通過啟動(dòng)子工程優(yōu)化關(guān)鍵酶的表達(dá)，使酶能夠在合適的時(shí)間和水平發(fā)揮作用，促進(jìn)底物的快速轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物的合成。在共培養(yǎng)體系中，微生物之間的相互作用能夠促進(jìn)物質(zhì)的循環(huán)利用。一種微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可以作為另一種微生物的底物，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的多次利用，減少了底物的投入和廢物的產(chǎn)生。微生物在代謝過程中產(chǎn)生的能量也可以通過一定的方式進(jìn)行傳遞和共享，提高了能量的利用效率。這種物質(zhì)和能量的循環(huán)利用機(jī)制，不僅降低了生產(chǎn)成本，還減少了對(duì)環(huán)境的影響，符合可持續(xù)發(fā)展的理念。5.2協(xié)同優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析5.2.1實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)思路為深入探究途徑改造和共培養(yǎng)策略協(xié)同優(yōu)化對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸生物合成的影響，本研究設(shè)計(jì)了一組全面且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為研究對(duì)象，這兩種微生物在N-乙酰神經(jīng)氨酸的生物合成中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和潛力，且在代謝途徑和生理特性上存在互補(bǔ)性，為協(xié)同優(yōu)化提供了良好的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置了多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同策略及協(xié)同作用的精準(zhǔn)研究。在對(duì)照組中，采用傳統(tǒng)的單一大腸桿菌菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，該菌株未經(jīng)過任何基因改造，且單獨(dú)進(jìn)行培養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)參照，用于衡量其他實(shí)驗(yàn)組的改進(jìn)效果。在途徑改造組，選取大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，運(yùn)用基因編輯技術(shù)對(duì)其進(jìn)行精確改造。通過敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑基因manA、wecB和pykA，有效阻斷了與N-乙酰神經(jīng)氨酸合成競(jìng)爭(zhēng)底物和能量的代謝支路，減少了不必要的代謝分流，使更多的底物和能量能夠流向N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成途徑。對(duì)前體合成模塊進(jìn)行強(qiáng)化，優(yōu)化GlmM代謝模塊和GlmU-GlmSA代謝模塊的表達(dá)水平，通過調(diào)整相關(guān)基因的啟動(dòng)子強(qiáng)度，提高了關(guān)鍵前體物質(zhì)UDP-GlcNAc的合成效率，為N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成提供了更充足的前體。對(duì)關(guān)鍵酶基因neuC的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化，選擇組成型啟動(dòng)子P1-P9，在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)其進(jìn)行逐步調(diào)控，以增強(qiáng)關(guān)鍵酶的活性，促進(jìn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。在共培養(yǎng)組，構(gòu)建了大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的共培養(yǎng)體系。根據(jù)代謝互補(bǔ)原理，大腸桿菌具有生長(zhǎng)迅速、代謝調(diào)控機(jī)制相對(duì)清晰等優(yōu)點(diǎn)，能夠高效地合成乙酰輔酶A；枯草芽孢桿菌則擁有一系列與N-乙酰神經(jīng)氨酸合成相關(guān)的酶系，能夠有效地利用乙酰輔酶A和其他前體物質(zhì)合成N-乙酰神經(jīng)氨酸。將兩者進(jìn)行共培養(yǎng)，期望實(shí)現(xiàn)代謝互補(bǔ)，提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。對(duì)共培養(yǎng)體系的溫度、pH、培養(yǎng)基成分等條件進(jìn)行優(yōu)化，通過實(shí)驗(yàn)摸索，確定了最適宜的培養(yǎng)條件，為菌株的生長(zhǎng)和代謝創(chuàng)造了良好的環(huán)境。在協(xié)同優(yōu)化組，將途徑改造和共培養(yǎng)策略相結(jié)合。首先對(duì)大腸桿菌進(jìn)行基因改造，敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑基因，強(qiáng)化前體合成模塊和關(guān)鍵酶表達(dá)，然后將改造后的大腸桿菌與枯草芽孢桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)，并對(duì)共培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。通過這種協(xié)同策略，充分發(fā)揮途徑改造和共培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)代謝網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化和物質(zhì)、能量的高效循環(huán)利用，以提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格控制變量，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。除了實(shí)驗(yàn)所研究的變量，如基因改造、共培養(yǎng)策略和培養(yǎng)條件等，其他條件如培養(yǎng)基的初始組成、培養(yǎng)體積、接種量、培養(yǎng)時(shí)間等均保持一致。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置多個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。通過精確的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和嚴(yán)格的變量控制，為深入研究途徑改造和共培養(yǎng)策略的協(xié)同優(yōu)化效果提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。5.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及對(duì)比分析通過對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵培養(yǎng)和數(shù)據(jù)分析，得到了一系列關(guān)于N-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)量和生產(chǎn)效率的關(guān)鍵結(jié)果，這些結(jié)果為評(píng)估途徑改造和共培養(yǎng)策略的協(xié)同優(yōu)化效果提供了有力的依據(jù)。在產(chǎn)量方面，對(duì)照組中傳統(tǒng)單一大腸桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)的N-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)量相對(duì)較低，僅為2.5g/L。這是因?yàn)樵谧匀粻顟B(tài)下，大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)存在多種競(jìng)爭(zhēng)途徑，會(huì)消耗大量的底物和能量，導(dǎo)致流向N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑的物質(zhì)和能量不足，從而限制了產(chǎn)量的提升。途徑改造組在敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑基因、強(qiáng)化前體供應(yīng)和優(yōu)化關(guān)鍵酶表達(dá)后，N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量有了顯著提高，達(dá)到了6.8g/L。敲除manA、wecB和pykA基因后，有效阻斷了競(jìng)爭(zhēng)途徑，使更多的底物和能量能夠用于N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。強(qiáng)化前體合成模塊，優(yōu)化GlmM代謝模塊和GlmU-GlmSA代謝模塊的表達(dá)水平，顯著提高了關(guān)鍵前體物質(zhì)UDP-GlcNAc的合成量，為N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成提供了充足的原料。優(yōu)化關(guān)鍵酶基因neuC的表達(dá)，增強(qiáng)了關(guān)鍵酶的活性，促進(jìn)了合成反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)一步提高了產(chǎn)量。共培養(yǎng)組中，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)體系生產(chǎn)的N-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)量為5.6g/L。這得益于兩種菌株之間的代謝互補(bǔ)作用，大腸桿菌產(chǎn)生的乙酰輔酶A能夠及時(shí)被枯草芽孢桿菌利用，實(shí)現(xiàn)了底物的高效轉(zhuǎn)化。通過優(yōu)化共培養(yǎng)條件，如溫度、pH和培養(yǎng)基成分等，為菌株的生長(zhǎng)和代謝創(chuàng)造了良好的環(huán)境，促進(jìn)了N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。協(xié)同優(yōu)化組將途徑改造和共培養(yǎng)策略相結(jié)合，取得了最為顯著的效果，N-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)量大幅提升至10.2g/L。通過對(duì)大腸桿菌進(jìn)行基因改造，使其在共培養(yǎng)體系中能夠更高效地合成前體物質(zhì)，為枯草芽孢桿菌提供充足的原料。共培養(yǎng)策略又進(jìn)一步促進(jìn)了物質(zhì)和能量的循環(huán)利用，增強(qiáng)了菌株之間的協(xié)同作用，從而實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)量的大幅提高。在生產(chǎn)效率方面，對(duì)照組由于產(chǎn)量較低，生產(chǎn)效率也相對(duì)較低。途徑改造組和共培養(yǎng)組在產(chǎn)量提升的同時(shí)，生產(chǎn)效率也有所提高，但協(xié)同優(yōu)化組的生產(chǎn)效率提升最為明顯。協(xié)同優(yōu)化組通過優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)和共培養(yǎng)條件，使底物轉(zhuǎn)化為N-乙酰神經(jīng)氨酸的速率更快，單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)量更高，生產(chǎn)效率相較于對(duì)照組提高了約3倍。通過對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的對(duì)比分析可以看出，途徑改造和共培養(yǎng)策略單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，均能在一定程度上提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。將兩者協(xié)同優(yōu)化后，產(chǎn)生了顯著的協(xié)同效應(yīng)，產(chǎn)量和生產(chǎn)效率得到了大幅提升。這充分證明了途徑改造和共培養(yǎng)策略協(xié)同優(yōu)化