免疫學(xué)抗體檢測(cè)操作規(guī)程一、概述

免疫學(xué)抗體檢測(cè)是利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，通過檢測(cè)樣本中目標(biāo)抗體的存在或含量，進(jìn)行疾病診斷、健康評(píng)估或研究分析的重要技術(shù)。本規(guī)程旨在規(guī)范免疫學(xué)抗體檢測(cè)的操作流程，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。操作人員需嚴(yán)格按照規(guī)程執(zhí)行，熟悉相關(guān)儀器設(shè)備、試劑原理及安全注意事項(xiàng)。

二、儀器與試劑準(zhǔn)備

（一）儀器設(shè)備

1.酶標(biāo)儀

2.微量移液器（不同量程）

3.水浴鍋

4.電動(dòng)混勻器

5.冰箱（2-8℃）

6.超凈工作臺(tái)

（二）試劑與耗材

1.標(biāo)準(zhǔn)品/質(zhì)控品

2.樣本稀釋液（pH7.4PBS緩沖液）

3.酶標(biāo)抗體（辣根過氧化物酶標(biāo)記）

4.底物溶液（TMB顯色液）

5.終止液（2MH?SO?）

6.96孔酶標(biāo)板

7.無菌吸頭

三、操作步驟

（一）樣本處理

1.樣本采集：采集靜脈血或組織樣本，避免溶血。

2.處理方法：

(1)血清樣本：室溫靜置30分鐘，3000rpm離心10分鐘，取上清。

(2)組織樣本：勻漿后加入蛋白酶K消化，提取總蛋白。

（二）加樣步驟

1.配制樣本：將樣本用稀釋液按1:5稀釋，混勻。

2.加樣操作：

(1)設(shè)定復(fù)孔，每孔加入100μL樣本或標(biāo)準(zhǔn)品。

(2)設(shè)陰性對(duì)照（空白稀釋液）、陽性對(duì)照（已知抗體標(biāo)準(zhǔn)）。

（三）孵育與反應(yīng)

1.抗體孵育：

(1)加入50μL酶標(biāo)抗體，37℃孵育60分鐘。

(2)用稀釋液洗滌3次，每次300μL，吸干。

2.顯色反應(yīng)：

(1)加入100μL底物溶液，避光孵育30分鐘。

(2)加入50μL終止液，終止反應(yīng)。

（四）結(jié)果檢測(cè)

1.酶標(biāo)儀檢測(cè)：450nm波長(zhǎng)讀板，記錄OD值。

2.數(shù)據(jù)分析：計(jì)算樣本濃度，對(duì)比陽性對(duì)照確定結(jié)果。

四、質(zhì)量控制

（一）質(zhì)控要求

1.每批次檢測(cè)必須包含陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值應(yīng)≥0.98。

（二）常見問題排查

1.結(jié)果偏高：檢查樣本是否存在干擾物（如高甘油三酯）。

2.結(jié)果偏低：確認(rèn)抗體濃度及孵育時(shí)間是否準(zhǔn)確。

五、安全注意事項(xiàng)

（一）個(gè)人防護(hù)

1.佩戴手套、護(hù)目鏡，實(shí)驗(yàn)服覆蓋皮膚。

2.操作后用75%酒精消毒臺(tái)面。

（二）廢棄物處理

1.化學(xué)廢棄物按實(shí)驗(yàn)室規(guī)定分類處理。

2.廢棄吸頭和酶標(biāo)板統(tǒng)一收集。

六、記錄與保存

（一）記錄要求

1.記錄樣本編號(hào)、檢測(cè)日期、操作人。

2.保存原始數(shù)據(jù)及結(jié)果分析報(bào)告。

（二）試劑保存

1.酶標(biāo)抗體及底物需避光保存于2-8℃。

2.使用后未開封試劑可冷藏保存1個(gè)月。

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**一、概述**

免疫學(xué)抗體檢測(cè)是利用抗原抗體之間高度特異性的結(jié)合反應(yīng)，通過體外實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)生物樣本（如血清、血漿、組織液等）中特定抗體的存在、濃度或活性。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷（如傳染病篩查、自身免疫性疾病檢測(cè)）、生物研究（如藥物研發(fā)、疫苗效果評(píng)估）、食品安全（如過敏原檢測(cè)）等領(lǐng)域?？贵w檢測(cè)方法多樣，常見的包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）、膠體金免疫層析法（試紙條）等。本規(guī)程以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）為例，詳細(xì)闡述抗體檢測(cè)的操作流程。本規(guī)程旨在為實(shí)驗(yàn)室操作人員提供標(biāo)準(zhǔn)化的操作指導(dǎo)，確保檢測(cè)過程的規(guī)范性和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性，減少操作誤差和潛在風(fēng)險(xiǎn)。

**二、儀器與試劑準(zhǔn)備**

（一）儀器設(shè)備

1.酶標(biāo)儀：具備450nm濾光片，推薦使用雙波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（如450/600nm）以提高精度，需定期校準(zhǔn)。配備可移動(dòng)的吸液針頭，確保讀數(shù)一致。

2.微量移液器：配置不同量程（如1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL），需經(jīng)過校準(zhǔn)，并使用對(duì)應(yīng)規(guī)格的無菌吸頭。操作人員應(yīng)熟悉其使用方法，特別是預(yù)吸、吹打、觸壁等關(guān)鍵步驟。

3.水浴鍋：溫度范圍可調(diào)（建議0-60℃），具有溫度均勻性監(jiān)測(cè)功能，配備智能控溫系統(tǒng)。

4.電動(dòng)混勻器/渦旋混合器：用于混勻樣本、試劑和洗滌液，確保充分均勻。渦旋混合器適用于小體積快速混勻，需注意避免過度渦旋導(dǎo)致氣泡或樣品變性。

5.冰箱：用于保存低溫要求試劑（2-8℃）和樣本，確保溫度穩(wěn)定。

6.超凈工作臺(tái)/生物安全柜：提供無菌操作環(huán)境，防止樣品污染。使用前需進(jìn)行空間滅菌（如紫外燈照射30分鐘，或使用循環(huán)風(fēng)殺菌模式），并檢查風(fēng)速和過濾器狀態(tài)。

7.電子天平：用于精確稱量試劑（如洗滌液、稀釋液），精度至少為±0.1mg。

8.移液槍架：便于規(guī)范操作和存放移液器。

9.實(shí)驗(yàn)臺(tái)：建議使用耐腐蝕、易清潔的材料。

（二）試劑與耗材

1.樣本稀釋液：通常為磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4±0.1），需新鮮配制或使用商業(yè)試劑盒提供的即用型稀釋液。使用前需確認(rèn)無沉淀或污染。

2.酶標(biāo)抗體（檢測(cè)抗體）：即用于捕獲樣本中目標(biāo)抗原或直接與樣本中目標(biāo)抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體。需檢查試劑說明書，了解其工作濃度、儲(chǔ)存條件（通常為2-8℃或-20℃）和有效期。使用前需在室溫或37℃水浴中適當(dāng)復(fù)溫（根據(jù)說明書要求，通常15-30分鐘），并充分混勻。

3.標(biāo)準(zhǔn)品/質(zhì)控品：標(biāo)準(zhǔn)品用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，質(zhì)控品用于監(jiān)控批間和批內(nèi)變異。標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)具有已知濃度且在有效期內(nèi)的證書。質(zhì)控品應(yīng)覆蓋臨床診斷或研究的相關(guān)范圍。需按說明書要求稀釋或直接使用。

4.抗原包被液：用于包被固相載體的溶液，通常是含0.05%Tween-20的PBS或包被緩沖液（根據(jù)抗體性質(zhì)選擇）。需新鮮配制或按說明書使用。

5.底物溶液（TMB顯色液）：辣根過氧化物酶（HRP）的顯色劑，通常是含有TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）和H?O?的溶液。需新鮮配制或使用試劑盒配套試劑，避免光照。顯色液對(duì)光敏感，配制和儲(chǔ)存需避光。

6.終止液：用于終止酶促反應(yīng)，通常是2MH?SO?或濃鹽酸。需現(xiàn)配現(xiàn)用，具有強(qiáng)酸性，操作時(shí)需小心。

7.96孔酶標(biāo)板：聚苯乙烯材質(zhì)，需具有低吸附性，建議使用預(yù)包被板或經(jīng)處理（如用包被液封閉）的板。使用前檢查板孔是否清潔、透明，無破損。

8.無菌吸頭：根據(jù)不同加樣體積選擇合適規(guī)格（如200μL、100μL、50μL、10μL等），需保證無菌，建議使用一次性無菌吸頭。

9.封閉液（可選）：如脫脂奶粉、BSA（牛血清白蛋白）溶液，用于阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景干擾。通常為含0.05%Tween-20的PBS或封閉緩沖液。

10.洗滌液：通常為含0.05%Tween-20的PBS或洗滌緩沖液。需使用純化水配制，確保無離子污染物。使用前需混勻。

**三、操作步驟**

（一）樣本處理與準(zhǔn)備

1.樣本接收與標(biāo)識(shí)：接收樣本時(shí)核對(duì)樣本標(biāo)簽信息與委托單是否一致，記錄樣本編號(hào)、接收時(shí)間。確保樣本量充足（至少滿足檢測(cè)所需體積及浪費(fèi)）。對(duì)樣本進(jìn)行清晰標(biāo)識(shí)，防止混淆。

2.樣本儲(chǔ)存：未檢測(cè)樣本根據(jù)要求儲(chǔ)存于2-8℃或-20℃冰箱，避免反復(fù)凍融。需記錄凍融次數(shù)。

3.樣本處理：

(1)血清/血漿樣本：室溫靜置30分鐘～1小時(shí)，使標(biāo)本充分凝血（對(duì)于血漿樣本）。3000rpm離心10分鐘，小心吸取上清，避免吸到管底沉淀或組織碎屑。若樣本為高脂血癥，可能需進(jìn)行脂血清除或稀釋處理。

(2)組織樣本：新鮮組織或凍存組織塊用無菌生理鹽水沖洗。根據(jù)組織類型選擇合適的勻漿方法（如組織搗碎器、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)），勻漿時(shí)可加入蛋白酶K（根據(jù)說明書濃度）進(jìn)行組織蛋白消化。10000rpm離心20分鐘，取上清液。必要時(shí)可通過透析或超濾去除大分子物質(zhì)或蛋白酶。

(3)其他樣本（如尿液、腦脊液等）：按相應(yīng)樣本類型說明書處理，必要時(shí)進(jìn)行離心或過濾。

4.樣本稀釋：根據(jù)試劑盒說明書要求，用樣本稀釋液將樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋。例如，若要求樣本稀釋50倍，則取100μL樣本加入含有400μL稀釋液的離心管中，充分混勻?；靹蚩捎脺u旋混合器快速混勻或顛倒混勻10次以上。稀釋后的樣本需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)，避免長(zhǎng)時(shí)間放置導(dǎo)致抗體活性變化。

（二）ELISA板準(zhǔn)備與包被（以雙抗體夾心法為例）

1.試劑平衡：所有試劑（稀釋液、包被液、抗體、酶標(biāo)抗體、洗滌液、底物液、終止液）在使用前均需在室溫或37℃水浴中平衡15-30分鐘，使其溫度與反應(yīng)體系一致，減少因溫差帶來的誤差。

2.包被板處理：

(1)取出酶標(biāo)板，檢查板孔是否有破損或污漬。如有問題，應(yīng)更換新板。

(2)用移液器吸取適量包被液（含抗原），加入每個(gè)孔中，每孔約100-200μL。注意加樣速度均勻，避免產(chǎn)生氣泡。

(3)將酶標(biāo)板置于濕盒（底部墊有濕潤(rùn)紗布或保鮮膜）中，封口膜封好，放入37℃水浴箱或恒溫箱孵育1-4小時(shí)（具體時(shí)間根據(jù)說明書和抗原穩(wěn)定性確定）。孵育過程中保持濕度，防止板底液體蒸發(fā)。

3.洗滌：孵育結(jié)束后，小心吸棄板內(nèi)液體（可傾斜板子，用吸水紙吸去邊緣液體，但不要吸干孔內(nèi)液體）。用洗板機(jī)或手工洗滌：

(1)向每個(gè)孔加入洗滌液（含0.05%Tween-20的PBS）約250μL，浸泡1-2分鐘。

(2)彈出或吸棄洗滌液。重復(fù)此洗滌步驟5次。

(3)洗滌后，可在酶標(biāo)儀上用空白孔調(diào)零（調(diào)零背景），確保后續(xù)讀數(shù)準(zhǔn)確?；蛑苯游?吹干殘余洗滌液（建議使用洗板機(jī)的吸水功能，避免氣泡）。

（三）樣本/標(biāo)準(zhǔn)品加樣與孵育

1.加樣樣本/標(biāo)準(zhǔn)品：在洗滌后的酶標(biāo)板上，用微量移液器依次加入樣本稀釋液（或標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液）和樣本/標(biāo)準(zhǔn)品。每個(gè)樣本/標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)復(fù)孔（至少2孔）。建議按以下順序加樣：陰性對(duì)照、空白對(duì)照（僅稀釋液）、低濃度標(biāo)準(zhǔn)品、中濃度標(biāo)準(zhǔn)品、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品、樣本1、樣本2……。每個(gè)孔加入體積必須準(zhǔn)確（通常是100μL）。

2.孵育：將加樣后的酶標(biāo)板封好封口膜，放入37℃水浴箱或恒溫箱孵育1-2小時(shí)（具體時(shí)間根據(jù)說明書和抗體性質(zhì)確定）。孵育過程中避免震動(dòng)，確?？贵w與樣本/標(biāo)準(zhǔn)品充分結(jié)合。

（四）洗滌（封閉后）

1.吸棄孵育液：同包被后的洗滌步驟，小心吸棄孔內(nèi)液體。

2.洗滌：向每個(gè)孔加入洗滌液（含0.05%Tween-20的PBS）約250μL，浸泡1-2分鐘。

3.彈出或吸棄洗滌液。重復(fù)此洗滌步驟5次。

4.吸干/吹干殘余洗滌液。此步洗滌對(duì)后續(xù)結(jié)果影響很大，需徹底。

（五）加酶標(biāo)抗體

1.復(fù)溫與混勻：取出酶標(biāo)抗體，在室溫或37℃水浴中平衡15-30分鐘。充分混勻酶標(biāo)抗體，確保HRP標(biāo)記的抗體分布均勻。

2.加樣：用微量移液器依次向每個(gè)孔中加入酶標(biāo)抗體。每個(gè)樣本/標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)復(fù)孔。每孔加入體積必須準(zhǔn)確（通常是100μL）。

3.孵育：將加樣后的酶標(biāo)板封好封口膜，放入37℃水浴箱或恒溫箱孵育1小時(shí)左右（具體時(shí)間根據(jù)說明書和抗體性質(zhì)確定）。孵育過程中避免震動(dòng)。

（六）洗滌（酶標(biāo)抗體孵育后）

1.吸棄孵育液：小心吸棄孔內(nèi)液體。

2.洗滌：向每個(gè)孔加入洗滌液（含0.05%Tween-20的PBS）約250μL，浸泡1-2分鐘。

3.彈出或吸棄洗滌液。重復(fù)此洗滌步驟5次。

4.吸干/吹干殘余洗滌液。此步洗滌對(duì)于去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體至關(guān)重要，需非常徹底，以降低背景值。

（七）加底物溶液顯色

1.復(fù)溫與混勻：取出底物溶液（TMB顯色液），在室溫或37℃水浴中平衡5-10分鐘。**注意：底物溶液通常對(duì)光敏感，此步驟應(yīng)在避光條件下進(jìn)行或使用避光酶標(biāo)板。**充分混勻底物溶液。

2.加樣：用微量移液器依次向每個(gè)孔中加入底物溶液。每孔加入體積必須準(zhǔn)確（通常是100μL）。**加完底物后，應(yīng)立即放入避光環(huán)境中孵育。**

3.孵育：將加樣后的酶標(biāo)板放入37℃避光水浴箱孵育15-30分鐘（具體時(shí)間根據(jù)說明書和底物穩(wěn)定性確定）。孵育過程中避免震動(dòng)和光線直射。顯色程度與抗體濃度成正比，但需注意避免過度孵育導(dǎo)致顏色褪色。

（八）加終止液終止反應(yīng)

1.吸棄底物液：小心吸棄孔內(nèi)顯色液（注意不要吸干）。

2.加終止液：用微量移液器依次向每個(gè)孔中加入終止液。每孔加入體積必須準(zhǔn)確（通常是50-100μL，需根據(jù)終止液濃度和酶標(biāo)儀讀數(shù)范圍調(diào)整）。終止液為強(qiáng)酸，加入時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣體，需緩慢加入并確?；旌暇鶆颉?/p>

3.靜置：加入終止液后，混勻酶標(biāo)板（輕輕搖晃或拍打），使顏色充分反應(yīng)。然后靜置幾分鐘，待顏色穩(wěn)定。

（九）結(jié)果檢測(cè)

1.立即讀板：終止反應(yīng)后，**應(yīng)立即**使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處讀取OD值。對(duì)于雙波長(zhǎng)檢測(cè)，同時(shí)讀取450nm和600nm（或參考波長(zhǎng)）的OD值，計(jì)算吸光度差值（450-600nm）以排除背景干擾。

2.記錄數(shù)據(jù)：準(zhǔn)確記錄每個(gè)孔的OD值。同時(shí)記錄酶標(biāo)板上的樣本/標(biāo)準(zhǔn)品位置。

3.處理數(shù)據(jù)：將原始OD值導(dǎo)入數(shù)據(jù)分析軟件（如Excel、專業(yè)ELISA數(shù)據(jù)分析軟件），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（常用四參數(shù)Logistic曲線或線性回歸），計(jì)算樣本的濃度或相對(duì)含量。

**四、質(zhì)量控制**

（一）質(zhì)控要求

1.每個(gè)實(shí)驗(yàn)都必須包含：

(1)陰性對(duì)照：不含目標(biāo)抗體的樣本稀釋液或生理鹽水，用于檢測(cè)非特異性結(jié)合和背景信號(hào)。

(2)陽性對(duì)照：含有已知濃度目標(biāo)抗體的標(biāo)準(zhǔn)品或質(zhì)控品，用于確認(rèn)檢測(cè)系統(tǒng)工作正常，并評(píng)估靈敏度。

(3)樣本復(fù)孔：每個(gè)樣本至少做兩個(gè)平行孔，計(jì)算平均值，以減少隨機(jī)誤差。若兩個(gè)孔結(jié)果差異過大（如超過平均值的20%或說明書規(guī)定范圍），需重新檢測(cè)該樣本。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：使用至少3個(gè)濃度梯度（通常跨越3個(gè)數(shù)量級(jí)）的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)具有良好的線性關(guān)系，R2值（相關(guān)系數(shù)）通常要求≥0.98或根據(jù)說明書要求。

3.質(zhì)控品檢測(cè)：使用批內(nèi)質(zhì)控（同批樣本檢測(cè)）和批間質(zhì)控（不同批樣本或不同實(shí)驗(yàn)日檢測(cè)）質(zhì)控品。質(zhì)控品結(jié)果應(yīng)在預(yù)定的范圍內(nèi)（如±15%或±20%的靶值范圍，具體參考質(zhì)控品說明書）。質(zhì)控結(jié)果失控時(shí)，需查找原因并重新檢測(cè)。

4.空白對(duì)照檢查：空白對(duì)照的OD值應(yīng)較低，通常在0.1-0.2之間（根據(jù)儀器和試劑靈敏度調(diào)整），若空白值過高，提示洗滌不徹底或試劑/樣本污染。

（二）常見問題排查與解決

1.**背景過高（所有孔OD值均偏高）**：

*檢查洗滌是否徹底，洗滌液是否正確使用（含Tween-20）。

*檢查酶標(biāo)板是否清潔，有無油污或劃痕。

*檢查試劑是否污染（如酶標(biāo)抗體、底物開蓋時(shí)間過長(zhǎng)）。

*檢查樣本是否含有高濃度非特異性物質(zhì)（如高甘油三酯、高脂血，可能需要預(yù)處理或稀釋）。

*檢查操作過程有無非特異性結(jié)合（如封閉不充分或過度）。

2.**背景過低（所有孔OD值均偏低）**：

*檢查底物溶液是否新鮮，儲(chǔ)存條件是否正確。

*檢查酶標(biāo)抗體是否失效或儲(chǔ)存不當(dāng)。

*檢查孵育時(shí)間是否不足或溫度不適宜。

*檢查樣本稀釋是否過度或加樣體積不準(zhǔn)確。

3.**標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差（R2<0.98）**：

*檢查標(biāo)準(zhǔn)品是否在有效期內(nèi)，儲(chǔ)存是否正確。

*檢查標(biāo)準(zhǔn)品是否被污染或溶解不均勻。

*檢查包被抗原濃度是否合適。

*檢查各步驟孵育時(shí)間、溫度是否一致且正確。

*檢查洗滌過程是否規(guī)范，有無氣泡。

4.**樣本結(jié)果偏高**：

*檢查樣本是否被污染。

*檢查樣本是否含有高濃度鉤狀效應(yīng)物質(zhì)（Heterophilicantibodies，可能與靶抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，需嘗試高稀釋度檢測(cè)）。

*檢查樣本處理是否不當(dāng)（如脂血未處理）。

5.**樣本結(jié)果偏低**：

*檢查樣本是否被稀釋過度。

*檢查加樣過程是否準(zhǔn)確，有無加樣錯(cuò)誤。

*檢查酶標(biāo)抗體是否失效或儲(chǔ)存不當(dāng)。

*檢查孵育過程是否充分。

**五、安全注意事項(xiàng)**

（一）個(gè)人防護(hù)

1.**必須**佩戴實(shí)驗(yàn)服、口罩、防護(hù)眼鏡或面屏。長(zhǎng)時(shí)間操作或處理刺激性試劑時(shí)，應(yīng)佩戴手套（建議使用丁腈或乳膠手套）。

2.操作具有傳染性風(fēng)險(xiǎn)（如檢測(cè)病原體抗體）的樣本時(shí)，應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，并采取相應(yīng)的生物安全級(jí)別防護(hù)措施。

3.使用微量移液器時(shí)，注意避免噴濺。吸取和排放液體時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕柔。

4.處理酸（終止液）時(shí)，應(yīng)佩戴耐酸手套，避免接觸皮膚和眼睛。在通風(fēng)良好的臺(tái)面上操作。

5.操作結(jié)束后，徹底清洗雙手。

（二）試劑安全

1.所有試劑標(biāo)簽清晰，取用前仔細(xì)閱讀說明書，了解其性質(zhì)（如腐蝕性、刺激性、易燃性）和安全操作要求。

2.底物溶液（TMB）對(duì)光敏感且可能具有刺激性，配制和儲(chǔ)存需避光，操作時(shí)避免接觸皮膚和眼睛。若不慎接觸，應(yīng)立即用大量流動(dòng)清水沖洗。

3.終止液為強(qiáng)酸，具有強(qiáng)腐蝕性，操作時(shí)需特別小心，避免濺出。配制時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。

4.乙醇等有機(jī)溶劑具有一定的易燃性，使用時(shí)遠(yuǎn)離明火，確保實(shí)驗(yàn)區(qū)域通風(fēng)良好。

5.試劑應(yīng)妥善儲(chǔ)存，避免混淆和污染。開封后的試劑根據(jù)其穩(wěn)定性按說明書要求保存和使用。

（三）廢棄物處理

1.實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的所有廢棄物，包括使用過的吸頭、移液器頭、酶標(biāo)板、廢棄樣本、離心管等，應(yīng)分類收集到指定的廢棄物容器中。

2.含有潛在生物風(fēng)險(xiǎn)的樣本和試劑（如未滅活的臨床樣本、洗滌液等）必須經(jīng)過高壓蒸汽滅菌處理后才能作為普通醫(yī)療廢物處理，或按實(shí)驗(yàn)室規(guī)定進(jìn)行化學(xué)消毒。

3.廢棄化學(xué)試劑（如洗滌液、底物液剩余部分、終止液等）不得直接倒入下水道。應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室化學(xué)廢棄物管理規(guī)定進(jìn)行收集和處理，交由有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)處理。

4.廢棄酶標(biāo)板通常需要高壓滅菌后，方可按普通垃圾或化學(xué)廢棄物處理，具體依據(jù)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)和實(shí)驗(yàn)室規(guī)定。

**六、記錄與保存**

（一）記錄要求

1.每次檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均需填寫詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)記錄表。記錄內(nèi)容應(yīng)包括：

*實(shí)驗(yàn)日期和время

*實(shí)驗(yàn)員姓名和編號(hào)

*儀器設(shè)備名稱和編號(hào)

*試劑名稱、批號(hào)、有效期、操作濃度

*實(shí)驗(yàn)方案（如標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、孵育條件等）

*樣本信息（編號(hào)、來源、稀釋倍數(shù)等）

*陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、空白對(duì)照的OD值

*所有樣本/標(biāo)準(zhǔn)品的原始OD值

*繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)（方程式、R2值）

*樣本計(jì)算結(jié)果（濃度或相對(duì)含量）

*實(shí)驗(yàn)過程中遇到的問題及解決方法

2.記錄應(yīng)清晰、準(zhǔn)確、及時(shí)，字跡工整或電子記錄無誤。

3.如使用自動(dòng)化系統(tǒng)，需打印原始數(shù)據(jù)報(bào)告并存檔。

（二）試劑保存

1.所有試劑（包括自配和商業(yè)試劑盒配套試劑）均需有清晰的標(biāo)簽，注明名稱、濃度、配制/開瓶日期、有效期、操作說明（如是否需要平衡、平衡溫度和時(shí)間）。

2.試劑應(yīng)按其要求的儲(chǔ)存條件（2-8℃、-20℃、-80℃等）儲(chǔ)存。使用前檢查試劑是否在有效期內(nèi)，有無變色、沉淀、渾濁等異?，F(xiàn)象。開封后的試劑使用量應(yīng)記錄，并按其穩(wěn)定性要求盡快使用完畢或重新密封冷藏。

3.底物溶液等光敏感試劑應(yīng)儲(chǔ)存于棕色瓶中，并置于避光處。

4.廢棄試劑或過期試劑應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)定進(jìn)行安全處置。

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一、概述

免疫學(xué)抗體檢測(cè)是利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，通過檢測(cè)樣本中目標(biāo)抗體的存在或含量，進(jìn)行疾病診斷、健康評(píng)估或研究分析的重要技術(shù)。本規(guī)程旨在規(guī)范免疫學(xué)抗體檢測(cè)的操作流程，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。操作人員需嚴(yán)格按照規(guī)程執(zhí)行，熟悉相關(guān)儀器設(shè)備、試劑原理及安全注意事項(xiàng)。

二、儀器與試劑準(zhǔn)備

（一）儀器設(shè)備

1.酶標(biāo)儀

2.微量移液器（不同量程）

3.水浴鍋

4.電動(dòng)混勻器

5.冰箱（2-8℃）

6.超凈工作臺(tái)

（二）試劑與耗材

1.標(biāo)準(zhǔn)品/質(zhì)控品

2.樣本稀釋液（pH7.4PBS緩沖液）

3.酶標(biāo)抗體（辣根過氧化物酶標(biāo)記）

4.底物溶液（TMB顯色液）

5.終止液（2MH?SO?）

6.96孔酶標(biāo)板

7.無菌吸頭

三、操作步驟

（一）樣本處理

1.樣本采集：采集靜脈血或組織樣本，避免溶血。

2.處理方法：

(1)血清樣本：室溫靜置30分鐘，3000rpm離心10分鐘，取上清。

(2)組織樣本：勻漿后加入蛋白酶K消化，提取總蛋白。

（二）加樣步驟

1.配制樣本：將樣本用稀釋液按1:5稀釋，混勻。

2.加樣操作：

(1)設(shè)定復(fù)孔，每孔加入100μL樣本或標(biāo)準(zhǔn)品。

(2)設(shè)陰性對(duì)照（空白稀釋液）、陽性對(duì)照（已知抗體標(biāo)準(zhǔn)）。

（三）孵育與反應(yīng)

1.抗體孵育：

(1)加入50μL酶標(biāo)抗體，37℃孵育60分鐘。

(2)用稀釋液洗滌3次，每次300μL，吸干。

2.顯色反應(yīng)：

(1)加入100μL底物溶液，避光孵育30分鐘。

(2)加入50μL終止液，終止反應(yīng)。

（四）結(jié)果檢測(cè)

1.酶標(biāo)儀檢測(cè)：450nm波長(zhǎng)讀板，記錄OD值。

2.數(shù)據(jù)分析：計(jì)算樣本濃度，對(duì)比陽性對(duì)照確定結(jié)果。

四、質(zhì)量控制

（一）質(zhì)控要求

1.每批次檢測(cè)必須包含陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值應(yīng)≥0.98。

（二）常見問題排查

1.結(jié)果偏高：檢查樣本是否存在干擾物（如高甘油三酯）。

2.結(jié)果偏低：確認(rèn)抗體濃度及孵育時(shí)間是否準(zhǔn)確。

五、安全注意事項(xiàng)

（一）個(gè)人防護(hù)

1.佩戴手套、護(hù)目鏡，實(shí)驗(yàn)服覆蓋皮膚。

2.操作后用75%酒精消毒臺(tái)面。

（二）廢棄物處理

1.化學(xué)廢棄物按實(shí)驗(yàn)室規(guī)定分類處理。

2.廢棄吸頭和酶標(biāo)板統(tǒng)一收集。

六、記錄與保存

（一）記錄要求

1.記錄樣本編號(hào)、檢測(cè)日期、操作人。

2.保存原始數(shù)據(jù)及結(jié)果分析報(bào)告。

（二）試劑保存

1.酶標(biāo)抗體及底物需避光保存于2-8℃。

2.使用后未開封試劑可冷藏保存1個(gè)月。

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**一、概述**

免疫學(xué)抗體檢測(cè)是利用抗原抗體之間高度特異性的結(jié)合反應(yīng)，通過體外實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)生物樣本（如血清、血漿、組織液等）中特定抗體的存在、濃度或活性。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷（如傳染病篩查、自身免疫性疾病檢測(cè)）、生物研究（如藥物研發(fā)、疫苗效果評(píng)估）、食品安全（如過敏原檢測(cè)）等領(lǐng)域?？贵w檢測(cè)方法多樣，常見的包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）、膠體金免疫層析法（試紙條）等。本規(guī)程以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）為例，詳細(xì)闡述抗體檢測(cè)的操作流程。本規(guī)程旨在為實(shí)驗(yàn)室操作人員提供標(biāo)準(zhǔn)化的操作指導(dǎo)，確保檢測(cè)過程的規(guī)范性和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性，減少操作誤差和潛在風(fēng)險(xiǎn)。

**二、儀器與試劑準(zhǔn)備**

（一）儀器設(shè)備

1.酶標(biāo)儀：具備450nm濾光片，推薦使用雙波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（如450/600nm）以提高精度，需定期校準(zhǔn)。配備可移動(dòng)的吸液針頭，確保讀數(shù)一致。

2.微量移液器：配置不同量程（如1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL），需經(jīng)過校準(zhǔn)，并使用對(duì)應(yīng)規(guī)格的無菌吸頭。操作人員應(yīng)熟悉其使用方法，特別是預(yù)吸、吹打、觸壁等關(guān)鍵步驟。

3.水浴鍋：溫度范圍可調(diào)（建議0-60℃），具有溫度均勻性監(jiān)測(cè)功能，配備智能控溫系統(tǒng)。

4.電動(dòng)混勻器/渦旋混合器：用于混勻樣本、試劑和洗滌液，確保充分均勻。渦旋混合器適用于小體積快速混勻，需注意避免過度渦旋導(dǎo)致氣泡或樣品變性。

5.冰箱：用于保存低溫要求試劑（2-8℃）和樣本，確保溫度穩(wěn)定。

6.超凈工作臺(tái)/生物安全柜：提供無菌操作環(huán)境，防止樣品污染。使用前需進(jìn)行空間滅菌（如紫外燈照射30分鐘，或使用循環(huán)風(fēng)殺菌模式），并檢查風(fēng)速和過濾器狀態(tài)。

7.電子天平：用于精確稱量試劑（如洗滌液、稀釋液），精度至少為±0.1mg。

8.移液槍架：便于規(guī)范操作和存放移液器。

9.實(shí)驗(yàn)臺(tái)：建議使用耐腐蝕、易清潔的材料。

（二）試劑與耗材

1.樣本稀釋液：通常為磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4±0.1），需新鮮配制或使用商業(yè)試劑盒提供的即用型稀釋液。使用前需確認(rèn)無沉淀或污染。

2.酶標(biāo)抗體（檢測(cè)抗體）：即用于捕獲樣本中目標(biāo)抗原或直接與樣本中目標(biāo)抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體。需檢查試劑說明書，了解其工作濃度、儲(chǔ)存條件（通常為2-8℃或-20℃）和有效期。使用前需在室溫或37℃水浴中適當(dāng)復(fù)溫（根據(jù)說明書要求，通常15-30分鐘），并充分混勻。

3.標(biāo)準(zhǔn)品/質(zhì)控品：標(biāo)準(zhǔn)品用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，質(zhì)控品用于監(jiān)控批間和批內(nèi)變異。標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)具有已知濃度且在有效期內(nèi)的證書。質(zhì)控品應(yīng)覆蓋臨床診斷或研究的相關(guān)范圍。需按說明書要求稀釋或直接使用。

4.抗原包被液：用于包被固相載體的溶液，通常是含0.05%Tween-20的PBS或包被緩沖液（根據(jù)抗體性質(zhì)選擇）。需新鮮配制或按說明書使用。

5.底物溶液（TMB顯色液）：辣根過氧化物酶（HRP）的顯色劑，通常是含有TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）和H?O?的溶液。需新鮮配制或使用試劑盒配套試劑，避免光照。顯色液對(duì)光敏感，配制和儲(chǔ)存需避光。

6.終止液：用于終止酶促反應(yīng)，通常是2MH?SO?或濃鹽酸。需現(xiàn)配現(xiàn)用，具有強(qiáng)酸性，操作時(shí)需小心。

7.96孔酶標(biāo)板：聚苯乙烯材質(zhì)，需具有低吸附性，建議使用預(yù)包被板或經(jīng)處理（如用包被液封閉）的板。使用前檢查板孔是否清潔、透明，無破損。

8.無菌吸頭：根據(jù)不同加樣體積選擇合適規(guī)格（如200μL、100μL、50μL、10μL等），需保證無菌，建議使用一次性無菌吸頭。

9.封閉液（可選）：如脫脂奶粉、BSA（牛血清白蛋白）溶液，用于阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景干擾。通常為含0.05%Tween-20的PBS或封閉緩沖液。

10.洗滌液：通常為含0.05%Tween-20的PBS或洗滌緩沖液。需使用純化水配制，確保無離子污染物。使用前需混勻。

**三、操作步驟**

（一）樣本處理與準(zhǔn)備

1.樣本接收與標(biāo)識(shí)：接收樣本時(shí)核對(duì)樣本標(biāo)簽信息與委托單是否一致，記錄樣本編號(hào)、接收時(shí)間。確保樣本量充足（至少滿足檢測(cè)所需體積及浪費(fèi)）。對(duì)樣本進(jìn)行清晰標(biāo)識(shí)，防止混淆。

2.樣本儲(chǔ)存：未檢測(cè)樣本根據(jù)要求儲(chǔ)存于2-8℃或-20℃冰箱，避免反復(fù)凍融。需記錄凍融次數(shù)。

3.樣本處理：

(1)血清/血漿樣本：室溫靜置30分鐘～1小時(shí)，使標(biāo)本充分凝血（對(duì)于血漿樣本）。3000rpm離心10分鐘，小心吸取上清，避免吸到管底沉淀或組織碎屑。若樣本為高脂血癥，可能需進(jìn)行脂血清除或稀釋處理。

(2)組織樣本：新鮮組織或凍存組織塊用無菌生理鹽水沖洗。根據(jù)組織類型選擇合適的勻漿方法（如組織搗碎器、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)），勻漿時(shí)可加入蛋白酶K（根據(jù)說明書濃度）進(jìn)行組織蛋白消化。10000rpm離心20分鐘，取上清液。必要時(shí)可通過透析或超濾去除大分子物質(zhì)或蛋白酶。

(3)其他樣本（如尿液、腦脊液等）：按相應(yīng)樣本類型說明書處理，必要時(shí)進(jìn)行離心或過濾。

4.樣本稀釋：根據(jù)試劑盒說明書要求，用樣本稀釋液將樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋。例如，若要求樣本稀釋50倍，則取100μL樣本加入含有400μL稀釋液的離心管中，充分混勻?；靹蚩捎脺u旋混合器快速混勻或顛倒混勻10次以上。稀釋后的樣本需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)，避免長(zhǎng)時(shí)間放置導(dǎo)致抗體活性變化。

（二）ELISA板準(zhǔn)備與包被（以雙抗體夾心法為例）

1.試劑平衡：所有試劑（稀釋液、包被液、抗體、酶標(biāo)抗體、洗滌液、底物液、終止液）在使用前均需在室溫或37℃水浴中平衡15-30分鐘，使其溫度與反應(yīng)體系一致，減少因溫差帶來的誤差。

2.包被板處理：

(1)取出酶標(biāo)板，檢查板孔是否有破損或污漬。如有問題，應(yīng)更換新板。

(2)用移液器吸取適量包被液（含抗原），加入每個(gè)孔中，每孔約100-200μL。注意加樣速度均勻，避免產(chǎn)生氣泡。

(3)將酶標(biāo)板置于濕盒（底部墊有濕潤(rùn)紗布或保鮮膜）中，封口膜封好，放入37℃水浴箱或恒溫箱孵育1-4小時(shí)（具體時(shí)間根據(jù)說明書和抗原穩(wěn)定性確定）。孵育過程中保持濕度，防止板底液體蒸發(fā)。

3.洗滌：孵育結(jié)束后，小心吸棄板內(nèi)液體（可傾斜板子，用吸水紙吸去邊緣液體，但不要吸干孔內(nèi)液體）。用洗板機(jī)或手工洗滌：

(1)向每個(gè)孔加入洗滌液（含0.05%Tween-20的PBS）約250μL，浸泡1-2分鐘。

(2)彈出或吸棄洗滌液。重復(fù)此洗滌步驟5次。

(3)洗滌后，可在酶標(biāo)儀上用空白孔調(diào)零（調(diào)零背景），確保后續(xù)讀數(shù)準(zhǔn)確?；蛑苯游?吹干殘余洗滌液（建議使用洗板機(jī)的吸水功能，避免氣泡）。

（三）樣本/標(biāo)準(zhǔn)品加樣與孵育

1.加樣樣本/標(biāo)準(zhǔn)品：在洗滌后的酶標(biāo)板上，用微量移液器依次加入樣本稀釋液（或標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液）和樣本/標(biāo)準(zhǔn)品。每個(gè)樣本/標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)復(fù)孔（至少2孔）。建議按以下順序加樣：陰性對(duì)照、空白對(duì)照（僅稀釋液）、低濃度標(biāo)準(zhǔn)品、中濃度標(biāo)準(zhǔn)品、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品、樣本1、樣本2……。每個(gè)孔加入體積必須準(zhǔn)確（通常是100μL）。

2.孵育：將加樣后的酶標(biāo)板封好封口膜，放入37℃水浴箱或恒溫箱孵育1-2小時(shí)（具體時(shí)間根據(jù)說明書和抗體性質(zhì)確定）。孵育過程中避免震動(dòng)，確保抗體與樣本/標(biāo)準(zhǔn)品充分結(jié)合。

（四）洗滌（封閉后）

1.吸棄孵育液：同包被后的洗滌步驟，小心吸棄孔內(nèi)液體。

2.洗滌：向每個(gè)孔加入洗滌液（含0.05%Tween-20的PBS）約250μL，浸泡1-2分鐘。

3.彈出或吸棄洗滌液。重復(fù)此洗滌步驟5次。

4.吸干/吹干殘余洗滌液。此步洗滌對(duì)后續(xù)結(jié)果影響很大，需徹底。

（五）加酶標(biāo)抗體

1.復(fù)溫與混勻：取出酶標(biāo)抗體，在室溫或37℃水浴中平衡15-30分鐘。充分混勻酶標(biāo)抗體，確保HRP標(biāo)記的抗體分布均勻。

2.加樣：用微量移液器依次向每個(gè)孔中加入酶標(biāo)抗體。每個(gè)樣本/標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)復(fù)孔。每孔加入體積必須準(zhǔn)確（通常是100μL）。

3.孵育：將加樣后的酶標(biāo)板封好封口膜，放入37℃水浴箱或恒溫箱孵育1小時(shí)左右（具體時(shí)間根據(jù)說明書和抗體性質(zhì)確定）。孵育過程中避免震動(dòng)。

（六）洗滌（酶標(biāo)抗體孵育后）

1.吸棄孵育液：小心吸棄孔內(nèi)液體。

2.洗滌：向每個(gè)孔加入洗滌液（含0.05%Tween-20的PBS）約250μL，浸泡1-2分鐘。

3.彈出或吸棄洗滌液。重復(fù)此洗滌步驟5次。

4.吸干/吹干殘余洗滌液。此步洗滌對(duì)于去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體至關(guān)重要，需非常徹底，以降低背景值。

（七）加底物溶液顯色

1.復(fù)溫與混勻：取出底物溶液（TMB顯色液），在室溫或37℃水浴中平衡5-10分鐘。**注意：底物溶液通常對(duì)光敏感，此步驟應(yīng)在避光條件下進(jìn)行或使用避光酶標(biāo)板。**充分混勻底物溶液。

2.加樣：用微量移液器依次向每個(gè)孔中加入底物溶液。每孔加入體積必須準(zhǔn)確（通常是100μL）。**加完底物后，應(yīng)立即放入避光環(huán)境中孵育。**

3.孵育：將加樣后的酶標(biāo)板放入37℃避光水浴箱孵育15-30分鐘（具體時(shí)間根據(jù)說明書和底物穩(wěn)定性確定）。孵育過程中避免震動(dòng)和光線直射。顯色程度與抗體濃度成正比，但需注意避免過度孵育導(dǎo)致顏色褪色。

（八）加終止液終止反應(yīng)

1.吸棄底物液：小心吸棄孔內(nèi)顯色液（注意不要吸干）。

2.加終止液：用微量移液器依次向每個(gè)孔中加入終止液。每孔加入體積必須準(zhǔn)確（通常是50-100μL，需根據(jù)終止液濃度和酶標(biāo)儀讀數(shù)范圍調(diào)整）。終止液為強(qiáng)酸，加入時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣體，需緩慢加入并確?；旌暇鶆?。

3.靜置：加入終止液后，混勻酶標(biāo)板（輕輕搖晃或拍打），使顏色充分反應(yīng)。然后靜置幾分鐘，待顏色穩(wěn)定。

（九）結(jié)果檢測(cè)

1.立即讀板：終止反應(yīng)后，**應(yīng)立即**使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處讀取OD值。對(duì)于雙波長(zhǎng)檢測(cè)，同時(shí)讀取450nm和600nm（或參考波長(zhǎng)）的OD值，計(jì)算吸光度差值（450-600nm）以排除背景干擾。

2.記錄數(shù)據(jù)：準(zhǔn)確記錄每個(gè)孔的OD值。同時(shí)記錄酶標(biāo)板上的樣本/標(biāo)準(zhǔn)品位置。

3.處理數(shù)據(jù)：將原始OD值導(dǎo)入數(shù)據(jù)分析軟件（如Excel、專業(yè)ELISA數(shù)據(jù)分析軟件），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（常用四參數(shù)Logistic曲線或線性回歸），計(jì)算樣本的濃度或相對(duì)含量。

**四、質(zhì)量控制**

（一）質(zhì)控要求

1.每個(gè)實(shí)驗(yàn)都必須包含：

(1)陰性對(duì)照：不含目標(biāo)抗體的樣本稀釋液或生理鹽水，用于檢測(cè)非特異性結(jié)合和背景信號(hào)。

(2)陽性對(duì)照：含有已知濃度目標(biāo)抗體的標(biāo)準(zhǔn)品或質(zhì)控品，用于確認(rèn)檢測(cè)系統(tǒng)工作正常，并評(píng)估靈敏度。

(3)樣本復(fù)孔：每個(gè)樣本至少做兩個(gè)平行孔，計(jì)算平均值，以減少隨機(jī)誤差。若兩個(gè)孔結(jié)果差異過大（如超過平均值的20%或說明書規(guī)定范圍），需重新檢測(cè)該樣本。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：使用至少3個(gè)濃度梯度（通?？缭?個(gè)數(shù)量級(jí)）的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)具有良好的線性關(guān)系，R2值（相關(guān)系數(shù)）通常要求≥0.98或根據(jù)說明書要求。

3.質(zhì)控品檢測(cè)：使用批內(nèi)質(zhì)控（同批樣本檢測(cè)）和批間質(zhì)控（不同批樣本或不同實(shí)驗(yàn)日檢測(cè)）質(zhì)控品。質(zhì)控品結(jié)果應(yīng)在預(yù)定的范圍內(nèi)（如±15%或±20%的靶值范圍，具體參考質(zhì)控品說明書）。質(zhì)控結(jié)果失控時(shí)，需查找原因并重新檢測(cè)。

4.空白對(duì)照檢查：空白對(duì)照的OD值應(yīng)較低，通常在0.1-0.2之間（根據(jù)儀器和試劑靈敏度調(diào)整），若空白值過高，提示洗滌不徹底或試劑/樣本污染。

（二）常見問題排查與解決

1.**背景過高（所有孔OD值均偏高）**：

*檢查洗滌是否徹底，洗滌液是否正確使用（含Tween-20）。

*檢查酶標(biāo)板是否清潔，有無油污或劃痕。

*檢查試劑是否污染（如酶標(biāo)抗體、底物開蓋時(shí)間過長(zhǎng)）。

*檢查樣本是否含有高濃度非特異性物質(zhì)（如高甘油三酯、高脂血，可能需要預(yù)處理或稀釋）。

*檢查操作過程有無非特異性結(jié)合（如封閉不充分或過度）。

2.**背景過低（所有孔OD值均偏低）**：

*檢查底物溶液是否新鮮，儲(chǔ)存條件是否正確。

*檢查酶標(biāo)抗體是否失效或儲(chǔ)存不當(dāng)。

*檢查孵育時(shí)間是否不足或溫度不適宜。

*檢查樣本稀釋是否過度或加樣體積不準(zhǔn)確。

3.**標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差（R2<0.98）**：

*檢查標(biāo)準(zhǔn)品是否在有效期內(nèi)，儲(chǔ)存是否正確。

*檢查標(biāo)準(zhǔn)品是否被污染或溶解不均勻。

*檢查包被抗原濃度是否合適。

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