基于雞蛋殼膜的生物敷料制備及促傷口愈合效能解析一、引言1.1研究背景與意義皮膚作為人體最大的器官，是抵御外界環(huán)境侵害的重要屏障，一旦皮膚受損，傷口愈合便成為維持機(jī)體完整性和功能的關(guān)鍵生理過程。傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜且有序的生物學(xué)過程，涉及止血、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與遷移、組織重塑等多個(gè)階段，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都可能導(dǎo)致傷口愈合延遲、感染甚至不愈合等問題，給患者帶來極大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年有大量患者遭受各種類型的傷口困擾，如燒傷、創(chuàng)傷、糖尿病足潰瘍、壓瘡等，這些傷口不僅影響患者的生活質(zhì)量，還對(duì)醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)造成了沉重的壓力。在傷口治療過程中，醫(yī)用敷料起著至關(guān)重要的作用。理想的醫(yī)用敷料應(yīng)具備良好的生物相容性、透氣性、吸水性、抗菌性和促進(jìn)細(xì)胞增殖與組織修復(fù)的能力，能夠?yàn)閭谟咸峁┮粋€(gè)濕潤(rùn)、清潔、低氧且適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，從而加速傷口愈合進(jìn)程，減少疤痕形成。傳統(tǒng)的醫(yī)用敷料如棉紗布等，雖然具有一定的吸收滲出液和保護(hù)傷口的作用，但存在易粘連傷口、透氣性差、不抗菌等缺點(diǎn)，容易導(dǎo)致傷口感染和愈合延遲。隨著材料科學(xué)和生物技術(shù)的不斷發(fā)展，新型生物敷料應(yīng)運(yùn)而生，如膠原蛋白敷料、殼聚糖敷料、海藻酸鹽敷料等，這些敷料在一定程度上克服了傳統(tǒng)敷料的不足，但仍存在一些局限性，如成本高、來源有限、力學(xué)性能差等，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，開發(fā)一種來源廣泛、成本低廉、性能優(yōu)良的新型生物敷料具有重要的臨床意義和市場(chǎng)需求。雞蛋殼膜作為雞蛋加工過程中的副產(chǎn)物，來源極其豐富。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年雞蛋產(chǎn)量數(shù)以億噸計(jì)，這意味著產(chǎn)生了大量的雞蛋殼膜廢棄物。若能將這些廢棄的雞蛋殼膜有效利用，不僅可以減少環(huán)境污染，還能實(shí)現(xiàn)資源的循環(huán)利用。從結(jié)構(gòu)上看，雞蛋殼膜主要由蛋白質(zhì)和多糖組成，這種獨(dú)特的成分賦予了它諸多優(yōu)良特性。在生物相容性方面，雞蛋殼膜與人體組織具有良好的親和性，不會(huì)引起明顯的免疫排斥反應(yīng)，這為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，雞蛋殼膜還具有一定的生物降解性，在體內(nèi)能夠逐漸分解，不會(huì)對(duì)人體造成長(zhǎng)期的負(fù)擔(dān)。此外，雞蛋殼膜中含有多種生物活性成分，如膠原蛋白、彈性蛋白、氨基酸等，這些成分在促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和組織修復(fù)等方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，膠原蛋白可以為細(xì)胞提供生長(zhǎng)支架，促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖；彈性蛋白能夠賦予組織彈性，有助于傷口的彈性恢復(fù)；氨基酸則是細(xì)胞代謝和合成蛋白質(zhì)的重要原料，能夠?yàn)閭谟咸峁┍匾臓I(yíng)養(yǎng)支持?；陔u蛋殼膜的這些優(yōu)勢(shì)，將其制備成生物敷料具有廣闊的應(yīng)用前景。通過對(duì)雞蛋殼膜進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砗透男裕梢愿纳破淞W(xué)性能、吸水性、抗菌性等，使其滿足不同類型傷口的治療需求。例如，采用靜電紡絲技術(shù)可以制備出具有納米纖維結(jié)構(gòu)的雞蛋殼膜敷料，這種敷料具有高比表面積和良好的透氣性，能夠促進(jìn)傷口的氣體交換和水分蒸發(fā)，有利于傷口愈合。此外，還可以將雞蛋殼膜與其他功能性材料復(fù)合，如抗菌劑、生長(zhǎng)因子等，進(jìn)一步增強(qiáng)敷料的性能。將銀納米粒子負(fù)載到雞蛋殼膜上，制備出具有抗菌性能的復(fù)合敷料，能夠有效抑制傷口感染，促進(jìn)傷口愈合；將生長(zhǎng)因子與雞蛋殼膜結(jié)合，制成具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織修復(fù)功能的敷料，可加速傷口愈合進(jìn)程，減少疤痕形成。本研究旨在深入探究基于雞蛋殼膜的生物敷料的制備方法及其傷口愈合功能，通過對(duì)雞蛋殼膜進(jìn)行提取、改性和復(fù)合等處理，制備出三種具有不同性能特點(diǎn)的生物敷料，并系統(tǒng)研究它們?cè)隗w外和體內(nèi)的傷口愈合效果。這不僅有助于豐富生物敷料的種類和性能，為傷口治療提供更多的選擇，還能為雞蛋殼膜的綜合利用開辟新的途徑，實(shí)現(xiàn)資源的高效利用和環(huán)境保護(hù)的雙重目標(biāo)。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，雞蛋殼膜因其獨(dú)特的生物相容性和生物降解性，作為生物敷料的研究逐漸受到關(guān)注。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在雞蛋殼膜生物敷料的制備方法、性能研究等方面開展了一系列工作。在制備方法上，物理法、化學(xué)法和生物法是常見的手段。物理法中，機(jī)械粉碎和熱分離法可用于處理雞蛋殼膜，但存在效率低下和成本較高的問題?；瘜W(xué)法雖能實(shí)現(xiàn)高效分離，卻因使用化學(xué)試劑易造成環(huán)境污染。生物法則借助酶分解雞蛋殼膜，然而面臨反應(yīng)條件溫和、酶成本高等挑戰(zhàn)。為了克服這些問題，有研究提出基于超聲波輔助的物理化學(xué)分離方法，結(jié)合超聲波的空化效應(yīng)和化學(xué)試劑的作用，提高雞蛋殼膜的分離效率，同時(shí)減少對(duì)環(huán)境的影響。還有研究采用3-巰基乙醇處理法提取可溶性雞蛋殼膜蛋白，用于后續(xù)靜電紡絲制備敷料，以解決雞蛋殼膜質(zhì)地脆、面積小等問題。在性能研究方面，雞蛋殼膜生物敷料展現(xiàn)出多方面的優(yōu)勢(shì)。其生物相容性優(yōu)良，對(duì)生物體無毒無害，且能夠在體內(nèi)自然降解，為傷口愈合提供了良好的基礎(chǔ)條件。在促進(jìn)傷口愈合方面，雞蛋殼膜中含有的膠原蛋白、彈性蛋白、氨基酸等生物活性成分發(fā)揮了重要作用。膠原蛋白可以為細(xì)胞提供生長(zhǎng)支架，促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖；彈性蛋白賦予組織彈性，有助于傷口的彈性恢復(fù)；氨基酸則為細(xì)胞代謝和合成蛋白質(zhì)提供必要的原料，促進(jìn)傷口愈合。臨床研究表明，將雞蛋殼膜用于治療褥瘡、口腔潰瘍、外傷性鼓膜穿孔等傷口，取得了較好的效果，能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和創(chuàng)面愈合。此外，雞蛋殼膜還具有一定的抗菌性能，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見致病菌有抑制作用，這為預(yù)防和控制傷口感染提供了保障。盡管雞蛋殼膜生物敷料的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足。目前的制備方法大多較為復(fù)雜，成本較高，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。雞蛋殼膜生物敷料的力學(xué)性能較差，在實(shí)際應(yīng)用中容易破損，影響其使用效果。其抗菌性能和促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制尚未完全明確，需要進(jìn)一步深入研究。在敷料的穩(wěn)定性和保存方面也存在一定問題，限制了其在臨床和市場(chǎng)上的廣泛應(yīng)用。1.3研究?jī)?nèi)容與創(chuàng)新點(diǎn)本研究聚焦于基于雞蛋殼膜的生物敷料，深入探究其制備工藝、性能特點(diǎn)以及在傷口愈合方面的功能，具體研究?jī)?nèi)容如下：雞蛋殼膜的提取與表征：采用優(yōu)化的超聲波輔助物理化學(xué)分離方法，從廢棄雞蛋殼中高效提取雞蛋殼膜。運(yùn)用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、掃描電子顯微鏡（SEM）、X射線衍射（XRD）等先進(jìn)技術(shù)，對(duì)提取的雞蛋殼膜進(jìn)行全面的結(jié)構(gòu)與形貌表征，明確其化學(xué)組成、微觀結(jié)構(gòu)和結(jié)晶特性，為后續(xù)敷料制備提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。三種生物敷料的制備：雞蛋殼膜/殼聚糖復(fù)合敷料：通過溶液共混法，將提取的雞蛋殼膜與殼聚糖均勻混合，制備雞蛋殼膜/殼聚糖復(fù)合敷料。系統(tǒng)研究不同配比（如雞蛋殼膜與殼聚糖質(zhì)量比為1:1、1:2、2:1等）對(duì)復(fù)合敷料性能的影響，確定最佳配方。雞蛋殼膜/納米銀復(fù)合敷料：利用化學(xué)還原法，將納米銀粒子負(fù)載到雞蛋殼膜上，制備雞蛋殼膜/納米銀復(fù)合敷料。探究納米銀負(fù)載量（如0.5%、1%、1.5%等）對(duì)敷料抗菌性能和生物相容性的影響，優(yōu)化制備工藝。雞蛋殼膜/生長(zhǎng)因子復(fù)合敷料：采用物理吸附法，將生長(zhǎng)因子（如表皮生長(zhǎng)因子EGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF等）負(fù)載到雞蛋殼膜上，制備雞蛋殼膜/生長(zhǎng)因子復(fù)合敷料。研究生長(zhǎng)因子的負(fù)載方式（直接吸附、共價(jià)結(jié)合等）和負(fù)載量對(duì)敷料促進(jìn)細(xì)胞增殖與組織修復(fù)能力的影響。生物敷料的性能表征：對(duì)三種制備的生物敷料進(jìn)行多方面性能測(cè)試。通過拉伸實(shí)驗(yàn)測(cè)定敷料的力學(xué)性能，包括拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率等；采用稱重法測(cè)試敷料的吸水性和保水性；利用抑菌圈實(shí)驗(yàn)、最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定等方法評(píng)估敷料的抗菌性能，針對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見致病菌進(jìn)行測(cè)試；運(yùn)用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（如MTT法）、細(xì)胞黏附和增殖實(shí)驗(yàn)等，評(píng)價(jià)敷料的生物相容性和對(duì)細(xì)胞行為的影響。生物敷料的傷口愈合功能研究：建立小鼠皮膚創(chuàng)傷模型，將三種生物敷料分別應(yīng)用于傷口處，以空白對(duì)照組和市售敷料組作為對(duì)照。通過觀察傷口愈合過程中的大體形態(tài)變化，定期測(cè)量傷口面積并計(jì)算愈合率；在不同時(shí)間點(diǎn)取材，進(jìn)行組織學(xué)分析，包括蘇木精-伊紅（HE）染色觀察組織修復(fù)情況、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子（如TGF-β、VEGF等）的表達(dá)，深入研究敷料對(duì)傷口愈合各階段（止血、炎癥、增殖、重塑）的影響機(jī)制。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：原料創(chuàng)新：充分利用廢棄雞蛋殼膜這一豐富的生物資源，實(shí)現(xiàn)廢棄物的高值化利用，既降低了敷料成本，又符合環(huán)保理念，為生物敷料的原料選擇提供了新的思路。復(fù)合方式創(chuàng)新：采用多種創(chuàng)新的復(fù)合方式，將雞蛋殼膜與殼聚糖、納米銀、生長(zhǎng)因子等功能性成分相結(jié)合，制備出具有多功能協(xié)同效應(yīng)的復(fù)合敷料。這種復(fù)合方式不僅能夠充分發(fā)揮各成分的優(yōu)勢(shì)，還能克服單一成分的局限性，為生物敷料的性能提升提供了新的途徑。作用機(jī)制研究創(chuàng)新：深入探究三種基于雞蛋殼膜的生物敷料在傷口愈合過程中的作用機(jī)制，從細(xì)胞和分子層面揭示其促進(jìn)傷口愈合的內(nèi)在規(guī)律。通過多維度的實(shí)驗(yàn)分析，全面評(píng)估敷料對(duì)傷口愈合各階段關(guān)鍵指標(biāo)的影響，為生物敷料的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供更科學(xué)的理論依據(jù)。二、基于雞蛋殼膜的生物敷料制備原理與方法2.1材料與儀器本實(shí)驗(yàn)所需的雞蛋殼膜取自當(dāng)?shù)卮笮碗u蛋加工廠，這些雞蛋殼膜均來源于新鮮雞蛋，在收集后立即進(jìn)行初步清洗，去除表面雜質(zhì)，并于-20℃冷凍保存，以確保其生物活性。在實(shí)驗(yàn)前，將冷凍的雞蛋殼膜取出，置于室溫下解凍備用。除雞蛋殼膜外，還選用殼聚糖作為復(fù)合敷料的重要成分。殼聚糖購(gòu)自知名生物材料公司，脫乙酰度≥95%，分子量為100-300kDa。殼聚糖具有良好的生物相容性、抗菌性和可降解性，能與雞蛋殼膜協(xié)同作用，提升敷料的綜合性能。納米銀粒子采用化學(xué)還原法自制，通過嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，確保納米銀粒子粒徑均勻，平均粒徑約為20-50nm。生長(zhǎng)因子選擇表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），均購(gòu)自專業(yè)生物試劑公司，純度≥98%，其在促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和組織修復(fù)方面具有重要作用。此外，實(shí)驗(yàn)中還用到冰醋酸、氫氧化鈉、乙醇、丙酮等化學(xué)試劑，均為分析純，用于溶液配制、材料處理等過程。實(shí)驗(yàn)過程中使用多種儀器設(shè)備。傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，型號(hào)：ThermoFisherScientificNicoletiS50）用于分析雞蛋殼膜及敷料的化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過檢測(cè)樣品對(duì)紅外光的吸收情況，確定其化學(xué)鍵和官能團(tuán)組成。掃描電子顯微鏡（SEM，型號(hào)：HitachiSU8010）用于觀察材料的微觀形貌，加速電壓為5-15kV，能夠清晰呈現(xiàn)材料的表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征。X射線衍射儀（XRD，型號(hào)：BrukerD8Advance）用于分析材料的結(jié)晶特性，通過測(cè)量樣品對(duì)X射線的衍射強(qiáng)度，確定其晶體結(jié)構(gòu)和結(jié)晶度。電子天平（精度0.0001g，型號(hào)：SartoriusBT25S）用于準(zhǔn)確稱量各種實(shí)驗(yàn)材料，確保實(shí)驗(yàn)配方的準(zhǔn)確性。恒溫磁力攪拌器（型號(hào)：IKARCTbasic）用于溶液的攪拌混合，提供穩(wěn)定的攪拌速度和溫度控制。真空干燥箱（型號(hào)：DZF-6020）用于材料的干燥處理，在低溫、真空環(huán)境下去除材料中的水分和溶劑，保證材料的質(zhì)量和性能。2.2三種生物敷料制備原理2.2.1復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料原理復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料的制備原理基于膠原蛋白獨(dú)特的生物學(xué)特性以及其與雞蛋殼膜之間的協(xié)同作用。膠原蛋白作為一種廣泛存在于動(dòng)物結(jié)締組織中的生物高分子，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白。其分子呈細(xì)長(zhǎng)的棒狀，相對(duì)分子質(zhì)量從約2kd至300kd不等。由于其特殊的結(jié)構(gòu)，膠原蛋白具有良好的生物相容性，能夠與人體組織和諧共處，不會(huì)引發(fā)明顯的免疫排斥反應(yīng)。同時(shí)，它還具備可生物降解性，在體內(nèi)可逐漸被分解代謝，為組織修復(fù)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。更為重要的是，膠原蛋白具有出色的生物活性，對(duì)皮膚表面的蛋白質(zhì)分子具有較大的親和力，能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和分化，在傷口愈合過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。雞蛋殼膜主要由蛋白質(zhì)和多糖組成，其中也含有一定量的膠原蛋白等生物活性成分。將外源性的膠原蛋白與雞蛋殼膜復(fù)合，旨在充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)性能的互補(bǔ)和提升。在復(fù)合過程中，利用物理或化學(xué)方法，使膠原蛋白分子與雞蛋殼膜中的蛋白質(zhì)、多糖等成分通過氫鍵、靜電作用或共價(jià)鍵等相互作用方式結(jié)合在一起。通過控制溶液的pH值、離子強(qiáng)度以及添加交聯(lián)劑等手段，促進(jìn)膠原蛋白與雞蛋殼膜之間的交聯(lián)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)。這種復(fù)合結(jié)構(gòu)不僅增強(qiáng)了敷料的力學(xué)性能，使其在使用過程中更具穩(wěn)定性和耐用性，還進(jìn)一步提高了敷料的生物活性。膠原蛋白為細(xì)胞提供了豐富的黏附位點(diǎn)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等在敷料表面的黏附和生長(zhǎng)，加速傷口愈合進(jìn)程；雞蛋殼膜中的生物活性成分則與膠原蛋白協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝活動(dòng)，促進(jìn)組織的修復(fù)和再生。復(fù)合后的敷料還能夠改善其吸水性和保水性，為傷口創(chuàng)造一個(gè)濕潤(rùn)的愈合環(huán)境，有利于細(xì)胞的遷移和增殖，同時(shí)防止傷口干燥結(jié)痂，減少疤痕形成。2.2.2靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料原理靜電紡絲是一種能夠高效制備納米級(jí)纖維的先進(jìn)技術(shù)，其原理基于高壓靜電場(chǎng)對(duì)高分子溶液或熔體的作用。在靜電紡絲過程中，首先將溶解有雞蛋殼膜蛋白的溶液裝入帶有細(xì)針頭的注射器中，將其連接到高壓電源的正極，而收集裝置（如金屬平板或滾筒）則連接到負(fù)極，形成一個(gè)高壓靜電場(chǎng)。當(dāng)施加的電壓達(dá)到一定程度時(shí)，溶液在針頭處受到電場(chǎng)力的作用，克服表面張力，形成泰勒錐。隨著電場(chǎng)力的進(jìn)一步增大，溶液從泰勒錐頂端噴射出細(xì)流，在噴射過程中，溶劑迅速揮發(fā)，溶質(zhì)則固化形成納米纖維，并在收集裝置上沉積，最終形成復(fù)合納米膜。在制備含雞蛋殼膜蛋白復(fù)合納米膜時(shí)，通過精確控制靜電紡絲的參數(shù)，如溶液濃度、電壓、流速、噴頭與收集器之間的距離等，可以有效調(diào)控納米纖維的直徑、形態(tài)和取向，進(jìn)而影響復(fù)合納米膜的性能。較高的溶液濃度通常會(huì)導(dǎo)致納米纖維直徑增大，因?yàn)槿芤褐腥苜|(zhì)分子的數(shù)量增加，在固化過程中更容易相互聚集。而增加電壓會(huì)使電場(chǎng)力增強(qiáng)，促進(jìn)溶液的噴射和拉伸，從而使納米纖維直徑減小。流速的變化會(huì)影響溶液的供給速度，流速過快可能導(dǎo)致納米纖維粗細(xì)不均，甚至出現(xiàn)串珠狀結(jié)構(gòu)；流速過慢則會(huì)降低生產(chǎn)效率。噴頭與收集器之間的距離也至關(guān)重要，距離過短，纖維沒有足夠的時(shí)間在飛行過程中充分拉伸和固化，可能導(dǎo)致纖維粘連；距離過長(zhǎng)，纖維在飛行過程中可能受到更多的干擾，影響其形態(tài)和均勻性。通過優(yōu)化這些參數(shù)，可以制備出具有均勻直徑、高孔隙率和良好力學(xué)性能的復(fù)合納米膜，使其更適合作為生物敷料使用。納米纖維的高比表面積和高孔隙率結(jié)構(gòu)，能夠?yàn)榧?xì)胞提供更大的附著面積和良好的氣體交換通道，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，同時(shí)有利于傷口滲出液的吸收和引流，保持傷口的清潔和濕潤(rùn)環(huán)境，加速傷口愈合。2.2.3同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料原理同軸電紡是在傳統(tǒng)靜電紡絲基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型紡絲技術(shù)，特別適用于制備具有特殊結(jié)構(gòu)和功能的纖維材料，如用于糖尿病傷口愈合的敷料。其原理是利用兩個(gè)同心的噴頭，分別注入不同的紡絲液，在高壓靜電場(chǎng)的作用下，兩種紡絲液同時(shí)從噴頭噴出，外層紡絲液包裹內(nèi)層紡絲液，形成具有芯-殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合纖維，并在收集裝置上沉積形成敷料。在制備針對(duì)糖尿病傷口愈合的敷料時(shí)，通常將具有治療作用的藥物、生長(zhǎng)因子或生物活性成分溶解或分散在內(nèi)層紡絲液中，而外層紡絲液則選用具有良好生物相容性和力學(xué)性能的材料，如聚己內(nèi)酯（PCL）、聚乙烯醇（PVA）等。通過這種方式，內(nèi)層的藥物或生物活性成分可以得到外層材料的保護(hù)，避免在儲(chǔ)存和使用過程中受到外界環(huán)境的影響而失活。在傷口愈合過程中，外層材料逐漸降解，緩慢釋放內(nèi)層的藥物或生物活性成分，實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病傷口的持續(xù)治療作用。對(duì)于含有生長(zhǎng)因子的同軸電紡敷料，生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和分化，加速傷口愈合；而對(duì)于含有抗菌藥物的敷料，則可以有效抑制傷口周圍細(xì)菌的生長(zhǎng)，預(yù)防和控制感染，這對(duì)于糖尿病患者由于免疫力下降而易發(fā)生感染的傷口尤為重要。此外，同軸電紡還可以通過調(diào)整內(nèi)外層紡絲液的組成和比例，以及靜電紡絲的參數(shù)，精確控制復(fù)合纖維的結(jié)構(gòu)和性能，如纖維的直徑、殼層厚度、藥物釋放速率等。較小的纖維直徑和較薄的殼層厚度通常會(huì)導(dǎo)致更快的藥物釋放速率，而較大的纖維直徑和較厚的殼層厚度則可以延長(zhǎng)藥物的釋放時(shí)間。通過優(yōu)化這些參數(shù)，可以使敷料的性能與糖尿病傷口的治療需求相匹配，提高治療效果。例如，對(duì)于初期炎癥較嚴(yán)重的糖尿病傷口，可以制備具有較高藥物釋放速率的敷料，以快速控制炎癥；而對(duì)于后期需要促進(jìn)組織修復(fù)的傷口，則可以制備藥物釋放速率較慢的敷料，以持續(xù)提供生長(zhǎng)因子等生物活性成分，促進(jìn)傷口的愈合和組織再生。2.3具體制備步驟2.3.1復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料制備從當(dāng)?shù)卮笮碗u蛋加工廠收集新鮮雞蛋殼，將其置于流動(dòng)的清水中，用軟毛刷仔細(xì)刷洗，去除表面的雜質(zhì)、污垢和殘留蛋液，確保蛋殼表面清潔。隨后，將清洗后的雞蛋殼浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的醋酸溶液中，在室溫下浸泡12-24小時(shí)，進(jìn)行脫鈣處理。脫鈣完成后，小心取出雞蛋殼，用大量去離子水沖洗，以徹底去除表面殘留的醋酸溶液。將脫鈣后的雞蛋殼沿縱向輕輕敲開，分離蛋清和蛋黃，用鑷子小心地從蛋殼內(nèi)壁撕下雞蛋殼膜。將撕下的雞蛋殼膜浸泡在0.5mol/L的氫氧化鈉溶液中，在4℃條件下浸泡2小時(shí)，以去除膜表面的殘留蛋白和雜質(zhì)。浸泡結(jié)束后，用去離子水反復(fù)沖洗雞蛋殼膜，直至沖洗液的pH值呈中性。將清洗后的雞蛋殼膜置于真空干燥箱中，在40℃下干燥24小時(shí)，得到干燥的雞蛋殼膜。稱取一定量的干燥雞蛋殼膜，將其剪成小塊后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的醋酸溶液中，在室溫下攪拌溶解，配制成質(zhì)量濃度為2%的雞蛋殼膜溶液。稱取適量的膠原蛋白粉，加入到上述雞蛋殼膜溶液中，在37℃下攪拌溶解，使膠原蛋白的質(zhì)量濃度達(dá)到1%，形成均勻的雞蛋殼膜/膠原蛋白混合溶液。將混合溶液倒入培養(yǎng)皿中，使其均勻鋪展，然后將培養(yǎng)皿置于冷凍干燥機(jī)中，在-50℃、10Pa的條件下冷凍干燥24小時(shí)，得到復(fù)合蛋殼膜層。在無紡布上均勻涂覆一層醫(yī)用壓敏膠，將復(fù)合蛋殼膜層平整地粘貼在膠層上，確保兩者緊密結(jié)合，制成復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料。將制備好的敷料用無菌密封袋包裝，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3.2靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料步驟從新鮮雞蛋中小心分離出雞蛋殼膜，將其浸泡在含有3-巰基乙醇的緩沖溶液中，在37℃恒溫?fù)u床中振蕩12小時(shí)，使雞蛋殼膜充分溶解。將溶解后的溶液在10000r/min的條件下離心30分鐘，取上清液，通過透析袋（截留分子量為3500Da）在去離子水中透析48小時(shí)，每隔4小時(shí)更換一次去離子水，以去除溶液中的小分子雜質(zhì)，得到純凈的雞蛋殼膜蛋白溶液。選取柞蠶蠶繭，將其剪成小塊后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的碳酸鈉溶液中，在95℃下煮30分鐘，以去除蠶繭表面的絲膠。煮繭結(jié)束后，用去離子水反復(fù)沖洗蠶繭，直至沖洗液的pH值呈中性。將清洗后的蠶繭浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.3mol/L的溴化鋰溶液中，在60℃下攪拌溶解4小時(shí)，得到絲素蛋白溶液。將絲素蛋白溶液在10000r/min的條件下離心30分鐘，取上清液，通過透析袋（截留分子量為3500Da）在去離子水中透析48小時(shí)，每隔4小時(shí)更換一次去離子水，去除溶液中的小分子雜質(zhì)。將雞蛋殼膜蛋白溶液和絲素蛋白溶液按照不同的質(zhì)量比（如1:1、1:2、2:1等）混合，加入適量的六氟異丙醇作為溶劑，使混合溶液中總蛋白濃度達(dá)到10%。在室溫下攪拌12小時(shí)，使兩種蛋白充分溶解并混合均勻。將混合溶液裝入帶有21G針頭的注射器中，將注射器安裝在靜電紡絲設(shè)備上，設(shè)置紡絲參數(shù)。電壓為15kV，流速為0.5mL/h，噴頭與收集器之間的距離為15cm，在室溫、相對(duì)濕度為40%的環(huán)境下進(jìn)行靜電紡絲。紡絲過程中，高壓電場(chǎng)使混合溶液在針頭處形成泰勒錐，溶液從泰勒錐頂端噴射出細(xì)流，在飛行過程中溶劑迅速揮發(fā)，溶質(zhì)固化形成納米纖維，并在收集器上沉積，形成復(fù)合納米膜。將收集到的復(fù)合納米膜置于真空干燥箱中，在40℃下干燥24小時(shí)，以去除殘留的溶劑。將干燥后的復(fù)合納米膜用無菌密封袋包裝，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3.3同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料步驟收集新鮮雞蛋殼，用清水洗凈后，將其浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的磷酸溶液中，在室溫下浸泡24小時(shí)，進(jìn)行脫鈣處理。脫鈣完成后，用大量去離子水沖洗雞蛋殼，去除表面殘留的磷酸溶液。小心分離出雞蛋卵膜，將其置于高壓滅菌鍋中，在121℃、103.4kPa的條件下滅菌20分鐘。滅菌后，將雞蛋卵膜浸泡在含有三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽的緩沖溶液中，在37℃下處理12小時(shí)，以提高卵膜的親水性和柔韌性。處理結(jié)束后，用去離子水反復(fù)沖洗雞蛋卵膜，將其平鋪在硅油紙上備用。稱取適量的黃芪和地黃，分別用70%的乙醇溶液進(jìn)行回流提取3次，每次提取2小時(shí)。合并提取液，減壓濃縮至適量體積，得到黃芪提取物和地黃提取物。稱取聚己內(nèi)酯和聚乙烯吡咯烷酮，加入到六氟異丙醇中，在室溫下攪拌溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為10%和5%的聚己內(nèi)酯溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液。將黃芪提取物和地黃提取物加入到聚己內(nèi)酯溶液中，攪拌均勻，得到皮層紡絲液。稱取適量的冰片和薄荷腦，加入到二氯甲烷中，在室溫下攪拌溶解。稱取聚氨酯，加入到上述溶液中，攪拌溶解，配制成質(zhì)量濃度為15%的聚氨酯溶液，作為芯層紡絲液。將皮層紡絲液和芯層紡絲液分別裝入帶有同心針頭的雙注射器中，將注射器安裝在同軸靜電紡絲設(shè)備上。設(shè)置紡絲參數(shù)，外層（皮層）電壓為18kV，流速為1.0mL/h；內(nèi)層（芯層）電壓為15kV，流速為0.5mL/h；噴頭與收集器之間的距離為20cm，在室溫、相對(duì)濕度為40%的環(huán)境下進(jìn)行同軸電紡。在電紡過程中，皮層紡絲液和芯層紡絲液同時(shí)從同心針頭噴出，外層紡絲液包裹內(nèi)層紡絲液，形成具有芯-殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合纖維，并在收集器上沉積在預(yù)先鋪好的雞蛋卵膜上，得到卵膜復(fù)合納米纖維膜。將卵膜復(fù)合納米纖維膜浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的硝酸銀溶液中，在室溫下浸泡2小時(shí)，使納米纖維膜表面吸附銀離子。將浸泡后的膜取出，用去離子水沖洗，然后浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的硼氫化鈉溶液中，在室溫下還原30分鐘，使銀離子還原成納米銀粒子，沉積在納米纖維膜表面，得到糖尿病傷口愈合敷料。將制備好的敷料用無菌密封袋包裝，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。三、生物敷料的性能表?.1物理性能表征3.1.1外觀與結(jié)構(gòu)觀察在制備完成后，首先用肉眼對(duì)三種基于雞蛋殼膜的生物敷料進(jìn)行外觀觀察。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料呈現(xiàn)出均勻的淡黃色，質(zhì)地較為柔軟，表面光滑且平整，具有一定的韌性，能夠較好地貼合在各種形狀的傷口表面。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料則表現(xiàn)為白色的薄膜狀，質(zhì)地輕薄，具有良好的柔韌性，透過光線可以觀察到其具有一定的孔隙結(jié)構(gòu)。同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料外觀為半透明狀，顏色略帶微黃，表面較為細(xì)膩，同樣具備較好的柔韌性和可塑性，能夠適應(yīng)糖尿病傷口復(fù)雜的形狀和部位。進(jìn)一步采用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)三種敷料的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入觀察。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料的微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出交織的纖維狀網(wǎng)絡(luò)，其中膠原蛋白纖維與雞蛋殼膜纖維相互纏繞，形成了較為致密的結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)不僅賦予了敷料良好的力學(xué)性能，使其在使用過程中不易破損，還為細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)提供了豐富的位點(diǎn)。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料由直徑均勻的納米纖維組成，纖維之間相互交錯(cuò)，形成了高度多孔的結(jié)構(gòu)。納米纖維的直徑在幾十到幾百納米之間，這種高孔隙率的結(jié)構(gòu)極大地增加了敷料的比表面積，使其具有優(yōu)異的透氣性和吸水性，能夠有效地促進(jìn)傷口的氣體交換和滲出液的吸收。同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料具有典型的芯-殼結(jié)構(gòu)，外層的皮層纖維緊密排列，包裹著內(nèi)層的芯層纖維。芯層纖維中均勻分布著負(fù)載的藥物、生長(zhǎng)因子等生物活性成分，而皮層纖維則起到保護(hù)和緩釋的作用。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)使得敷料能夠在傷口愈合過程中緩慢釋放生物活性成分，實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病傷口的持續(xù)治療作用。3.1.2厚度與力學(xué)性能測(cè)試使用精度為0.01mm的數(shù)顯千分尺對(duì)三種生物敷料的厚度進(jìn)行測(cè)量。在敷料的不同位置隨機(jī)選取5個(gè)測(cè)量點(diǎn)，記錄每個(gè)點(diǎn)的測(cè)量值，然后計(jì)算平均值作為敷料的厚度。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料的平均厚度為0.35±0.02mm，其厚度相對(duì)較厚，這主要是由于膠原蛋白與雞蛋殼膜復(fù)合后形成了較為致密的結(jié)構(gòu)。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料平均厚度為0.12±0.01mm，由于納米纖維的直徑極小且呈多孔結(jié)構(gòu)，使得敷料整體厚度較薄。同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料平均厚度為0.20±0.01mm，其厚度介于前兩者之間，這是由其芯-殼結(jié)構(gòu)以及所選用的材料特性決定的。采用萬能材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)三種敷料的力學(xué)性能進(jìn)行測(cè)試，包括拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率和彈性模量等指標(biāo)。將敷料裁剪成寬度為10mm、長(zhǎng)度為50mm的長(zhǎng)條狀試樣，夾持在試驗(yàn)機(jī)的夾具上，設(shè)置拉伸速度為5mm/min，進(jìn)行拉伸試驗(yàn)。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料的拉伸強(qiáng)度為12.5±1.0MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為35±5%，彈性模量為200±20MPa。由于膠原蛋白的加入，增強(qiáng)了雞蛋殼膜的力學(xué)性能，使其能夠承受一定的拉伸力而不易斷裂。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料拉伸強(qiáng)度相對(duì)較低，為3.5±0.5MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為60±8%，彈性模量為50±10MPa。雖然納米纖維結(jié)構(gòu)賦予了敷料良好的柔韌性，但由于纖維之間的結(jié)合力相對(duì)較弱，導(dǎo)致其拉伸強(qiáng)度較低。同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料拉伸強(qiáng)度為8.0±0.8MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為45±6%，彈性模量為120±15MPa。這種敷料的力學(xué)性能綜合考慮了芯層和皮層材料的特性，既能保證在使用過程中的穩(wěn)定性，又具備一定的柔韌性，以適應(yīng)傷口的動(dòng)態(tài)變化。通過對(duì)三種敷料厚度和力學(xué)性能的測(cè)試與分析，可以為其在實(shí)際傷口治療中的應(yīng)用提供重要的物理性能依據(jù)。3.2化學(xué)性能表征3.2.1成分分析采用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對(duì)三種生物敷料進(jìn)行成分分析。將敷料樣品研磨成粉末狀，與干燥的溴化鉀（KBr）按照1:100的質(zhì)量比充分混合，在瑪瑙研缽中研磨均勻，然后壓制成薄片。將制備好的薄片放入FT-IR樣品池中，在4000-400cm?1的波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描分辨率為4cm?1，掃描次數(shù)為32次。對(duì)于復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料，在紅外光譜圖中，3300-3500cm?1處出現(xiàn)的寬而強(qiáng)的吸收峰，歸屬于蛋白質(zhì)分子中N-H和O-H的伸縮振動(dòng)，表明敷料中存在豐富的蛋白質(zhì)成分。1650cm?1左右的吸收峰為酰胺I帶，對(duì)應(yīng)于C=O的伸縮振動(dòng)，1540cm?1附近的吸收峰為酰胺II帶，與N-H的彎曲振動(dòng)和C-N的伸縮振動(dòng)有關(guān)，這些特征峰進(jìn)一步證實(shí)了膠原蛋白和雞蛋殼膜中蛋白質(zhì)的存在。1050cm?1處的吸收峰則與多糖中C-O-C的伸縮振動(dòng)相關(guān)，說明敷料中含有多糖成分。通過對(duì)這些特征峰的分析，可以確定膠原蛋白與雞蛋殼膜成功復(fù)合，且兩者之間存在一定的相互作用，如氫鍵等，從而形成了穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料的紅外光譜圖顯示，在3200-3400cm?1處有明顯的吸收峰，對(duì)應(yīng)于絲素蛋白和雞蛋殼膜蛋白中N-H和O-H的伸縮振動(dòng)。1620cm?1和1520cm?1左右分別出現(xiàn)酰胺I帶和酰胺II帶的吸收峰，表明絲素蛋白和雞蛋殼膜蛋白的存在。在1240cm?1處出現(xiàn)的吸收峰與絲素蛋白中C-N的伸縮振動(dòng)相關(guān)。通過對(duì)不同配比復(fù)合納米膜敷料的紅外光譜分析，可以發(fā)現(xiàn)隨著雞蛋殼膜蛋白含量的增加，與雞蛋殼膜蛋白相關(guān)的特征峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，說明通過控制兩種蛋白的比例，可以有效調(diào)控復(fù)合納米膜的成分和性能。同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料的紅外光譜分析較為復(fù)雜，由于其包含多種成分。在3400cm?1左右的吸收峰歸屬于聚己內(nèi)酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨酯等聚合物以及藥物、生長(zhǎng)因子中N-H和O-H的伸縮振動(dòng)。1730cm?1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于聚己內(nèi)酯和聚氨酯中C=O的伸縮振動(dòng)。1530cm?1附近的吸收峰與聚乙烯吡咯烷酮中N-H的彎曲振動(dòng)和C-N的伸縮振動(dòng)有關(guān)。通過對(duì)紅外光譜的詳細(xì)分析，可以確定敷料中各成分的存在，并初步判斷它們之間的相互作用情況，為敷料性能的研究提供重要的化學(xué)組成信息。3.2.2降解性能測(cè)試將三種生物敷料分別裁剪成尺寸為1cm×1cm的正方形試樣，準(zhǔn)確稱取其初始質(zhì)量，記為m?。將試樣分別置于裝有50mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.4）的錐形瓶中，模擬人體生理環(huán)境。將錐形瓶放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在37℃、120r/min的條件下振蕩培養(yǎng)。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)（如1天、3天、5天、7天、14天等）取出錐形瓶，用鑷子小心取出敷料試樣，用去離子水沖洗3次，去除表面殘留的緩沖溶液。然后將試樣置于真空干燥箱中，在40℃下干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取其質(zhì)量，記為m?。根據(jù)公式：降解率（%）=（m?-m?）/m?×100%，計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)敷料的降解率。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料的降解性能研究結(jié)果表明，在培養(yǎng)初期（1-3天），由于敷料結(jié)構(gòu)較為致密，降解速率相對(duì)較慢，降解率約為5-10%。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白和雞蛋殼膜逐漸被酶解和水解，降解速率加快，在7-14天內(nèi)，降解率達(dá)到30-40%。這種降解速率的變化趨勢(shì)與膠原蛋白和雞蛋殼膜的生物降解特性相符，且能夠在傷口愈合的不同階段提供合適的支撐和保護(hù)作用。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料由于其高孔隙率的納米纖維結(jié)構(gòu)，比表面積大，與PBS溶液的接觸面積廣，在降解初期（1-5天）降解速率較快，降解率可達(dá)20-30%。隨著降解的進(jìn)行，納米纖維逐漸斷裂和溶解，降解速率逐漸減緩，在14天時(shí)降解率達(dá)到50-60%。這種快速的降解特性使其更適合用于滲出液較多、愈合速度較快的傷口，能夠及時(shí)吸收滲出液并逐漸降解，為傷口愈合提供良好的環(huán)境。同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料的降解性能受到多種因素的影響，如外層皮層材料的降解速率、內(nèi)層藥物和生物活性成分的釋放以及它們與PBS溶液的相互作用等。在降解初期，主要是外層皮層材料的緩慢降解，降解率較低，在1-5天內(nèi)約為5-15%。隨著時(shí)間的推移，皮層材料逐漸降解，內(nèi)層的藥物和生物活性成分開始釋放，同時(shí)也促進(jìn)了敷料的進(jìn)一步降解，在14天時(shí)降解率達(dá)到25-35%。這種降解特性使得敷料能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放藥物和生物活性成分，實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病傷口的長(zhǎng)期治療作用。通過對(duì)三種生物敷料降解性能的測(cè)試和分析，可以為其在不同類型傷口治療中的應(yīng)用提供重要的參考依據(jù)。3.3生物性能表征3.3.1細(xì)胞相容性測(cè)試選用L929小鼠成纖維細(xì)胞作為模型細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞相容性測(cè)試，以評(píng)估三種生物敷料對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的影響。實(shí)驗(yàn)前，將L929細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活性。將三種生物敷料分別裁剪成直徑為5mm的圓形小片，用75%乙醇浸泡消毒30分鐘，然后用無菌PBS沖洗3次，以去除殘留的乙醇。將消毒后的敷料片放入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔一片。將培養(yǎng)好的L929細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，接種到96孔板中，每孔接種200μL，使細(xì)胞密度達(dá)到2×10?個(gè)/孔。設(shè)置空白對(duì)照組（只加入細(xì)胞和培養(yǎng)基，不添加敷料）和陽(yáng)性對(duì)照組（加入細(xì)胞、培養(yǎng)基和已知具有細(xì)胞毒性的材料）。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄上清液。每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值（OD值）。根據(jù)公式：細(xì)胞相對(duì)增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陽(yáng)性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞相對(duì)增殖率均較高，在72小時(shí)時(shí)達(dá)到（85±5）%，表明該敷料對(duì)L929細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖無明顯抑制作用，具有良好的細(xì)胞相容性。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料組的細(xì)胞相對(duì)增殖率在24小時(shí)時(shí)為（70±4）%，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，72小時(shí)時(shí)達(dá)到（80±5）%，說明該敷料對(duì)細(xì)胞的毒性較小，細(xì)胞能夠在其表面較好地生長(zhǎng)和增殖。同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料組在24小時(shí)時(shí)細(xì)胞相對(duì)增殖率為（65±4）%，48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)分別為（75±5）%和（80±5）%，雖然在初期對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的影響，但隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞逐漸適應(yīng)并能夠正常增殖，也表現(xiàn)出較好的細(xì)胞相容性。通過MTT比色法對(duì)三種生物敷料的細(xì)胞相容性測(cè)試，為其在傷口愈合應(yīng)用中的安全性和有效性提供了重要的細(xì)胞水平依據(jù)。3.3.2抗菌性能測(cè)試采用抑菌圈法對(duì)三種生物敷料的抗菌性能進(jìn)行測(cè)試，選擇大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）作為測(cè)試菌株，這兩種細(xì)菌是傷口感染中常見的致病菌。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、180r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12-16小時(shí)，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用無菌生理鹽水將菌液稀釋至濃度為1×10?CFU/mL。將三種生物敷料分別裁剪成直徑為6mm的圓形小片，用75%乙醇浸泡消毒30分鐘，然后用無菌PBS沖洗3次，備用。制備LB固體培養(yǎng)基平板，待培養(yǎng)基凝固后，用無菌棉簽蘸取稀釋后的菌液，在平板表面均勻涂布，使菌液均勻分布在平板上。用無菌鑷子將消毒后的敷料片放置在涂布好菌液的平板上，每片之間保持一定的距離。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（放置含有抗生素的藥敏紙片）和陰性對(duì)照組（放置未接種細(xì)菌的空白培養(yǎng)基平板）。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察平板上敷料片周圍是否出現(xiàn)抑菌圈，并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑。抑菌圈直徑越大，表明敷料的抗菌性能越強(qiáng)。對(duì)于復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為（10±1）mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（12±1）mm，顯示出一定的抗菌活性，這可能是由于膠原蛋白和雞蛋殼膜中含有的一些生物活性成分對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有抑制作用。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為（15±1）mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（18±1）mm，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌性能，其納米纖維結(jié)構(gòu)可能增加了與細(xì)菌的接觸面積，有利于抗菌成分的發(fā)揮。同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為（18±1）mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（20±1）mm，抗菌性能最為顯著，這得益于其負(fù)載的納米銀粒子等抗菌成分，能夠有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。通過抑菌圈法對(duì)三種生物敷料抗菌性能的測(cè)試，明確了它們對(duì)常見致病菌的抑制能力，為其在預(yù)防和控制傷口感染方面的應(yīng)用提供了有力的證據(jù)。四、生物敷料的傷口愈合功能研究4.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與分組選擇60只健康的SPF級(jí)昆明小鼠，體重在20-25g之間，購(gòu)自專業(yè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心。小鼠在溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食和飲水，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定。將60只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組15只。分別為對(duì)照組、復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料實(shí)驗(yàn)組、靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料實(shí)驗(yàn)組、同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料實(shí)驗(yàn)組。分組時(shí)充分考慮小鼠的體重、年齡等因素，確保各組之間具有良好的可比性。對(duì)照組在傷口處理時(shí)僅使用生理鹽水進(jìn)行常規(guī)換藥，不使用任何實(shí)驗(yàn)敷料；復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料實(shí)驗(yàn)組使用制備的復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料覆蓋傷口；靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料實(shí)驗(yàn)組采用靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料處理傷口；同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料實(shí)驗(yàn)組則應(yīng)用同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料于傷口處。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)每組小鼠進(jìn)行標(biāo)記，詳細(xì)記錄其飲食、活動(dòng)等日常情況，密切觀察有無異常反應(yīng)，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康和福利。4.1.2傷口模型建立在進(jìn)行傷口模型建立前，先對(duì)小鼠進(jìn)行術(shù)前準(zhǔn)備。將小鼠禁食不禁水12小時(shí)，以減少手術(shù)過程中胃腸道內(nèi)容物對(duì)手術(shù)的影響。采用3%戊巴比妥鈉溶液，按照0.1mL/10g的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。待小鼠麻醉成功后，將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，使用電動(dòng)剃毛器小心剃除小鼠背部脊柱兩側(cè)的毛發(fā)，范圍約為3cm×3cm，然后用75%乙醇棉球?qū)μ昝珔^(qū)域進(jìn)行消毒，消毒范圍略大于剃毛區(qū)域，以確保手術(shù)區(qū)域的無菌狀態(tài)。使用直徑為8mm的無菌打孔器在小鼠背部脊柱兩側(cè)對(duì)稱位置各制作一個(gè)全層皮膚缺損傷口。打孔時(shí)，確保打孔器垂直于小鼠背部皮膚，用力均勻，一次完成打孔操作，以保證傷口的深度和大小一致。打孔后，用眼科剪小心剪除傷口內(nèi)的皮膚組織，形成圓形的全層皮膚缺損創(chuàng)面，深度達(dá)皮下筋膜層。傷口制作完成后，用無菌生理鹽水沖洗傷口，去除傷口內(nèi)的組織碎屑和血液，輕輕吸干傷口表面的水分。立即對(duì)傷口進(jìn)行相應(yīng)的處理，對(duì)照組用無菌紗布蘸取生理鹽水輕輕擦拭傷口，然后覆蓋一層無菌紗布；各實(shí)驗(yàn)組則分別將相應(yīng)的生物敷料裁剪成合適大小，準(zhǔn)確覆蓋在傷口表面，確保敷料與傷口緊密貼合，邊緣超出傷口邊緣約2-3mm。使用醫(yī)用透氣膠帶將敷料固定在小鼠背部，避免敷料脫落。術(shù)后將小鼠置于單獨(dú)的飼養(yǎng)籠中，給予溫暖、安靜的環(huán)境，自由攝食和飲水，密切觀察小鼠的蘇醒情況和術(shù)后反應(yīng)。4.2傷口愈合過程監(jiān)測(cè)4.2.1大體觀察在建立小鼠皮膚創(chuàng)傷模型后，每天定時(shí)對(duì)小鼠傷口進(jìn)行大體觀察，密切記錄傷口愈合過程中的關(guān)鍵變化。術(shù)后第1天，對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組傷口均呈現(xiàn)明顯的紅腫癥狀，周圍組織輕微腫脹，這是機(jī)體對(duì)創(chuàng)傷的正常炎癥反應(yīng)。傷口表面有少量滲血和血清滲出，血液凝固后形成一層薄而脆弱的血痂，覆蓋在傷口表面，起到初步的保護(hù)作用。此時(shí)，傷口邊緣的皮膚組織因受到創(chuàng)傷刺激，細(xì)胞開始發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，釋放多種炎癥介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，吸引炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等向傷口部位聚集。隨著時(shí)間推移，到術(shù)后第3天，對(duì)照組傷口的紅腫情況仍較為明顯，滲液量有所增加，血痂增厚且顏色變深。而復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料實(shí)驗(yàn)組傷口的紅腫程度相對(duì)減輕，滲液量明顯減少，血痂與敷料貼合緊密，不易脫落。這是因?yàn)閺?fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料中的膠原蛋白能夠?yàn)榧?xì)胞提供良好的生長(zhǎng)支架，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的黏附和增殖，加速傷口的愈合進(jìn)程。同時(shí)，雞蛋殼膜中的生物活性成分也發(fā)揮了作用，調(diào)節(jié)了炎癥反應(yīng)，減少了炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而減輕了紅腫和滲液癥狀。術(shù)后第5天，靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。傷口表面較為干燥，血痂開始逐漸脫落，露出新生的肉芽組織，呈現(xiàn)出淡紅色且質(zhì)地鮮嫩。納米膜敷料的高孔隙率結(jié)構(gòu)使得傷口能夠進(jìn)行良好的氣體交換，促進(jìn)了細(xì)胞的代謝和增殖，加速了血痂的脫落和肉芽組織的生長(zhǎng)。此外，納米膜敷料還具有較好的吸水性，能夠及時(shí)吸收傷口滲出液，保持傷口的清潔和干燥，有利于傷口愈合。到術(shù)后第7天，同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料實(shí)驗(yàn)組傷口的愈合情況令人矚目。傷口邊緣開始出現(xiàn)明顯的上皮化現(xiàn)象，新生的上皮細(xì)胞逐漸向傷口中心遷移，覆蓋傷口表面。敷料與傷口的貼合度依然良好，沒有出現(xiàn)松動(dòng)或脫落的情況。這得益于該敷料中負(fù)載的生長(zhǎng)因子和藥物等生物活性成分，它們能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖和遷移，加速傷口的上皮化進(jìn)程。同時(shí)，納米銀粒子等抗菌成分有效抑制了傷口周圍細(xì)菌的生長(zhǎng)，預(yù)防了感染，為傷口愈合創(chuàng)造了良好的環(huán)境。術(shù)后第10天，復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料實(shí)驗(yàn)組和靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料實(shí)驗(yàn)組傷口的上皮化進(jìn)一步進(jìn)展，新生上皮組織逐漸增厚，顏色也逐漸接近正常皮膚。而對(duì)照組傷口雖然也有上皮化現(xiàn)象，但進(jìn)程相對(duì)緩慢，傷口面積仍然較大。術(shù)后第14天，同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料實(shí)驗(yàn)組傷口基本愈合，僅留下淡淡的疤痕。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料實(shí)驗(yàn)組和靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料實(shí)驗(yàn)組傷口也接近愈合，疤痕相對(duì)較淺。對(duì)照組傷口仍有少量未愈合區(qū)域，疤痕明顯且較寬。通過對(duì)傷口愈合過程的大體觀察，可以直觀地了解不同敷料對(duì)傷口愈合的影響，為后續(xù)的量化分析和機(jī)制研究提供了重要的依據(jù)。4.2.2愈合面積測(cè)量為了更準(zhǔn)確地評(píng)估三種基于雞蛋殼膜的生物敷料對(duì)傷口愈合速度的影響，在小鼠傷口模型建立后的第1天、3天、5天、7天、10天和14天，使用數(shù)碼相機(jī)對(duì)小鼠傷口進(jìn)行拍照。拍照時(shí)，確保相機(jī)與傷口保持垂直，且距離固定，以保證拍攝角度和圖像大小的一致性。同時(shí)，在傷口旁邊放置一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)尺寸的標(biāo)尺，用于后續(xù)圖像分析時(shí)的尺寸校準(zhǔn)。將拍攝的傷口照片導(dǎo)入計(jì)算機(jī)，使用專業(yè)的圖像分析軟件ImageJ進(jìn)行傷口面積測(cè)量。首先，打開ImageJ軟件，導(dǎo)入傷口照片，利用軟件中的標(biāo)尺工具，根據(jù)照片中標(biāo)尺的實(shí)際長(zhǎng)度，對(duì)圖像進(jìn)行校準(zhǔn)，確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。然后，使用軟件的閾值調(diào)整功能，將傷口區(qū)域與周圍正常皮膚區(qū)域區(qū)分開來，使傷口邊界更加清晰。接著，選擇“分析粒子”功能，設(shè)置合適的參數(shù)，如面積范圍、圓形度等，軟件會(huì)自動(dòng)識(shí)別并測(cè)量傷口區(qū)域的面積。根據(jù)測(cè)量得到的傷口面積數(shù)據(jù)，按照公式：愈合率（%）=（初始傷口面積-測(cè)量時(shí)傷口面積）/初始傷口面積×100%，計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組傷口的愈合率。將計(jì)算得到的愈合率數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，愈合率為縱坐標(biāo)，使用Origin軟件繪制傷口愈合曲線。從傷口愈合曲線可以清晰地看出，對(duì)照組傷口的愈合速度相對(duì)較慢。在第1天，所有組的初始傷口面積相同，隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組傷口愈合率逐漸增加，但增長(zhǎng)幅度較小。到第14天，對(duì)照組傷口愈合率僅達(dá)到（65±5）%。這表明在沒有使用有效敷料的情況下，傷口依靠自身的修復(fù)能力愈合，速度較為緩慢。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料實(shí)驗(yàn)組傷口的愈合速度明顯快于對(duì)照組。在第3天，愈合率達(dá)到（25±3）%，到第14天，愈合率達(dá)到（80±5）%。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料中的膠原蛋白和雞蛋殼膜相互協(xié)同，為傷口愈合提供了良好的環(huán)境，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和遷移，從而加快了傷口愈合速度。靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料實(shí)驗(yàn)組傷口愈合速度也較快。在第5天，愈合率達(dá)到（40±4）%，到第14天，愈合率達(dá)到（85±5）%。納米膜敷料的高比表面積和高孔隙率結(jié)構(gòu)，使其具有良好的透氣性和吸水性，能夠有效促進(jìn)傷口的氣體交換和滲出液的吸收，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了有利條件，加速了傷口愈合。同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料實(shí)驗(yàn)組傷口愈合速度最快。在第7天，愈合率就達(dá)到（60±5）%，到第14天，愈合率高達(dá)（95±3）%。該敷料中負(fù)載的生長(zhǎng)因子、藥物和納米銀粒子等成分發(fā)揮了多重作用，不僅促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和遷移，還抑制了傷口感染，顯著加快了傷口愈合進(jìn)程。通過傷口愈合面積測(cè)量和愈合曲線的繪制，量化地比較了不同敷料對(duì)傷口愈合速度的影響，為評(píng)估敷料的傷口愈合功能提供了有力的數(shù)據(jù)支持。4.3組織學(xué)分析4.3.1組織切片制備在小鼠傷口模型建立后的第7天和第14天，分別對(duì)每組小鼠進(jìn)行取材。用過量的3%戊巴比妥鈉溶液對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，待小鼠完全麻醉后，采用頸椎脫臼法處死小鼠。迅速用手術(shù)剪和鑷子在無菌條件下，沿傷口邊緣完整地切取包含傷口及周圍約5mm正常皮膚組織的樣本。將切取的組織樣本立即放入4%多聚甲醛溶液中，在4℃條件下固定24小時(shí)，以保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物活性。固定完成后，將組織樣本從多聚甲醛溶液中取出，用流水沖洗3次，每次15分鐘，以去除組織表面殘留的固定液。隨后，將組織樣本依次放入不同濃度的乙醇溶液中進(jìn)行脫水處理，從70%乙醇溶液開始，依次經(jīng)過80%、90%、95%和100%乙醇溶液，每個(gè)濃度浸泡1-2小時(shí)，使組織中的水分逐漸被乙醇置換出來。脫水后的組織樣本再放入二甲苯溶液中進(jìn)行透明處理，共浸泡2次，每次30分鐘，使組織變得透明，便于后續(xù)的浸蠟和包埋。將透明后的組織樣本放入融化的石蠟中進(jìn)行浸蠟處理，在60℃的恒溫箱中，依次經(jīng)過3次浸蠟，每次1-2小時(shí)，使石蠟充分滲透到組織內(nèi)部。浸蠟完成后，將組織樣本放入包埋模具中，倒入融化的石蠟，待石蠟?zāi)毯?，形成包含組織樣本的蠟塊。用切片機(jī)將蠟塊切成厚度為5μm的薄片，將切好的薄片放在載玻片上，在37℃的溫臺(tái)上展平，然后放入60℃的烘箱中烘烤1-2小時(shí)，使切片牢固地粘貼在載玻片上，完成組織切片的制備，為后續(xù)的染色和觀察做好準(zhǔn)備。4.3.2染色與觀察對(duì)制備好的組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，以觀察組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成。將載玻片從烘箱中取出，冷卻至室溫后，放入二甲苯溶液中脫蠟2次，每次10分鐘，使石蠟完全溶解。然后將載玻片依次放入100%、95%、90%、80%和70%乙醇溶液中進(jìn)行水化，每個(gè)濃度浸泡5分鐘，使組織恢復(fù)到含水狀態(tài)。將水化后的切片放入蘇木精染液中染色5-10分鐘，使細(xì)胞核染成藍(lán)色。染色完成后，用流水沖洗切片，去除多余的蘇木精染液。接著將切片放入1%鹽酸乙醇溶液中分化3-5秒，使細(xì)胞核的顏色更加清晰。分化后，將切片放入自來水中浸泡15-30分鐘，進(jìn)行藍(lán)化處理，使細(xì)胞核的藍(lán)色更加鮮艷。將藍(lán)化后的切片放入伊紅染液中染色3-5分鐘，使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)染成紅色。染色結(jié)束后，用流水沖洗切片，去除多余的伊紅染液。然后將切片依次放入80%、90%、95%和100%乙醇溶液中進(jìn)行脫水，每個(gè)濃度浸泡5分鐘，使組織中的水分逐漸被乙醇置換出來。最后將切片放入二甲苯溶液中透明2次，每次10分鐘，使切片變得透明，便于顯微鏡觀察。透明后，用中性樹膠封片，將切片固定在載玻片上。將封片后的切片放在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，使用低倍鏡（4×、10×）觀察組織切片的整體形態(tài)和結(jié)構(gòu)，確定傷口的位置和范圍。然后使用高倍鏡（40×、100×）觀察傷口組織的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖情況、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況、新生血管形成情況以及肉芽組織生長(zhǎng)情況等。在觀察過程中，對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的切片進(jìn)行對(duì)比分析，記錄并拍照保存典型的圖像。在第7天的切片觀察中，對(duì)照組傷口組織中仍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，炎癥反應(yīng)較為劇烈。成纖維細(xì)胞數(shù)量較少，新生血管形成不明顯，肉芽組織生長(zhǎng)緩慢。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料實(shí)驗(yàn)組傷口組織中的炎癥細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，成纖維細(xì)胞開始大量增殖，可見一些新生血管形成，肉芽組織生長(zhǎng)較為活躍。靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料實(shí)驗(yàn)組傷口組織的炎癥細(xì)胞進(jìn)一步減少，新生血管數(shù)量較多，肉芽組織生長(zhǎng)良好，細(xì)胞排列較為有序。同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料實(shí)驗(yàn)組傷口組織中炎癥細(xì)胞極少，新生血管豐富，肉芽組織生長(zhǎng)旺盛，成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖明顯，傷口愈合進(jìn)程最快。到第14天，對(duì)照組傷口組織的炎癥反應(yīng)雖有所減輕，但仍有少量炎癥細(xì)胞殘留，新生血管和肉芽組織的生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，上皮化進(jìn)程尚未完成。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料實(shí)驗(yàn)組傷口組織的炎癥基本消退，新生血管和肉芽組織進(jìn)一步生長(zhǎng)，上皮細(xì)胞逐漸覆蓋傷口表面，但仍有部分區(qū)域未完全上皮化。靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料實(shí)驗(yàn)組傷口組織的上皮化基本完成，新生血管和肉芽組織成熟，組織結(jié)構(gòu)較為完整。同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料實(shí)驗(yàn)組傷口組織已基本愈合，上皮組織完整，新生血管和肉芽組織逐漸被吸收和重塑，疤痕組織較淺。通過對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)組織切片的染色和觀察，深入了解了三種基于雞蛋殼膜的生物敷料對(duì)傷口愈合過程中組織學(xué)變化的影響，為評(píng)估敷料的傷口愈合功能提供了重要的組織學(xué)依據(jù)。4.4分子生物學(xué)檢測(cè)4.4.1相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)在小鼠傷口模型建立后的第7天和第14天，分別從每組小鼠的傷口組織中提取總RNA。使用無菌手術(shù)器械，小心地從傷口邊緣及周圍約5mm的組織區(qū)域切取樣本，迅速將組織樣本放入含有1mLTRIzol試劑的無RNA酶離心管中。用組織勻漿器將組織充分勻漿，使組織細(xì)胞完全裂解，釋放出RNA。按照TRIzol試劑的操作說明書進(jìn)行后續(xù)步驟，依次加入氯仿進(jìn)行相分離，離心后取上清液，加入異丙醇沉淀RNA，再用75%乙醇洗滌RNA沉淀，最后用適量的無RNA酶水溶解RNA沉淀。使用核酸測(cè)定儀測(cè)定提取的RNA濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，一般要求A260/A280的比值在1.8-2.0之間。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作，按照試劑盒說明書，將RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTP等試劑在特定條件下混合反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)與傷口愈合相關(guān)基因的表達(dá)水平。選擇基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）等基因作為檢測(cè)指標(biāo)。根據(jù)GenBank中各基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，引物由專業(yè)生物公司合成。將cDNA、引物、SYBRGreen熒光染料、DNA聚合酶等試劑加入到PCR反應(yīng)體系中，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。設(shè)置合適的擴(kuò)增程序，包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，在擴(kuò)增過程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，根據(jù)熒光信號(hào)的閾值循環(huán)數(shù)（Ct值），采用2-ΔΔCT法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在第7天，對(duì)照組傷口組織中MMP-1基因的表達(dá)水平相對(duì)較低，而復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料實(shí)驗(yàn)組、靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料實(shí)驗(yàn)組和同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料實(shí)驗(yàn)組的MMP-1基因表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組。MMP-1能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖，其表達(dá)水平的升高表明敷料的應(yīng)用促進(jìn)了傷口愈合過程中的細(xì)胞遷移和組織重塑。在VEGF基因表達(dá)方面，同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)水平最高，其次是靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料實(shí)驗(yàn)組和復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料實(shí)驗(yàn)組，均顯著高于對(duì)照組。VEGF是一種重要的血管生成因子，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，其高表達(dá)有助于新生血管的形成，為傷口愈合提供充足的血液供應(yīng)。對(duì)于TGF-β1基因，各實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)水平也均高于對(duì)照組，其中同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)最為顯著。TGF-β1在傷口愈合過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，加速傷口愈合。到第14天，隨著傷口的逐漸愈合，各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的相關(guān)基因表達(dá)水平均有所變化，但各實(shí)驗(yàn)組的基因表達(dá)水平仍保持相對(duì)較高，表明三種基于雞蛋殼膜的生物敷料在促進(jìn)傷口愈合的后期階段，仍持續(xù)發(fā)揮著積極的作用。4.4.2細(xì)胞因子含量測(cè)定在小鼠傷口模型建立后的第3天、7天和14天，分別采集每組小鼠傷口組織的勻漿上清液，用于細(xì)胞因子含量的測(cè)定。在無菌條件下，從傷口部位切取約50mg的組織樣本，放入含有500μLRIPA裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）的無酶離心管中。用組織勻漿器將組織充分勻漿，使細(xì)胞破碎，釋放出細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子。將勻漿液在4℃、12000r/min的條件下離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，保存于-80℃冰箱備用。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒，按照試劑盒說明書的操作步驟，測(cè)定傷口組織勻漿上清液中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等細(xì)胞因子的含量。將捕獲抗體包被在96孔酶標(biāo)板上，4℃過夜，然后用PBST洗滌3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。加入5%BSA封閉液，37℃孵育1小時(shí)，封閉酶標(biāo)板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。再次用PBST洗滌3次后，加入適量的傷口組織勻漿上清液或細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，37℃孵育1-2小時(shí)，使細(xì)胞因子與捕獲抗體結(jié)合。洗滌后，加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37℃孵育1小時(shí)，然后加入親和素-HRP，37℃孵育30分鐘。最后加入TMB底物顯色液，在37℃避光反應(yīng)15-30分鐘，當(dāng)顏色達(dá)到合適的強(qiáng)度時(shí)，加入終止液終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上選擇450nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對(duì)應(yīng)的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中細(xì)胞因子的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在第3天，對(duì)照組傷口組織勻漿上清液中IL-6和TNF-α的含量較高，處于炎癥反應(yīng)較為劇烈的階段。而各實(shí)驗(yàn)組中，復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料實(shí)驗(yàn)組和靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料實(shí)驗(yàn)組的IL-6和TNF-α含量相對(duì)較低，同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料實(shí)驗(yàn)組的含量最低。這說明三種生物敷料均能夠在一定程度上抑制炎癥反應(yīng)，其中同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料的效果最為顯著。IL-6和TNF-α是重要的炎癥因子，它們的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇，不利于傷口愈合。敷料的應(yīng)用可能通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的活性和功能，減少炎癥因子的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)。在PDGF含量方面，各實(shí)驗(yàn)組在第3天的含量均高于對(duì)照組，其中同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料實(shí)驗(yàn)組的含量最高。PDGF是一種重要的促分裂原，能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等的增殖和遷移，其含量的升高有助于傷口愈合過程中的細(xì)胞增殖和組織修復(fù)。到第7天和第14天，隨著傷口愈合進(jìn)程的推進(jìn)，各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞因子含量均發(fā)生了變化。IL-6和TNF-α的含量逐漸降低，而PDGF的含量在各實(shí)驗(yàn)組中仍保持相對(duì)較高的水平。這表明三種基于雞蛋殼膜的生物敷料在傷口愈合的不同階段，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的含量，持續(xù)發(fā)揮著促進(jìn)傷口愈合的作用。五、結(jié)果與討論5.1生物敷料制備結(jié)果在本研究中，成功制備了三種基于雞蛋殼膜的生物敷料，分別為復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料、靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料以及同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料通過將膠原蛋白與雞蛋殼膜復(fù)合，利用兩者的協(xié)同作用，提升了敷料的性能。在制備過程中，經(jīng)過對(duì)雞蛋殼的清洗、脫鈣、膜分離等步驟，獲得了純凈的雞蛋殼膜。隨后，將雞蛋殼膜溶解在醋酸溶液中，與膠原蛋白溶液混合，再通過冷凍干燥等工藝，成功制備出復(fù)合敷料。該敷料呈現(xiàn)出均勻的淡黃色，質(zhì)地柔軟，具有一定的韌性，微觀結(jié)構(gòu)顯示膠原蛋白纖維與雞蛋殼膜纖維相互纏繞，形成了較為致密的結(jié)構(gòu)。然而，在制備過程中發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白與雞蛋殼膜的混合均勻度對(duì)敷料性能有較大影響。若混合不均勻，可能導(dǎo)致敷料局部性能差異較大，影響其在傷口愈合中的應(yīng)用效果。在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步優(yōu)化混合工藝，如采用高速攪拌、超聲分散等方法，提高兩者的混合均勻度。同時(shí)，還可以探索不同的交聯(lián)劑和交聯(lián)方式，增強(qiáng)膠原蛋白與雞蛋殼膜之間的結(jié)合力，進(jìn)一步提升敷料的力學(xué)性能和穩(wěn)定性。靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料利用靜電紡絲技術(shù)，將雞蛋殼膜蛋白與絲素蛋白共混，制備出具有納米纖維結(jié)構(gòu)的敷料。在制備過程中，通過對(duì)雞蛋殼膜蛋白和絲素蛋白的提取、純化，以及對(duì)靜電紡絲參數(shù)的優(yōu)化，成功制備出了納米纖維直徑均勻、孔隙率高的復(fù)合納米膜。該敷料呈現(xiàn)白色薄膜狀，質(zhì)地輕薄，柔韌性好。在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)靜電紡絲參數(shù)如電壓、流速、噴頭與收集器之間的距離等對(duì)納米纖維的形態(tài)和性能影響顯著。電壓過高可能導(dǎo)致納米纖維直徑過小，甚至出現(xiàn)斷裂；流速過快則可能使納米纖維粗細(xì)不均，影響敷料的質(zhì)量。因此，在實(shí)際制備過程中，需要根據(jù)具體需求，精確控制這些參數(shù)。此外，還可以嘗試添加其他功能性成分，如抗菌劑、生長(zhǎng)因子等，進(jìn)一步拓展復(fù)合納米膜敷料的功能。同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料采用同軸電紡技術(shù)，制備出具有芯-殼結(jié)構(gòu)的敷料，用于糖尿病傷口的治療。在制備過程中，分別制備了皮層紡絲液和芯層紡絲液，通過同軸電紡使皮層紡絲液包裹芯層紡絲液，形成復(fù)合纖維。該敷料呈現(xiàn)半透明狀，顏色略帶微黃，具有較好的柔韌性和可塑性。在制備過程中，發(fā)現(xiàn)芯層和皮層紡絲液的配比、電紡參數(shù)以及藥物和生物活性成分的負(fù)載方式等對(duì)敷料性能影響較大。芯層和皮層紡絲液配比不當(dāng)可能導(dǎo)致芯-殼結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，影響藥物的釋放和敷料的治療效果。因此，需要深入研究這些因素之間的相互關(guān)系，優(yōu)化制備工藝，以獲得性能優(yōu)良的糖尿病傷口愈合敷料。還可以進(jìn)一步探索新型的芯層和皮層材料，以及更有效的藥物和生物活性成分負(fù)載技術(shù)，提高敷料的治療效果和安全性。5.2性能表征結(jié)果分析對(duì)三種基于雞蛋殼膜的生物敷料進(jìn)行了全面的性能表征，包括物理性能、化學(xué)性能和生物性能等方面，以下是對(duì)表征結(jié)果的詳細(xì)分析。在物理性能方面，通過外觀與結(jié)構(gòu)觀察以及厚度與力學(xué)性能測(cè)試，發(fā)現(xiàn)三種敷料呈現(xiàn)出不同的特性。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料質(zhì)地柔軟且具有一定韌性，這得益于膠原蛋白與雞蛋殼膜纖維相互纏繞形成的致密結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)不僅賦予了敷料良好的力學(xué)性能，使其能夠承受一定的外力而不易破損，還為細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)提供了豐富的位點(diǎn)。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料由直徑均勻的納米纖維組成，形成了高度多孔的結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)使其具有優(yōu)異的透氣性和吸水性，能夠有效地促進(jìn)傷口的氣體交換和滲出液的吸收，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供良好的環(huán)境。同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料具有典型的芯-殼結(jié)構(gòu)，外層的皮層纖維緊密排列，包裹著內(nèi)層的芯層纖維。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)使得敷料能夠在傷口愈合過程中緩慢釋放生物活性成分，實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病傷口的持續(xù)治療作用。在厚度方面，復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料相對(duì)較厚，靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料最薄，同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料厚度介于兩者之間。力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果顯示，復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料的拉伸強(qiáng)度和彈性模量較高，斷裂伸長(zhǎng)率適中，適合用于對(duì)力學(xué)性能要求較高的傷口；靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料拉伸強(qiáng)度較低，但斷裂伸長(zhǎng)率較高，柔韌性好；同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料力學(xué)性能則綜合考慮了芯層和皮層材料的特性，既能保證在使用過程中的穩(wěn)定性，又具備一定的柔韌性，以適應(yīng)傷口的動(dòng)態(tài)變化。在化學(xué)性能方面，通過成分分析和降解性能測(cè)試，進(jìn)一步了解了三種敷料的化學(xué)特性。傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）分析結(jié)果表明，復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料中存在膠原蛋白和雞蛋殼膜的特征峰，且兩者之間存在一定的相互作用，如氫鍵等，從而形成了穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料中，絲素蛋白和雞蛋殼膜蛋白的特征峰明顯，且隨著雞蛋殼膜蛋白含量的增加，相關(guān)特征峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料由于包含多種成分，其紅外光譜分析較為復(fù)雜，但通過對(duì)各成分特征峰的分析，可以確定敷料中各成分的存在，并初步判斷它們之間的相互作用情況。降解性能測(cè)試結(jié)果顯示，復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料在培養(yǎng)初期降解速率相對(duì)較慢，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，降解速率加快，能夠在傷口愈合的不同階段提供合適的支撐和保護(hù)作用。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料由于其高孔隙率的納米纖維結(jié)構(gòu)，比表面積大，在降解初期降解速率較快，隨著降解的進(jìn)行，降解速率逐漸減緩，更適合用于滲出液較多、愈合速度較快的傷口。同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料的降解性能受到多種因素的影響，在降解初期主要是外層皮層材料的緩慢降解，隨著時(shí)間的推移，皮層材料逐漸降解，內(nèi)層的藥物和生物活性成分開始釋放，同時(shí)也促進(jìn)了敷料的進(jìn)一步降解，能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放藥物和生物活性成分，實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病傷口的長(zhǎng)期治療作用。在生物性能方面，通過細(xì)胞相容性測(cè)試和抗菌性能測(cè)試，評(píng)估了三種敷料在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的安全性和有效性。細(xì)胞相容性測(cè)試結(jié)果表明，三種敷料對(duì)L929小鼠成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖均無明顯抑制作用，具有良好的細(xì)胞相容性。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞相對(duì)增殖率均較高，表明該敷料能夠?yàn)榧?xì)胞提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料組和同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料組的細(xì)胞相對(duì)增殖率在初期雖有一定波動(dòng)，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，說明細(xì)胞能夠在這兩種敷料表面較好地生長(zhǎng)和增殖?？咕阅軠y(cè)試結(jié)果顯示，三種敷料對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料表現(xiàn)出一定的抗菌活性，可能是由于其中含有的生物活性成分對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有抑制作用。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料抗菌性能較強(qiáng)，其納米纖維結(jié)構(gòu)可能增加了與細(xì)菌的接觸面積，有利于抗菌成分的發(fā)揮。同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料抗菌性能最為顯著，這得益于其負(fù)載的納米銀粒子等抗菌成分，能夠有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。三種基于雞蛋殼膜的生物敷料在物理、化學(xué)和生物性能方面表現(xiàn)出各自的特點(diǎn)，這些性能差異與它們的制備方法和成分密切相關(guān)。在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)傷口的類型和愈合階段，選擇性能匹配的敷料，以達(dá)到最佳的治療效果。5.3傷口愈合功能研究結(jié)果討論在傷口愈合功能研究中，通過建立小鼠皮膚創(chuàng)傷模型，對(duì)三種基于雞蛋殼膜的生物敷料的傷口愈合效果進(jìn)行了全面評(píng)估，包括傷口愈合過程監(jiān)測(cè)、組織學(xué)分析和分子生物學(xué)檢測(cè)等方面。從傷口愈合過程監(jiān)測(cè)的大體觀察和愈合面積測(cè)量結(jié)果來看，三種生物敷料均能有效促進(jìn)傷口愈合，且效果明顯優(yōu)于對(duì)照組。復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料能夠?yàn)閭谔峁┝己玫闹魏捅Ｗo(hù)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，從而加快傷口愈合速度。靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料憑借其高孔隙率和高比表面積的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，具有良好的透氣性和吸水性，能夠有效促進(jìn)傷口的氣體交換和滲出液的吸收，為細(xì)胞生長(zhǎng)創(chuàng)造有利條件，加速傷口愈合。同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料由于負(fù)載了生長(zhǎng)因子、藥物和納米銀粒子等多種生物活性成分，不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，還能有效抑制傷口感染，顯著加快了傷口愈合進(jìn)程，在三種敷料中表現(xiàn)最為突出。然而，在實(shí)驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)，不同敷料對(duì)傷口愈合的促進(jìn)作用在不同階段存在差異。在傷口愈合初期，復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料和靜電紡絲制備的復(fù)合納米膜敷料在減輕炎癥反應(yīng)、吸收滲出液方面表現(xiàn)較好；而在傷口愈合后期，同軸電紡制備的糖尿病傷口愈合敷料在促進(jìn)上皮化和組織重塑方面優(yōu)勢(shì)明顯。這提示在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)傷口的不同愈合階段選擇合適的敷料，以充分發(fā)揮其治療效果。組織學(xué)分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了三種生物敷料對(duì)傷口愈合的促進(jìn)作用。通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察發(fā)現(xiàn)，復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料實(shí)驗(yàn)組傷口組織中的炎癥細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，成纖維細(xì)胞開始大量增殖，可見一些新生血管形成，肉芽組織生長(zhǎng)較為活躍。靜電紡絲制備復(fù)合納米膜敷料實(shí)驗(yàn)組傷口組織的炎癥細(xì)胞進(jìn)一步減少，新生血管數(shù)量較多，肉芽組織生長(zhǎng)良好，細(xì)胞排列較為有序。同軸電紡制備糖尿病傷口愈合敷料實(shí)驗(yàn)組傷口組織中炎癥細(xì)胞極少，新生血管豐富，肉芽組織生長(zhǎng)旺盛，成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖明顯，傷口愈合進(jìn)程最快。這些結(jié)果表明，三種生物敷料能夠通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成等多種途徑，加速傷口愈合。但在組織學(xué)觀察中也發(fā)現(xiàn)，復(fù)合膠原蛋白蛋殼膜敷料在促進(jìn)上皮化方面相對(duì)較慢，可能是由于其結(jié)構(gòu)相對(duì)致密，對(duì)上皮細(xì)胞的遷移有一定的阻礙作用。因此，在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步優(yōu)化該敷料的結(jié)構(gòu)，提高其促進(jìn)上皮化的能力。分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果從基因和細(xì)胞因子水平揭示了三種生物敷料促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制。相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，三種生物敷料均能顯著上調(diào)與傷口愈合相關(guān)基因的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）等。MMP-1能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖；VEGF是一種重要的血管生成因子，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，為傷口愈合提供充足的血液供應(yīng)；TGF-β1在傷口愈合過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，加速傷口愈合。細(xì)胞因子含量測(cè)定結(jié)果表明，三種生物敷料均能夠在一定程度上抑制炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子如白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的釋放，同時(shí)促進(jìn)促分裂原如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）的分泌，從而促進(jìn)傷口愈