免疫學(xué)操作規(guī)程做法總結(jié)一、免疫學(xué)操作規(guī)程概述

免疫學(xué)操作規(guī)程是指在免疫學(xué)實驗或臨床檢測中，為確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性及操作人員的安全而制定的一系列標(biāo)準(zhǔn)化流程。本總結(jié)旨在系統(tǒng)梳理免疫學(xué)常用操作規(guī)程的關(guān)鍵步驟、注意事項及質(zhì)量控制要點，涵蓋樣本處理、試劑準(zhǔn)備、實驗操作及結(jié)果分析等核心環(huán)節(jié)。

二、樣本處理與制備

（一）樣本類型與采集

1.血清樣本：靜脈采血，室溫靜置30分鐘，3000rpm離心10分鐘分離。

2.唾液樣本：晨起收集，4℃保存，12000rpm離心10分鐘取上清。

3.細(xì)胞樣本：外周血分離PBMC，或組織切片經(jīng)固定-脫水處理。

（二）樣本保存與運輸

1.低溫保存：液體樣本-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。

2.運輸要求：使用保溫箱，樣本標(biāo)識清晰，運輸時間≤4小時。

三、試劑準(zhǔn)備與校準(zhǔn)

（一）試劑配制

1.依說明書比例稀釋抗體或酶標(biāo)液，使用去離子水或無菌水。

2.pH調(diào)節(jié)：使用Tris-HCl或PBS緩沖液，確保pH值在6.0-7.5。

（二）儀器校準(zhǔn)

1.酶標(biāo)儀：每日校準(zhǔn)吸光度（A）值，使用空白對照調(diào)零。

2.移液器：定期校準(zhǔn)量程，誤差≤±2%。

四、免疫學(xué)實驗操作

（一）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

1.步驟：

(1)包被：96孔板加入抗體，4℃過夜。

(2)封閉：TBST洗板3次，加入封閉液，37℃孵育1小時。

(3)孵育：依次加入樣本、酶標(biāo)二抗，室溫避光30分鐘。

(4)顯色：TMB顯色10-20分鐘，終止液終止反應(yīng)。

2.注意事項：

-每步孵育后需用TBST洗滌，避免交叉污染。

-使用酶標(biāo)板振蕩器混勻樣本。

（二）流式細(xì)胞術(shù)操作

1.步驟：

(1)細(xì)胞染色：冰臺避光染色，抗體濃度≤1μg/10^6細(xì)胞。

(2)上機(jī)：加入FACS溶血素，流式管裝量100-200μL。

(3)數(shù)據(jù)采集：設(shè)置門控，采集10000個事件。

2.質(zhì)控指標(biāo)：

-活細(xì)胞比例≥85%，熒光信號無飽和。

五、結(jié)果分析與記錄

（一）數(shù)據(jù)分析

1.ELISA：使用GraphPadPrism計算OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.流式：分析細(xì)胞亞群比例，統(tǒng)計學(xué)方法使用ANOVA或t檢驗。

（二）記錄規(guī)范

1.實驗日志：記錄試劑批號、操作人、環(huán)境溫度等關(guān)鍵參數(shù)。

2.異常處理：記錄實驗偏差及糾正措施，如樣本污染需重做實驗。

六、安全與廢棄物處理

（一）個人防護(hù)

1.必須佩戴手套、護(hù)目鏡，操作生物樣本時穿實驗服。

2.使用生物安全柜處理氣溶膠高風(fēng)險操作。

（二）廢棄物分類

1.化學(xué)廢棄物：銳器放入專用銳器盒，有機(jī)溶劑單獨收集。

2.生物廢棄物：高壓滅菌后按醫(yī)療廢物處理。

七、總結(jié)

免疫學(xué)操作規(guī)程的規(guī)范化執(zhí)行是保障實驗質(zhì)量的基礎(chǔ)。通過標(biāo)準(zhǔn)化樣本處理、試劑配制及實驗流程，可降低誤差并提升結(jié)果可靠性。同時，嚴(yán)格的安全管理措施需貫穿整個實驗過程，確保操作人員與環(huán)境安全。

一、免疫學(xué)操作規(guī)程概述

免疫學(xué)操作規(guī)程是指在免疫學(xué)實驗或臨床檢測中，為確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性及操作人員的安全而制定的一系列標(biāo)準(zhǔn)化流程。本總結(jié)旨在系統(tǒng)梳理免疫學(xué)常用操作規(guī)程的關(guān)鍵步驟、注意事項及質(zhì)量控制要點，涵蓋樣本處理、試劑準(zhǔn)備、實驗操作及結(jié)果分析等核心環(huán)節(jié)。本規(guī)程的制定基于國內(nèi)外權(quán)威實驗室的實踐經(jīng)驗，并結(jié)合了常見的免疫學(xué)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）、免疫熒光（IF）等，旨在為實驗室工作人員提供一套完整且實用的操作指南。

二、樣本處理與制備

（一）樣本類型與采集

1.血清樣本：

-采集方法：采用靜脈采血法，推薦使用含有肝素或EDTA的抗凝管（根據(jù)后續(xù)實驗需求選擇）。采血量需滿足實驗需求，通常為3-5mL。采血后需在室溫下靜置30分鐘至1小時，使血液充分凝固，避免溶血。

-分離方法：將采血管置于水平面上，以3000rpm離心10分鐘，分離血清。血清應(yīng)盡量避免與管壁接觸，小心吸取上層澄清液體，避免吸到下層血細(xì)胞。

-處理方法：吸取的血清可立即用于實驗，或分裝后-20℃或-80℃凍存。避免反復(fù)凍融，建議首次凍存前進(jìn)行過速冷凍，以減少冰晶形成對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。

2.唾液樣本：

-采集方法：建議在晨起空腹?fàn)顟B(tài)下采集，使用無菌唾液收集管或吸管。指導(dǎo)受試者充分漱口（使用無菌水），然后含住收集管緩慢吐出唾液，直至達(dá)到預(yù)定體積（通常為1-2mL）。

-處理方法：收集后的唾液樣本需在4℃條件下保存，12000rpm離心10分鐘，取上清液用于實驗。若需長期保存，應(yīng)先分裝后-20℃凍存。

3.細(xì)胞樣本：

-外周血單個核細(xì)胞（PBMC）分離：

(1)抗凝采血：使用肝素抗凝管采集外周血（采血量根據(jù)后續(xù)實驗需求確定）。

(2)Ficoll-Paque密度梯度離心：將外周血與等體積Ficoll-Paque溶液（密度1.077g/mL）混合后，小心緩慢倒入專用分離管中，3000rpm離心30分鐘。PBMC位于血漿與Ficoll層之間，用移液器小心吸取PBMC層。

(3)洗滌：將PBMC重懸于預(yù)冷PBS緩沖液中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。重復(fù)洗滌2-3次，直至上清液無色透明。

-組織樣本處理：

(1)固定：新鮮組織立即置于4%多聚甲醛溶液中固定4-6小時。

(2)脫水：依次使用梯度乙醇（30%,50%,70%,90%,100%）脫水，每次浸泡30分鐘。

(3)透明：將組織置于二甲苯中透明2次，每次30分鐘。

(4)浸蠟：逐級加入石蠟（50%-60%石蠟：二甲苯=1:1，60%-70%石蠟：二甲苯=1:1，70%-80%石蠟：二甲苯=1:1，80%-90%石蠟：二甲苯=1:1，90%-100%石蠟：二甲苯=1:1，100%石蠟），每次浸蠟60分鐘。

(4)包埋：將組織塊放入預(yù)熱的石蠟?zāi)＞咧?，置?0℃烘箱過夜，待石蠟完全凝固。

（二）樣本保存與運輸

1.低溫保存：

-液體樣本：血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清等液體樣本，若短期使用（1周內(nèi)），可4℃保存；若長期保存（數(shù)月至數(shù)年），需-20℃或-80℃凍存。分裝保存可減少反復(fù)凍融對樣本造成的損傷。在凍存前應(yīng)使用預(yù)冷管吸取樣本，避免樣本在取用過程中發(fā)生溫度變化。

-細(xì)胞樣本：PBMC等細(xì)胞樣本應(yīng)盡快處理，若需保存，建議使用細(xì)胞凍存液（含10%FBS和10%DMSO）重懸后，分裝至凍存管，-80℃凍存。凍存時需緩慢降溫，并可在-20℃過夜再轉(zhuǎn)移至-80℃。

2.運輸要求：

-樣本標(biāo)識：所有樣本均需貼上清晰標(biāo)簽，包含樣本編號、采集日期、樣本類型、受試者信息（如適用）等。

-保溫運輸：對于需在4℃保存的樣本，應(yīng)使用帶冰袋的保溫箱運輸，確保運輸過程中溫度穩(wěn)定。運輸時間盡量控制在4小時內(nèi)，若距離較遠(yuǎn)，建議使用冷藏車或干冰（-80℃）進(jìn)行運輸。

-安全運輸：對于生物樣本，應(yīng)遵守相關(guān)生物安全運輸規(guī)定，使用符合標(biāo)準(zhǔn)的生物樣本運輸箱，避免樣本泄漏造成環(huán)境污染。

三、試劑準(zhǔn)備與校準(zhǔn)

（一）試劑配制

1.抗體稀釋：

-根據(jù)抗體說明書推薦的濃度范圍，使用PBS或Tris-HCl緩沖液進(jìn)行稀釋。例如，ELISA檢測抗體通常使用100-200ng/mL的濃度。稀釋時需使用移液器精確量取抗體和緩沖液，并充分混勻。

-對于直接免疫熒光染色，抗體濃度通常為0.5-1μg/mL。稀釋后需在4℃避光孵育30分鐘，使抗體充分結(jié)合。

2.酶標(biāo)二抗稀釋：

-酶標(biāo)二抗（如HRP或AP標(biāo)記的二抗）的稀釋濃度需根據(jù)說明書和實際實驗需求確定，通常為1-5μg/mL。稀釋后需在室溫避光孵育30分鐘。

3.底物配制：

-TMB顯色液：使用無水乙醇或甲醇配制TMB底物，濃度通常為3-5mg/mL。配制后需避光保存，避免光降解。

-DAB顯色液：使用去離子水配制DAB底物，濃度通常為0.1-0.3mg/mL。配制后需立即使用，避免久置后氧化失效。

（二）儀器校準(zhǔn)

1.酶聯(lián)免疫吸附儀（ELISAReader）：

-每日校準(zhǔn)：使用空白對照（不含樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的孔）校準(zhǔn)吸光度（A）值，確保讀數(shù)在0-1.0范圍內(nèi)。若讀數(shù)超出范圍，需調(diào)整儀器增益或更換空白對照。

-波長校準(zhǔn)：使用已知波長的標(biāo)準(zhǔn)品（如純凈水在260nm處的A值）校準(zhǔn)儀器波長，確保讀數(shù)準(zhǔn)確。

2.移液器：

-定期校準(zhǔn)：使用移液器校準(zhǔn)儀對移液器進(jìn)行校準(zhǔn)，確保其量程誤差在±2%以內(nèi)。校準(zhǔn)頻率建議為每月一次，高精度操作時需增加校準(zhǔn)次數(shù)。

-校準(zhǔn)方法：使用已知密度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（如去離子水）進(jìn)行校準(zhǔn)，記錄每次校準(zhǔn)的結(jié)果，并對超出誤差范圍的移液器進(jìn)行維修或更換。

3.電子天平：

-定期校準(zhǔn)：使用標(biāo)準(zhǔn)砝碼對電子天平進(jìn)行校準(zhǔn)，確保其讀數(shù)誤差在±0.0001g以內(nèi)。校準(zhǔn)頻率建議為每周一次，高精度稱量時需增加校準(zhǔn)次數(shù)。

-校準(zhǔn)方法：將標(biāo)準(zhǔn)砝碼依次放置于天平上，記錄每次校準(zhǔn)的結(jié)果，并對超出誤差范圍的天平進(jìn)行維修或更換。

四、免疫學(xué)實驗操作

（一）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

1.步驟：

(1)包被：

-將稀釋好的抗體加入ELISA板中，每孔100-200μL，4℃過夜包被。包被前需用洗滌液（如TBST）洗滌ELISA板3次，每次3分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。

-包被后需用封閉液（如5%BSA或skimmilk）封閉非特異性結(jié)合位點，37℃孵育1小時。封閉前需用洗滌液洗滌ELISA板3次，每次3分鐘。

(2)洗滌：每次加入洗滌液后，需使用ELISA板振蕩器振蕩混勻，然后以3000rpm離心5分鐘，棄上清。重復(fù)洗滌3次，以去除未結(jié)合的封閉液。

(3)孵育樣本：將稀釋好的樣本加入ELISA板中，每孔100-200μL，室溫避光孵育30分鐘。孵育前需用洗滌液洗滌ELISA板3次，每次3分鐘。

(4)孵育二抗：將稀釋好的酶標(biāo)二抗加入ELISA板中，每孔100-200μL，室溫避光孵育30分鐘。孵育前需用洗滌液洗滌ELISA板3次，每次3分鐘。

(5)顯色：將TMB底物加入ELISA板中，每孔100-200μL，室溫避光孵育10-20分鐘。顯色時間需根據(jù)樣本濃度和酶活性調(diào)整。

(6)終止：將終止液（如2MH2SO4）加入ELISA板中，每孔100-200μL，立即讀取吸光度值。終止液加入后需立即在酶聯(lián)免疫吸附儀上讀取A值，避免底物繼續(xù)反應(yīng)。

2.注意事項：

-洗滌一致性：每次洗滌需使用相同體積的洗滌液，并確保洗滌時間一致，以減少誤差。

-孵育條件：孵育溫度和時間需根據(jù)抗體說明書和實驗需求確定，并保持一致性。孵育過程中需避光，以防止底物光降解。

-空白對照：每個實驗均需設(shè)置空白對照（不含樣本和二抗的孔），用于校正背景吸收。

（二）流式細(xì)胞術(shù)操作

1.步驟：

(1)細(xì)胞染色：

-將細(xì)胞重懸于預(yù)冷PBS緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^6cells/mL。

-冰臺避光條件下，加入適量熒光標(biāo)記抗體（如CD3-PE，CD19-FITC），抗體濃度≤1μg/10^6細(xì)胞?；旌暇鶆蚝螅覝胤跤?5-30分鐘。

-孵育后需用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，每次500μL，1000rpm離心5分鐘，棄上清。

(2)上機(jī)：

-將洗滌后的細(xì)胞重懸于500-1000μL流式細(xì)胞術(shù)專用固定液（如paraformaldehyde）中，避光孵育4-8小時，以固定細(xì)胞。

-固定后需用流式細(xì)胞術(shù)專用透化液（如PBS/0.1%SDS）透化細(xì)胞膜，避光孵育15-30分鐘。透化液的使用需根據(jù)細(xì)胞類型和實驗需求調(diào)整。

-透化后需用流式細(xì)胞術(shù)專用封閉液（如PBS/1%BSA）封閉非特異性結(jié)合位點，避光孵育30分鐘。

(3)孵育二抗（如適用）：若需檢測細(xì)胞因子等可溶性蛋白，可在封閉后加入熒光標(biāo)記的二抗，避光孵育30分鐘。

(4)洗滌：用流式細(xì)胞術(shù)專用固定液或PBS洗滌細(xì)胞2次，每次500-1000μL，1000rpm離心5分鐘，棄上清。

(5)上機(jī)采集：將細(xì)胞重懸于流式細(xì)胞術(shù)專用染料（如PI或DAPI）中，避光孵育10分鐘，以對細(xì)胞進(jìn)行核染色。上機(jī)前需使用流式細(xì)胞術(shù)專用上樣液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^6cells/mL。設(shè)置門控，采集10000個事件。

2.質(zhì)控指標(biāo)：

-活細(xì)胞比例：通過設(shè)置門控去除死細(xì)胞（如使用PI染色，PI陽性細(xì)胞為死細(xì)胞），活細(xì)胞比例應(yīng)≥85%。

-熒光信號：檢測熒光信號是否飽和，若信號飽和需降低抗體濃度或增加細(xì)胞濃度。

-細(xì)胞活力：通過臺盼藍(lán)染色或流式細(xì)胞術(shù)專用染料檢測細(xì)胞活力，細(xì)胞活力應(yīng)≥95%。

（三）免疫熒光（IF）操作

1.步驟：

(1)組織切片：將石蠟包埋的組織切片置于60℃烘箱過夜，待石蠟完全軟化。使用切片機(jī)將組織切片成4μm厚度的切片，置于載玻片上，60℃烤片30分鐘。

(2)脫蠟：依次使用梯度乙醇（100%,95%,90%,80%,70%）脫水，每次浸泡5分鐘。最后用無水乙醇透明2次，每次5分鐘。

(3)固定：將切片置于4%多聚甲醛溶液中固定10分鐘，然后用PBS洗滌3次，每次5分鐘。

(4)封閉：將切片置于含5%BSA的PBS緩沖液中封閉1小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。

(5)孵育一抗：將稀釋好的第一抗體加入切片中，4℃孵育過夜。孵育前需用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。

(6)洗滌：用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。

(7)孵育二抗：將稀釋好的熒光標(biāo)記第二抗體加入切片中，37℃孵育1小時。孵育前需用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。

(8)洗滌：用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。

(9)核染色：將切片置于DAPI溶液中，避光孵育5分鐘，以對細(xì)胞核進(jìn)行染色。

(10)洗滌：用PBS洗滌切片2次，每次5分鐘。

(11)封片：將切片置于含有抗熒光淬滅封片劑的載玻片上，封片劑應(yīng)能增強(qiáng)熒光信號并減少淬滅。

2.注意事項：

-脫蠟徹底：脫蠟不徹底會導(dǎo)致背景高，影響結(jié)果判讀。可通過觀察切片是否完全透明判斷脫蠟是否徹底。

-抗體稀釋：抗體稀釋濃度需根據(jù)說明書和實驗需求確定，過高或過低都會影響結(jié)果判讀。

-熒光淬滅：封片劑的選擇對熒光信號的穩(wěn)定性至關(guān)重要，應(yīng)選擇高質(zhì)量的抗熒光淬滅封片劑。

-透鏡清洗：使用免疫熒光顯微鏡觀察時，需使用專用鏡頭紙和清潔液清洗物鏡和目鏡，避免污染。

五、結(jié)果分析與記錄

（一）數(shù)據(jù)分析

1.ELISA數(shù)據(jù)分析：

-繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通常使用4個對數(shù)濃度點，計算回歸方程（y=mx+b）。

-樣本定量：將樣本的OD值代入回歸方程，計算樣本的濃度。

-統(tǒng)計分析：使用GraphPadPrism等軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，如計算均值、標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)行ANOVA或t檢驗等。

2.流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析：

-設(shè)門：根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和熒光強(qiáng)度設(shè)置門控，去除背景噪聲和死細(xì)胞。

-計算比例：計算目標(biāo)細(xì)胞亞群占總細(xì)胞數(shù)的比例。

-統(tǒng)計分析：使用FlowJo等軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，如計算均值、標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)行ANOVA或t檢驗等。

3.免疫熒光數(shù)據(jù)分析：

-圖像采集：使用免疫熒光顯微鏡采集圖像，設(shè)置合適的曝光時間和增益。

-圖像處理：使用ImageJ等軟件進(jìn)行圖像處理，如調(diào)整對比度、亮度，去除背景等。

-定量分析：使用ImageJ等軟件進(jìn)行定量分析，如計算熒光強(qiáng)度、細(xì)胞數(shù)量等。

（二）記錄規(guī)范

1.實驗日志：每次實驗均需記錄實驗日志，包括實驗日期、實驗人員、實驗?zāi)康?、實驗方法、試劑批號、實驗結(jié)果、異常情況及處理措施等。實驗日志應(yīng)詳細(xì)記錄每一步的操作細(xì)節(jié)，如抗體稀釋濃度、孵育時間、洗滌次數(shù)等。

2.異常處理：實驗過程中若出現(xiàn)異常情況（如樣本污染、抗體失效等），需立即記錄并采取措施處理。處理措施應(yīng)詳細(xì)記錄，如更換試劑、重做實驗等。異常情況的處理過程和結(jié)果也應(yīng)記錄在實驗日志中。

3.數(shù)據(jù)備份：實驗數(shù)據(jù)應(yīng)定期備份，備份格式應(yīng)統(tǒng)一，并標(biāo)注備份日期。數(shù)據(jù)備份可防止數(shù)據(jù)丟失，確保實驗結(jié)果的完整性。

六、安全與廢棄物處理

（一）個人防護(hù)

1.個體防護(hù)裝備：在進(jìn)行免疫學(xué)實驗時，必須佩戴手套、護(hù)目鏡，操作生物樣本時穿實驗服。對于高風(fēng)險操作（如細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)等），需佩戴防護(hù)面罩和實驗帽。

2.個人衛(wèi)生：實驗前需洗手，實驗過程中避免用手接觸口、鼻、眼等部位。實驗結(jié)束后需徹底清洗雙手。

3.環(huán)境防護(hù)：實驗應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，以避免氣溶膠和飛沫污染。生物安全柜應(yīng)定期清潔和消毒，確保其正常運行。

（二）廢棄物分類

1.化學(xué)廢棄物：

-銳器：使用專用銳器盒收集針頭、刀片等銳器，避免刺傷。銳器盒裝滿后需按醫(yī)療廢物進(jìn)行處理。

-有機(jī)溶劑：使用專用容器收集有機(jī)溶劑（如乙醇、二甲苯等），避免泄漏。有機(jī)溶劑需按危險廢物進(jìn)行處理。

-廢棄培養(yǎng)基：廢棄培養(yǎng)基需先高壓滅菌后，方可倒入下水道。

2.生物廢棄物：

-細(xì)胞培養(yǎng)廢棄物：細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞裂解液等需先高壓滅菌后，方可倒入下水道。

-組織樣本：廢棄組織樣本需先高壓滅菌后，方可按醫(yī)療廢物進(jìn)行處理。

3.廢棄試劑：

-廢棄抗體、底物等試劑需先倒入含次氯酸鈉的溶液中，浸泡24小時以上，以殺滅病毒和細(xì)菌。處理后的溶液需按化學(xué)廢物進(jìn)行處理。

4.廢棄玻璃器皿：一次性使用的玻璃器皿（如移液管、吸管等）需按醫(yī)療廢物進(jìn)行處理?？芍貜?fù)使用的玻璃器皿需先清洗后，高壓滅菌。

七、總結(jié)

免疫學(xué)操作規(guī)程的規(guī)范化執(zhí)行是保障實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性的關(guān)鍵。通過標(biāo)準(zhǔn)化樣本處理、試劑配制、實驗操作及結(jié)果分析等環(huán)節(jié)，可顯著降低實驗誤差，提升實驗結(jié)果的可靠性。同時，嚴(yán)格的安全管理措施和廢棄物處理流程，不僅保障了操作人員的安全，也保護(hù)了環(huán)境。本總結(jié)提供了一套完整的免疫學(xué)操作規(guī)程，涵蓋了常用的免疫學(xué)技術(shù)，旨在為實驗室工作人員提供參考和指導(dǎo)。在實際操作中，應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯嶒灄l件，對規(guī)程進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和優(yōu)化。

一、免疫學(xué)操作規(guī)程概述

免疫學(xué)操作規(guī)程是指在免疫學(xué)實驗或臨床檢測中，為確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性及操作人員的安全而制定的一系列標(biāo)準(zhǔn)化流程。本總結(jié)旨在系統(tǒng)梳理免疫學(xué)常用操作規(guī)程的關(guān)鍵步驟、注意事項及質(zhì)量控制要點，涵蓋樣本處理、試劑準(zhǔn)備、實驗操作及結(jié)果分析等核心環(huán)節(jié)。

二、樣本處理與制備

（一）樣本類型與采集

1.血清樣本：靜脈采血，室溫靜置30分鐘，3000rpm離心10分鐘分離。

2.唾液樣本：晨起收集，4℃保存，12000rpm離心10分鐘取上清。

3.細(xì)胞樣本：外周血分離PBMC，或組織切片經(jīng)固定-脫水處理。

（二）樣本保存與運輸

1.低溫保存：液體樣本-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。

2.運輸要求：使用保溫箱，樣本標(biāo)識清晰，運輸時間≤4小時。

三、試劑準(zhǔn)備與校準(zhǔn)

（一）試劑配制

1.依說明書比例稀釋抗體或酶標(biāo)液，使用去離子水或無菌水。

2.pH調(diào)節(jié)：使用Tris-HCl或PBS緩沖液，確保pH值在6.0-7.5。

（二）儀器校準(zhǔn)

1.酶標(biāo)儀：每日校準(zhǔn)吸光度（A）值，使用空白對照調(diào)零。

2.移液器：定期校準(zhǔn)量程，誤差≤±2%。

四、免疫學(xué)實驗操作

（一）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

1.步驟：

(1)包被：96孔板加入抗體，4℃過夜。

(2)封閉：TBST洗板3次，加入封閉液，37℃孵育1小時。

(3)孵育：依次加入樣本、酶標(biāo)二抗，室溫避光30分鐘。

(4)顯色：TMB顯色10-20分鐘，終止液終止反應(yīng)。

2.注意事項：

-每步孵育后需用TBST洗滌，避免交叉污染。

-使用酶標(biāo)板振蕩器混勻樣本。

（二）流式細(xì)胞術(shù)操作

1.步驟：

(1)細(xì)胞染色：冰臺避光染色，抗體濃度≤1μg/10^6細(xì)胞。

(2)上機(jī)：加入FACS溶血素，流式管裝量100-200μL。

(3)數(shù)據(jù)采集：設(shè)置門控，采集10000個事件。

2.質(zhì)控指標(biāo)：

-活細(xì)胞比例≥85%，熒光信號無飽和。

五、結(jié)果分析與記錄

（一）數(shù)據(jù)分析

1.ELISA：使用GraphPadPrism計算OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.流式：分析細(xì)胞亞群比例，統(tǒng)計學(xué)方法使用ANOVA或t檢驗。

（二）記錄規(guī)范

1.實驗日志：記錄試劑批號、操作人、環(huán)境溫度等關(guān)鍵參數(shù)。

2.異常處理：記錄實驗偏差及糾正措施，如樣本污染需重做實驗。

六、安全與廢棄物處理

（一）個人防護(hù)

1.必須佩戴手套、護(hù)目鏡，操作生物樣本時穿實驗服。

2.使用生物安全柜處理氣溶膠高風(fēng)險操作。

（二）廢棄物分類

1.化學(xué)廢棄物：銳器放入專用銳器盒，有機(jī)溶劑單獨收集。

2.生物廢棄物：高壓滅菌后按醫(yī)療廢物處理。

七、總結(jié)

免疫學(xué)操作規(guī)程的規(guī)范化執(zhí)行是保障實驗質(zhì)量的基礎(chǔ)。通過標(biāo)準(zhǔn)化樣本處理、試劑配制及實驗流程，可降低誤差并提升結(jié)果可靠性。同時，嚴(yán)格的安全管理措施需貫穿整個實驗過程，確保操作人員與環(huán)境安全。

一、免疫學(xué)操作規(guī)程概述

免疫學(xué)操作規(guī)程是指在免疫學(xué)實驗或臨床檢測中，為確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性及操作人員的安全而制定的一系列標(biāo)準(zhǔn)化流程。本總結(jié)旨在系統(tǒng)梳理免疫學(xué)常用操作規(guī)程的關(guān)鍵步驟、注意事項及質(zhì)量控制要點，涵蓋樣本處理、試劑準(zhǔn)備、實驗操作及結(jié)果分析等核心環(huán)節(jié)。本規(guī)程的制定基于國內(nèi)外權(quán)威實驗室的實踐經(jīng)驗，并結(jié)合了常見的免疫學(xué)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）、免疫熒光（IF）等，旨在為實驗室工作人員提供一套完整且實用的操作指南。

二、樣本處理與制備

（一）樣本類型與采集

1.血清樣本：

-采集方法：采用靜脈采血法，推薦使用含有肝素或EDTA的抗凝管（根據(jù)后續(xù)實驗需求選擇）。采血量需滿足實驗需求，通常為3-5mL。采血后需在室溫下靜置30分鐘至1小時，使血液充分凝固，避免溶血。

-分離方法：將采血管置于水平面上，以3000rpm離心10分鐘，分離血清。血清應(yīng)盡量避免與管壁接觸，小心吸取上層澄清液體，避免吸到下層血細(xì)胞。

-處理方法：吸取的血清可立即用于實驗，或分裝后-20℃或-80℃凍存。避免反復(fù)凍融，建議首次凍存前進(jìn)行過速冷凍，以減少冰晶形成對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。

2.唾液樣本：

-采集方法：建議在晨起空腹?fàn)顟B(tài)下采集，使用無菌唾液收集管或吸管。指導(dǎo)受試者充分漱口（使用無菌水），然后含住收集管緩慢吐出唾液，直至達(dá)到預(yù)定體積（通常為1-2mL）。

-處理方法：收集后的唾液樣本需在4℃條件下保存，12000rpm離心10分鐘，取上清液用于實驗。若需長期保存，應(yīng)先分裝后-20℃凍存。

3.細(xì)胞樣本：

-外周血單個核細(xì)胞（PBMC）分離：

(1)抗凝采血：使用肝素抗凝管采集外周血（采血量根據(jù)后續(xù)實驗需求確定）。

(2)Ficoll-Paque密度梯度離心：將外周血與等體積Ficoll-Paque溶液（密度1.077g/mL）混合后，小心緩慢倒入專用分離管中，3000rpm離心30分鐘。PBMC位于血漿與Ficoll層之間，用移液器小心吸取PBMC層。

(3)洗滌：將PBMC重懸于預(yù)冷PBS緩沖液中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。重復(fù)洗滌2-3次，直至上清液無色透明。

-組織樣本處理：

(1)固定：新鮮組織立即置于4%多聚甲醛溶液中固定4-6小時。

(2)脫水：依次使用梯度乙醇（30%,50%,70%,90%,100%）脫水，每次浸泡30分鐘。

(3)透明：將組織置于二甲苯中透明2次，每次30分鐘。

(4)浸蠟：逐級加入石蠟（50%-60%石蠟：二甲苯=1:1，60%-70%石蠟：二甲苯=1:1，70%-80%石蠟：二甲苯=1:1，80%-90%石蠟：二甲苯=1:1，90%-100%石蠟：二甲苯=1:1，100%石蠟），每次浸蠟60分鐘。

(4)包埋：將組織塊放入預(yù)熱的石蠟?zāi)＞咧校糜?0℃烘箱過夜，待石蠟完全凝固。

（二）樣本保存與運輸

1.低溫保存：

-液體樣本：血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清等液體樣本，若短期使用（1周內(nèi)），可4℃保存；若長期保存（數(shù)月至數(shù)年），需-20℃或-80℃凍存。分裝保存可減少反復(fù)凍融對樣本造成的損傷。在凍存前應(yīng)使用預(yù)冷管吸取樣本，避免樣本在取用過程中發(fā)生溫度變化。

-細(xì)胞樣本：PBMC等細(xì)胞樣本應(yīng)盡快處理，若需保存，建議使用細(xì)胞凍存液（含10%FBS和10%DMSO）重懸后，分裝至凍存管，-80℃凍存。凍存時需緩慢降溫，并可在-20℃過夜再轉(zhuǎn)移至-80℃。

2.運輸要求：

-樣本標(biāo)識：所有樣本均需貼上清晰標(biāo)簽，包含樣本編號、采集日期、樣本類型、受試者信息（如適用）等。

-保溫運輸：對于需在4℃保存的樣本，應(yīng)使用帶冰袋的保溫箱運輸，確保運輸過程中溫度穩(wěn)定。運輸時間盡量控制在4小時內(nèi)，若距離較遠(yuǎn)，建議使用冷藏車或干冰（-80℃）進(jìn)行運輸。

-安全運輸：對于生物樣本，應(yīng)遵守相關(guān)生物安全運輸規(guī)定，使用符合標(biāo)準(zhǔn)的生物樣本運輸箱，避免樣本泄漏造成環(huán)境污染。

三、試劑準(zhǔn)備與校準(zhǔn)

（一）試劑配制

1.抗體稀釋：

-根據(jù)抗體說明書推薦的濃度范圍，使用PBS或Tris-HCl緩沖液進(jìn)行稀釋。例如，ELISA檢測抗體通常使用100-200ng/mL的濃度。稀釋時需使用移液器精確量取抗體和緩沖液，并充分混勻。

-對于直接免疫熒光染色，抗體濃度通常為0.5-1μg/mL。稀釋后需在4℃避光孵育30分鐘，使抗體充分結(jié)合。

2.酶標(biāo)二抗稀釋：

-酶標(biāo)二抗（如HRP或AP標(biāo)記的二抗）的稀釋濃度需根據(jù)說明書和實際實驗需求確定，通常為1-5μg/mL。稀釋后需在室溫避光孵育30分鐘。

3.底物配制：

-TMB顯色液：使用無水乙醇或甲醇配制TMB底物，濃度通常為3-5mg/mL。配制后需避光保存，避免光降解。

-DAB顯色液：使用去離子水配制DAB底物，濃度通常為0.1-0.3mg/mL。配制后需立即使用，避免久置后氧化失效。

（二）儀器校準(zhǔn)

1.酶聯(lián)免疫吸附儀（ELISAReader）：

-每日校準(zhǔn)：使用空白對照（不含樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的孔）校準(zhǔn)吸光度（A）值，確保讀數(shù)在0-1.0范圍內(nèi)。若讀數(shù)超出范圍，需調(diào)整儀器增益或更換空白對照。

-波長校準(zhǔn)：使用已知波長的標(biāo)準(zhǔn)品（如純凈水在260nm處的A值）校準(zhǔn)儀器波長，確保讀數(shù)準(zhǔn)確。

2.移液器：

-定期校準(zhǔn)：使用移液器校準(zhǔn)儀對移液器進(jìn)行校準(zhǔn)，確保其量程誤差在±2%以內(nèi)。校準(zhǔn)頻率建議為每月一次，高精度操作時需增加校準(zhǔn)次數(shù)。

-校準(zhǔn)方法：使用已知密度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（如去離子水）進(jìn)行校準(zhǔn)，記錄每次校準(zhǔn)的結(jié)果，并對超出誤差范圍的移液器進(jìn)行維修或更換。

3.電子天平：

-定期校準(zhǔn)：使用標(biāo)準(zhǔn)砝碼對電子天平進(jìn)行校準(zhǔn)，確保其讀數(shù)誤差在±0.0001g以內(nèi)。校準(zhǔn)頻率建議為每周一次，高精度稱量時需增加校準(zhǔn)次數(shù)。

-校準(zhǔn)方法：將標(biāo)準(zhǔn)砝碼依次放置于天平上，記錄每次校準(zhǔn)的結(jié)果，并對超出誤差范圍的天平進(jìn)行維修或更換。

四、免疫學(xué)實驗操作

（一）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

1.步驟：

(1)包被：

-將稀釋好的抗體加入ELISA板中，每孔100-200μL，4℃過夜包被。包被前需用洗滌液（如TBST）洗滌ELISA板3次，每次3分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。

-包被后需用封閉液（如5%BSA或skimmilk）封閉非特異性結(jié)合位點，37℃孵育1小時。封閉前需用洗滌液洗滌ELISA板3次，每次3分鐘。

(2)洗滌：每次加入洗滌液后，需使用ELISA板振蕩器振蕩混勻，然后以3000rpm離心5分鐘，棄上清。重復(fù)洗滌3次，以去除未結(jié)合的封閉液。

(3)孵育樣本：將稀釋好的樣本加入ELISA板中，每孔100-200μL，室溫避光孵育30分鐘。孵育前需用洗滌液洗滌ELISA板3次，每次3分鐘。

(4)孵育二抗：將稀釋好的酶標(biāo)二抗加入ELISA板中，每孔100-200μL，室溫避光孵育30分鐘。孵育前需用洗滌液洗滌ELISA板3次，每次3分鐘。

(5)顯色：將TMB底物加入ELISA板中，每孔100-200μL，室溫避光孵育10-20分鐘。顯色時間需根據(jù)樣本濃度和酶活性調(diào)整。

(6)終止：將終止液（如2MH2SO4）加入ELISA板中，每孔100-200μL，立即讀取吸光度值。終止液加入后需立即在酶聯(lián)免疫吸附儀上讀取A值，避免底物繼續(xù)反應(yīng)。

2.注意事項：

-洗滌一致性：每次洗滌需使用相同體積的洗滌液，并確保洗滌時間一致，以減少誤差。

-孵育條件：孵育溫度和時間需根據(jù)抗體說明書和實驗需求確定，并保持一致性。孵育過程中需避光，以防止底物光降解。

-空白對照：每個實驗均需設(shè)置空白對照（不含樣本和二抗的孔），用于校正背景吸收。

（二）流式細(xì)胞術(shù)操作

1.步驟：

(1)細(xì)胞染色：

-將細(xì)胞重懸于預(yù)冷PBS緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^6cells/mL。

-冰臺避光條件下，加入適量熒光標(biāo)記抗體（如CD3-PE，CD19-FITC），抗體濃度≤1μg/10^6細(xì)胞。混合均勻后，室溫孵育15-30分鐘。

-孵育后需用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，每次500μL，1000rpm離心5分鐘，棄上清。

(2)上機(jī)：

-將洗滌后的細(xì)胞重懸于500-1000μL流式細(xì)胞術(shù)專用固定液（如paraformaldehyde）中，避光孵育4-8小時，以固定細(xì)胞。

-固定后需用流式細(xì)胞術(shù)專用透化液（如PBS/0.1%SDS）透化細(xì)胞膜，避光孵育15-30分鐘。透化液的使用需根據(jù)細(xì)胞類型和實驗需求調(diào)整。

-透化后需用流式細(xì)胞術(shù)專用封閉液（如PBS/1%BSA）封閉非特異性結(jié)合位點，避光孵育30分鐘。

(3)孵育二抗（如適用）：若需檢測細(xì)胞因子等可溶性蛋白，可在封閉后加入熒光標(biāo)記的二抗，避光孵育30分鐘。

(4)洗滌：用流式細(xì)胞術(shù)專用固定液或PBS洗滌細(xì)胞2次，每次500-1000μL，1000rpm離心5分鐘，棄上清。

(5)上機(jī)采集：將細(xì)胞重懸于流式細(xì)胞術(shù)專用染料（如PI或DAPI）中，避光孵育10分鐘，以對細(xì)胞進(jìn)行核染色。上機(jī)前需使用流式細(xì)胞術(shù)專用上樣液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^6cells/mL。設(shè)置門控，采集10000個事件。

2.質(zhì)控指標(biāo)：

-活細(xì)胞比例：通過設(shè)置門控去除死細(xì)胞（如使用PI染色，PI陽性細(xì)胞為死細(xì)胞），活細(xì)胞比例應(yīng)≥85%。

-熒光信號：檢測熒光信號是否飽和，若信號飽和需降低抗體濃度或增加細(xì)胞濃度。

-細(xì)胞活力：通過臺盼藍(lán)染色或流式細(xì)胞術(shù)專用染料檢測細(xì)胞活力，細(xì)胞活力應(yīng)≥95%。

（三）免疫熒光（IF）操作

1.步驟：

(1)組織切片：將石蠟包埋的組織切片置于60℃烘箱過夜，待石蠟完全軟化。使用切片機(jī)將組織切片成4μm厚度的切片，置于載玻片上，60℃烤片30分鐘。

(2)脫蠟：依次使用梯度乙醇（100%,95%,90%,80%,70%）脫水，每次浸泡5分鐘。最后用無水乙醇透明2次，每次5分鐘。

(3)固定：將切片置于4%多聚甲醛溶液中固定10分鐘，然后用PBS洗滌3次，每次5分鐘。

(4)封閉：將切片置于含5%BSA的PBS緩沖液中封閉1小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。

(5)孵育一抗：將稀釋好的第一抗體加入切片中，4℃孵育過夜。孵育前需用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。

(6)洗滌：用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。

(7)孵育二抗：將稀釋好的熒光標(biāo)記第二抗體加入切片中，37℃孵育1小時。孵育前需用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。

(8)洗滌：用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。

(9)核染色：將切片置于DAPI溶液中，避光孵育5分鐘，以對細(xì)胞核進(jìn)行染色。

(10)洗滌：用PBS洗滌切片2次，每次5分鐘。

(11)封片：將切片置于含有抗熒光淬滅封片劑的載玻片上，封片劑應(yīng)能增強(qiáng)熒光信號并減少淬滅。

2.注意事項：

-脫蠟徹底：脫蠟不徹底會導(dǎo)致背景高，影響結(jié)果判讀。可通過觀察切片是否完全透明判斷脫蠟是否徹底。

-抗體稀釋：抗體稀釋濃度需根據(jù)說明書和實驗需求確定，過高或過低都會影響結(jié)果判讀。

-熒光淬滅：封片劑的選擇對熒光信號的穩(wěn)定性至關(guān)重要，應(yīng)選擇高質(zhì)量的抗熒光淬滅封片劑。

-透鏡清洗：使用免疫熒光顯微鏡觀察時，需使用專用鏡頭紙和清潔液清洗物鏡和目鏡，