煙草及煙草制品主要大分子物質的測定第1部分纖維素、半纖維素1概述1.1項目背景大分子是指分子量在5000以上的生物學物質，煙草大分子物質主要有纖維素、半纖維素、木質素、果膠、淀粉、蛋白質，占煙葉重量30%左右。纖維素是由1000～10000個D-吡喃型葡萄糖基經β-1,4糖苷鍵聯(lián)結而成的直鏈多糖，其基本單位是纖維二糖基，鏈沿長軸組合在一起形成微纖維束，具有高度的穩(wěn)定性和抗化學降解能力。半纖維素成分較為復雜，包括多縮戊糖、多縮己糖等很多高分子糖，半纖維素也不溶于水，但是與纖維素不同，半纖維素具有溶于稀堿和易被酸水解的性質[1-4]。纖維素、半纖維素是煙草細胞壁的主要成分，約占煙葉、梗絲質量的10%~20%，同時也是再造煙葉的基片骨架，影響煙葉品質、加工性能和燃燒吸味[5.6]。它們對于煙葉的燃燒性能和煙絲的填充值以及卷煙的香吃味都有很直接的影響。蒲俊[7]等人的研究結果表明，纖維素含量與煙葉雜氣呈正相關，與香氣質、香氣量、余味、刺激性、燃燒性、灰色等其它指標呈負相關；半纖維素含量與煙葉的雜氣、余味呈正相關，與其余感官指標都呈負相關。纖維素和半纖維素含量高的煙葉具有強烈的刺激性，余味、燃燒性和香氣質均較差。劉曉冰[8]等考察了武陵山區(qū)烤煙上部葉片纖維素含量與質量指標間相關性。結果顯示，纖維素對煙葉外觀質量油分的影響顯著，纖維素含量高，則煙葉油分少，易破碎。隨著纖維素含量升高，煙葉香氣質、余味變差，香氣量降低，雜氣加重，刺激性增強，灰色變黑，煙葉整體感官質量降低。因此，無論是從煙葉質量評價、加工制造，還是從卷煙的煙氣改善、降焦減害，甚至加熱卷煙設計、制備等角度出發(fā)，準確測定煙草中的纖維素、半纖維素含量都具有十分重要的意義。國家局于2023年發(fā)布國煙科〔2023〕35號文件《國家煙草專賣局關于印發(fā)2023年度煙草行業(yè)標準項目計劃的通知》，由福建中煙作為牽頭單位，負責《煙草及煙草制品纖維素、半纖維素、木質素的測定》項目。2023年3月，國家煙草專賣局（甲方）與福建中煙工業(yè)有限責任公司（乙方）和標準項目協(xié)助管理單位-中國煙草標準化研究中心（丙方）為順利完成“煙草及煙草制品纖維素、半纖維素、木質素的測定”標準項目的研制任務，經協(xié)商一致，訂立了合同，合同的起止日期為2023年3月至2023年12月。1.2國內外研究簡介煙草中的纖維主要包含纖維素、半纖維素，兩者的結構組成存在較大差異。纖維素（Cellulose）：植物細胞壁的主要結構成分，通常與半纖維素、果膠和木質素結合在一起，其結合方式和程度對植物源食品的質地影響很大。圖1.纖維素結構半纖維素(Hemicellulose)：植物細胞壁中與纖維素共生，可溶于堿溶液，由D-木糖基、D-甘露糖基、D-半乳糖基、L-阿拉伯糖基等組成。目前，纖維組成的分析方法大致有三類：粗纖維法、纖維洗滌劑法和兩步酸解法[9~21]。其中，粗纖維法只能粗略地檢測出生物質中的纖維，無法分離出纖維素、半纖維素。纖維洗滌劑法于1963年由美國人VanSoest提出，方法基于酸性和中性洗滌劑的方法來分析纖維的組成，采用酸、堿與樣品依次共煮后用有機溶劑處理，再采用烘干稱重的方式進行測定，將不能酸化的殘渣為定義為中性洗滌纖維（NDF，主要包括幾乎全部的纖維素、半纖維素、木質素和少量的蛋白質），在酸性洗滌劑的作用下半纖維素亦被除去得到酸性洗滌纖維（ADF），后經過72％硫酸酸化得到的不溶物即為酸洗木質素（ADL）。2010年行業(yè)基于VanSoest方法的測定原理制定了《煙草及煙草制品中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸洗木質素的測定洗滌劑法》標準方法（YC/T347–2010）[22]，該方法所得檢測結果為中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維，與纖維素、半纖維素的實際組成存在一定的差異。兩步酸解法：采用濃硫酸在常溫下將纖維解離為低聚糖，稀釋并在高溫加壓條件下將低聚糖進一步酸解為單糖，單糖經離子色譜分離檢測后計算纖維素、半纖維素的含量，操作簡單、環(huán)保安全，被農業(yè)部《農業(yè)生物質原料纖維素、半纖維素、木質素測定》（NY/T3494-2019）[23]，國家能源局《木質纖維素類生物質原料化學成分的測定第5部分：纖維素、半纖維素、果膠和木質素的測定》NB/T34057.5-2017等標準引用借鑒。但由于煙草中的淀粉含量較高（5%左右），在酸解過程中也水解出與纖維素酸解一樣的單糖，干擾纖維素的準確測定，因此該標準不能直接用于煙草基質的檢測，需進行優(yōu)化改進。本項目基于兩步酸解法建立適用于煙草的纖維素、半纖維素含量的方法，彌補YC/T347、NY/T3494等標準的不足，為煙草中該類物質的檢測提供技術依據。1.3項目主要研究內容和技術路線1.3.1主要研究內容1、通過相關文獻調研和前期預研，擬定以兩步酸解法為前處理方法，將煙草中纖維素、半纖維素酸解為單糖，經分離檢測換算得到纖維素、半纖維素含量。2、對煙草和煙草制品同時進行分析和驗證，開展參數(shù)優(yōu)化與評價，具體包含：（1）在樣品處理環(huán)節(jié)，摸索煙草中的糖、淀粉等干擾去除手段；（2）在兩步酸解環(huán)節(jié)，優(yōu)化加熱方式、溫度和時間等酸解條件；（3）在儀器檢測環(huán)節(jié)，比較不同檢測方式并優(yōu)化檢測參數(shù)；（4）開展方法評價、行業(yè)實驗室間比對，擬定標準征求意見稿。1.3.2技術路線圖1技術路線圖2煙草及煙草制品中纖維素、半纖維素的測定2.1本標準適用范圍本標準方法規(guī)定了煙草及煙草制品中的纖維素、半纖維素含量的離子色譜測定方法。本標準方法適用于煙草及煙草制品中纖維素、半纖維素含量的測定。2.2實驗原理試樣依次采用80%乙醇-飽和氯化鈉溶液去除糖、90%二甲亞砜-水溶液去除淀粉等干擾后，加入72%硫酸溶液解聚，加水稀釋，高溫酸解，抽濾分離，得酸解濾液。采用離子色譜法測定酸解濾液中的單糖，以葡萄糖濃度計算纖維素含量，以阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖的濃度計算半纖維素含量。2.3實驗部分2.3.1主要試劑除非另有說明，在分析中使用分析純及以上的試劑。水應為蒸餾水或至少應達到GB/T6682三級水的水平。L?(+)?阿拉伯糖、D-半乳糖、D-(+)-木糖、D-甘露糖、葡萄糖，純度均≥99％。無水乙醇。二甲基亞砜。濃硫酸，98％（質量分數(shù)）。氫氧化鈉溶液，50％（質量分數(shù)）。醋酸鈉，99％。氯化鈉80％乙醇-飽和氯化鈉溶液：稱取64g氯化鈉于1000mL燒杯中，加入200mL水溶解，再加入800mL無水乙醇，混勻，加蓋靜置，待溶液澄清后過濾。090％二甲基亞砜-水溶液：移取900mL二甲基亞砜于1000mL容量瓶，用水定容。172％硫酸溶液：移取174mL水于1000mL燒杯中，緩慢加入326mL98％濃硫酸，攪拌，冷卻。2硫酸稀釋液：移取80μL72％硫酸溶液于1000mL容量瓶，用水定容。3200mmol/L氫氧化鈉溶液：移取10.4mL氫氧化鈉溶液于1000mL容量瓶，用水定容。410mmol/L氫氧化鈉溶液：移取50mL200mmol/L氫氧化鈉溶液于1000mL容量瓶，用水定容。5100mmol/L氫氧化溶液-1.0mol/L醋酸鈉溶液：稱取醋酸鈉20.5g于100mL燒杯中，用適量水超聲溶解，加入1.3mL氫氧化鈉溶液，轉移至250mL容量瓶，用水定容。6系列標準工作溶液：準確稱取8mg阿拉伯糖、12mg半乳糖、70mg葡萄糖、7mg木糖、10mg甘露糖于50mL燒杯中，精確至0.1mg，用硫酸稀釋液溶解，并定容于250mL容量瓶，分別移取100、200、400、800、1600μL于100mL容量瓶中，用硫酸稀釋液定容，配制成糖標系列標準工作溶液，即配即用。6微晶纖維素。7木聚糖。2.3.2儀器設備離心管，50mL。具塞錐形瓶，150mL。容量瓶，100mL、250mL、500mL、1000mL。定量加液器或移液管。玻璃棒。耐壓玻璃管，110mL，耐壓強度不小于0.6MPa。抽濾裝置。布氏漏斗。濾布，尼龍網，500目。0G4玻璃坩堝，30mL。1分析天平，感量0.1mg。2超聲波發(fā)生器，可加熱控溫，頻率37或40KHz。3離心機，適用50mL離心管，轉速不低于4000r/min。4恒溫水浴鍋。5防爆烘箱。6離子色譜儀，配電化學檢測器，工作電極：Au電極；參比電極：AgCl/Ag。7色譜柱：糖分析柱2.0mm×250mm，柱填料為疏水性高聚物薄殼型陰離子交換劑或其他等效柱；保護柱2mm×50mm。2.3.3樣品處理按YC/T31《煙草及煙草制品試樣的制備和水分測定烘箱法》制備試樣，并測定其水分含量。醇洗準確稱取試樣0.5g（質量記為m0）于50mL離心管中，加入40mL80%乙醇-飽和氯化鈉水溶液，超聲30min后4000r/min離心5min，棄上清液，得醇洗試樣。二甲基亞砜洗經醇洗后的試樣用70mL90%二甲亞砜-水溶液將沖洗至150mL錐形瓶，60℃超聲3h后，采用布氏漏斗和濾布抽濾，濾渣依次用水、無水乙醇各洗滌三次（每次約10mL），棄濾液，濾渣晾干后轉移至110mL耐壓玻璃管。兩步酸解在裝有濾渣的耐壓玻璃管中加入2.0mL72%硫酸溶液，玻棒攪勻，置于30℃恒溫水浴鍋酸解2h。水浴酸解后，在耐壓玻璃管中緩慢加入56mL水，旋緊蓋子，置于120℃烘箱中酸解2h，取出冷卻。抽濾定容冷卻后的酸解液經G4玻璃砂芯坩堝抽濾，用90℃～100℃熱水清洗耐壓玻璃管和濾渣至少3次，所得濾液轉移至250mL容量瓶，冷卻至室溫后用水定容。準確移取1.0mL于100mL容量瓶，用水定容，待測。2.3.4測試儀器條件以下分析條件可供參考，采用其他條件應驗證其適用性。——流動相A：水；——流動相B：200mmol/L氫氧化鈉溶液；——流動相C：100mmol/L氫氧化溶液-1.0mol/L醋酸鈉溶液；——流動相D：10mmol/L氫氧化鈉溶液；——流速：0.25mL/min；——進樣量：25μL；——溫度：20℃。電化學檢測器掃描電位采用脈沖點位波形如見表1所示。表SEQ表\*ARABIC1檢測波形時間/s電位/V(Ag/AgCl參比）積分0.000.1-0.200.1開始0.400.1結束0.41-2.0-0.42-2.0-0.430.6-0.44-0.1-0.50-0.1-流動相梯度洗脫程序如表2所示。表SEQ表\*ARABIC2高效陰離子色譜梯度洗脫程序時間/minA(%)B(%)C(%)D(%)-20.0010000-17.080002030.080002030.149501040.0305020046.03050200（溶液A:水;B:200mmol/LNaOH;C:1mol/LNaOAc-100mmol/LNaOH;D:10mmol/LNaOH）工作曲線繪制及樣品測定對系列標準工作溶液進行離子色譜測定，使用保留時間定性，外標法定量。根據所配標準溶液的濃度及其響應峰面積，建立各單糖的標準工作曲線，相關系數(shù)不低于0.99。如樣品濃度超出標準工作溶液濃度范圍，則應稀釋后再測定。按照離子色譜分析條件測定樣品溶液，每個樣品平行測試兩次。待測樣品應在72h內完成分析。數(shù)據處理試樣中以干基計纖維素Wce，半纖維素Whe含量，數(shù)值以質量分數(shù)（％）表示，按式（1）、（2）計算：Wce=Cglu×Whe=C式中：Cglu——葡萄糖檢測質量濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；Cgal——半乳糖檢測質量濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；Cman——甘露糖檢測質量濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；Cxyl——木糖檢測質量濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；Cara——阿拉伯糖檢測質量濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；0.9——葡聚糖、半乳聚糖和甘露聚糖脫水校正因子；0.88——木聚糖和阿拉伯聚糖脫水校正因子；V——定容體積，單位為毫升（mL）；F——定容后溶液稀釋倍數(shù)；m0——稱取試樣質量，單位為克（g）；w——水分含量，單位為質量分數(shù)（%）；Wce——纖維素含量，單位為質量分數(shù)（%）；Whe——半纖維素含量，單位為質量分數(shù)（%）。3結果與討論項目借鑒并對NY/T3494進行優(yōu)化改進，以滿足煙草基質要求，并提高標準可操作性。3.1儀器設備選擇3.1.1檢測儀器的選擇及優(yōu)化通過調研與實驗發(fā)現(xiàn)NY/T3494兩步酸解法推薦采用液相色譜-蒸發(fā)光散射或示差檢測[23]，這兩類檢測器除穩(wěn)定性、重現(xiàn)性差外[29]，檢測靈敏度低，樣品酸解液不能進行稀釋，酸濃度較大，待測過程纖維素、半纖維素的酸解產物糖會進一步轉化為糠醛等，影響檢測結果的準確性。除上述兩類設備外離子色譜利用其陰離子交換色譜柱對可溶性糖組分進行分離，脈沖安培檢測器進行檢測，無需衍生化，且方法靈敏度高，可實現(xiàn)對較低含量糖組分的定量檢測[30]，是當前行業(yè)內外糖檢測較常用手段。因此，項目組考察采用離子色譜法對酸解后的單糖進行分離檢測。陰離子交換色譜柱CarbopacPA10，既有快速分離單糖的特點，又具有較好的色譜分離度保障。PA10色譜柱在pH0~14時均能穩(wěn)定使用，實驗選用該色譜柱進行方法開發(fā)。表SEQ表\*ARABIC3單糖25oC下的解離系數(shù)(pKa)單糖pKa（25oC)甘露糖12.08木糖12.15葡萄糖12.28半乳糖12.39阿拉伯糖12.43由于中性單糖的pKa值在12左右如表3所示，實際上是弱酸，在高pH條件下，它們能部分電離為陰離子并在陰離子交換柱上保留并分離。由于甘露糖和木糖、半乳糖和阿拉伯糖的pKa值很接近，因此考察了不同NaOH淋洗液濃度對這幾個單糖的分離度以及峰形的影響，如圖2所示。結果表明：當NaOH淋洗液濃度為20mmol/L時，除了阿拉伯糖，其他幾個單糖幾乎重疊在一起，分離度很差；當NaOH濃度為10mmol/L時，阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖可以完全分離，但是峰形較差，而木糖和甘露糖重疊成一個峰；當NaOH淋洗液濃度從5mmol/L降低至3mmol/L，各單糖的保留時間逐漸增加，并且木糖和甘露糖的分離度逐漸提高，當NaOH濃度為2mmol/L時，5種單糖峰形對稱，并且達到了完全分離，且保留時間隨著pKa值的增大而減小。因此，在后面的實驗中，最終采用濃度為2mmol/L的NaOH洗脫液來分離單糖。圖2洗脫液中NaOH濃度對單糖分離的影響（注：1為阿拉伯糖、2為半乳糖、3為葡萄糖、4為木糖、5為甘露糖）3.1.2酸解設備的選擇NY/T3494兩步酸解法[23]推薦采用滅菌鍋加熱方式進行纖維的酸解反應，考慮到滅菌鍋在行業(yè)中普及率不高，項目組考查了烘箱加熱的可行性。兩步酸解采用滅菌鍋加熱方式進行纖維酸處理反應，由于反應結束后的降溫過程（降至80℃）需要至少1.5h，實際的酸解反應時間很難確定，因此采用烘箱加熱替代滅菌鍋加熱方式，考察加熱時間對酸解反應的影響。烘箱加熱方式下加熱時間對纖維酸解單糖、纖維二糖得率的影響如圖3所示：（注：圖中顯示的葡萄糖的量為其實際質量分數(shù)的1/10）圖3加熱時間對纖維酸解產物單糖和纖維二糖得率的影響結果表明：加熱（酸解反應）時間對纖維單糖、纖維二糖得率的影響非常大：①當加熱時間為15min時，葡萄糖平均得率為8.2%，木糖和甘露糖的平均得率分別為2.5%和1.0%，纖維二糖得率只有2.0%，說明普通加熱15min過程中，纖維只有一部分酸解成纖維二糖和單糖。②隨加熱時間延長，纖維二糖和單糖的得率增加，當加熱時間為60min時，纖維二糖的得率最大，而葡萄糖、木糖和甘露糖的得率分別為26.3%、6.5%和2.7%。③當加熱時間進一步延長時，纖維二糖的得率快速下降，加熱120min時，纖維二糖平均得率降至0.2%，同時，葡萄糖、木糖和甘露糖的得率分別上升至86.8%、7.5%和5.3%；說明在烘箱加熱條件下，纖維需反應120min左右才能水解徹底。④與其他單糖相比，葡萄糖得率受加熱時間影響更明顯，當加熱時間從60min增加到90min和120min時，其平均得率從26.3%分別增加至77.8%和86.8%，比其他單糖所需時間更長，這是由于纖維素結晶度高、抗水解性強，而其他單糖來源于具有無定形結構的半纖維素，與纖維素相比更容易水解。采用相對平均偏差分析了滅菌鍋、烘箱加熱方式下纖維酸解后單糖質量分數(shù)的差異，結果如表4所示：表4不同加熱方式對纖維酸解后單糖結果的影響糖烘箱（%）滅菌鍋（%）相對平均偏差%阿拉伯糖0.530.551.85半乳糖0.330.313.13葡萄糖77.0978.210.72木糖7.627.881.68甘露糖6.166.573.22結果表明：相對平均偏差結果＜5%，表明兩種酸解方式的實驗結果無顯著性差異，采用烘箱替代滅菌鍋加熱可行。3.2前處理條件優(yōu)化由于兩步酸解法是將纖維素酸解成葡萄糖，半纖維素酸解成半乳糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖，再用離子色譜-電化學檢測分析上述單糖來確定纖維素和半纖維素的含量，這就需要去除煙葉中原有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等可溶性糖的干擾。同時，淀粉在酸作用下也會水解成葡萄糖，且煙草中淀粉的含量與纖維含量相當，對纖維素的測定產生了干擾，需在不影響纖維素、半纖維素的情況下去除淀粉。因此，項目組參考借鑒相關標準和文獻，考察并優(yōu)化不同溶劑及方式對可溶性糖、淀粉的去除效果。3.2.1可溶性糖干擾的去除通過文獻調研發(fā)現(xiàn)，YC/T216-2013《煙草及煙草制品淀粉的測定連續(xù)流動法》中采用25mL80%乙醇-飽和氯化鈉溶液可洗去0.25g煙草樣品中色素、糖類和醌類等化合物的干擾[25]。但通過前期實驗發(fā)現(xiàn)樣品經除色素、蛋白質干擾的兩步萃取，剩余的骨架僅為原質量的40%～60%，為了提高檢測的準確性，需加大樣品稱樣量。因此，項目組借鑒YC/T216-2013對加大樣品稱樣量后的萃取劑用量進行考察。稱取A（烤煙）、B（白肋煙）、C（香料煙）、D（梗絲）樣品各0.5g分別加入30mL、30mL、40mL、50mL80%乙醇-飽和氯化鈉溶液超聲30min，借鑒標準YC/T251-2008[33]檢測萃取液中的葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等可溶性糖總量，結果如表5所示：表5醇洗不同體積中可溶性糖含量樣品不同萃取體積中可溶性糖含量（mg）20mL30mL40mL50mLA（烤煙）85.9123.6123.5123.6B（白肋煙）4.2C（香料煙）81.491.291.391.3D（梗絲）83.599.899.799.8由表5可知，不同類型煙葉中可溶性糖的量不一樣，隨著80%乙醇-飽和氯化鈉溶液萃取體積的增加，可溶性糖溶解的量也增加，在體積為30mL以上時，四種不同類型煙葉的可溶性糖基本被萃出。因此，為保證不同樣品可溶性糖完全去除干凈，項目組選擇40mL80%乙醇-飽和氯化鈉溶液超聲30min來去除可溶性糖的干擾。3.2.2淀粉干擾去除標準YC/T216-2013《煙草及煙草制品淀粉的測定連續(xù)流動法》中采用高氯酸萃取淀粉，但是樣品經過高氯酸處理后，樣品呈糊狀不利于后續(xù)抽濾等步驟，且在高濃度高氯酸環(huán)境下，纖維素、半纖維素有酸解可能，影響檢測結果。通過文獻調研發(fā)現(xiàn)[34-35]，能同時溶解直鏈、支鏈淀粉的溶劑，除高氯酸外，還有堿液、二甲基亞砜（DMSO）等。但淀粉在低濃度堿液中溶解性不佳，在高濃度堿液中又易發(fā)生降解。二甲基亞砜（DMSO）是一種含硫有機化合物，分子式為C2H6OS，常溫下為無色無臭的透明液體，具有高極性、高沸點、熱穩(wěn)定性好、非質子、與水混溶的特性，淀粉可溶于二甲基亞砜。但DMSO溶解淀粉時，淀粉易發(fā)生快速溶脹會阻止DMSO穿透整個淀粉顆粒，為提高淀粉在DMSO中的溶解性，使用DMSO溶解淀粉時需加入少量的水抑制淀粉顆粒凝膠層的形成，但是過量的水亦會阻止淀粉溶解，王瑞等[24]采用90%二甲基亞砜/水溶液50℃振蕩萃取12h淀粉萃取率可達97.15%以上。項目組借鑒該方法，并驗證、改進其在煙草中的應用效果。不同萃取方式對淀粉的萃取效果項目組根據文獻，采用90%二甲基亞砜/水溶液50℃溫度下振蕩萃取12h條件下萃取煙葉中的淀粉，考察是否萃取完全，同時采用超聲萃取的方式作為比較，考察兩種萃取方式對于煙葉中淀粉的萃取效果。稱取不同類型煙葉A（烤煙）、B（白肋煙）、C（香料煙）、D（梗絲）樣品各0.5g于150mL具塞三角瓶中，先用80%乙醇-飽和氯化鈉溶液除色素、糖等干擾物質，再加入90%二甲亞砜水溶液100mL，在50℃溫度下振蕩萃取4、8、12、16h，檢測萃取液中淀粉含量，結果如表6所示。同時只改變上述實驗條件萃取方式，采用超聲萃取，萃取時間分別為2、4、6、8、10h，檢測萃取液中淀粉含量，結果如表7所示：表6不同振蕩萃取時間的淀粉測定值樣品YC/T216測定值淀粉（%）4h8h12h16hA（烤煙）4.363.643.824.374.35B（白肋煙）0.900.770.880.890.87C（香料煙）6.254.855.436.246.30D（梗絲）1.050.861.091.051.07表7不同超聲萃取時間的淀粉測定值樣品YC/T216測定值淀粉（%）2h4h6h8h10hA（烤煙）4.363.454.164.334.404.37B（白肋煙）0.900.730.870.880.910.88C（香料煙）6.254.735.686.286.246.29D（梗絲）1.050.821.071.011.061.10結果表明：在50℃條件下，振蕩萃取12h，能完全萃取不同類型煙葉樣品中的淀粉，但是時間過長。同溫度條件下A烤煙、C香料煙煙葉超聲萃取6h，B白肋煙、D梗絲超聲4h就完全萃取出煙葉中的淀粉，因此，項目組將改進采用超聲萃取的方式來去除煙葉中的淀粉。不同萃取溫度和萃取時間對淀粉的萃取效果在確定萃取煙葉中淀粉的萃取方式后，考察不同萃取溫度55、60、65℃對淀粉的去除效果和對萃取時間的影響。稱取A（烤煙）、B（白肋煙）、C（香料煙）、D（梗絲）樣品各0.5g，不同溫度下各5平行，加入100mL90%二甲亞砜水溶液，分三組，分別在55、60、65℃水浴溫度條件下超聲萃取1、2、3、4、5h，取萃取液，檢測淀粉含量。結果見表8和圖4。表8.不同溫度和不同萃取時間下的淀粉測定值萃取劑溫度(℃）超聲萃取時間（h）淀粉（%）A（烤煙）B（白肋煙）C（香料煙）D（梗絲）5513.860.864.830.965524.040.875.761.035534.150.896.231.045544.370.886.241.035554.390.886.241.056014.070.884.861.036024.220.875.941.046034.370.886.231.056044.390.896.241.066054.380.886.241.066514.020.884.881.046524.240.886.021.046534.370.876.231.056544.360.886.241.066554.380.896.241.06圖4.不同萃取溫度萃取淀粉效果圖結果表明：隨著萃取溫度的升高，不同類型的煙葉樣品中淀粉的萃取時間縮短，且不同類型煙葉的完全萃取時間有所不同。白肋煙、梗絲中的淀粉由于其含量比較低，在較短的時間2h內就能被萃取完全?？緹?、香料煙在溫度55℃時，需萃取4h完全萃取煙葉中的淀粉；在溫度60、65℃時，需3h完全萃取煙葉中的淀粉。因此，項目組選擇60℃、3.0h作為超聲萃取參數(shù)。不同萃取體積對淀粉的萃取效果項目組進一步考察不同體積90%二甲基亞砜水溶液對淀粉的去除效果，在同一稱樣量（0.50g）條件下，稱取A（烤煙）、B（白肋煙）、C（香料煙）、D（梗絲）樣品，分別加入50、60、70、80mL90%二甲亞砜水溶液進行3.0h超聲萃取，每種體積每個樣品進行三平行實驗，檢測濾液和濾渣的淀粉含量，結果如表9、表10所示：表9.不同體積90%二甲亞砜濾液淀粉測定值萃取劑體積（mL）超聲萃取時間（h）濾液淀粉（%）A（烤煙）B（白肋煙）C（香料煙）D（梗絲）5034.060.874.911.046034.120.895.971.057034.370.886.241.058034.390.886.231.04表10.不同體積90%二甲亞砜萃取后濾渣淀粉測定值萃取劑體積（mL）超聲萃取時間（h）濾渣淀粉（%）A（烤煙）B（白肋煙）C（香料煙）D（梗絲）5030.32N.D1.32N.D6030.27N.D0.28N.D703N.DN.DN.DN.D803N.DN.DN.DN.D結果表明：隨著萃取試劑體積的增大，干擾物質淀粉逐漸被去除；當用90%二甲亞砜溶液70mL，萃取3.0h以上時，不同類型煙葉中的淀粉已被完全萃取。樣品濾渣已無淀粉檢出，說明樣品中的淀粉已被去除干凈。因此，按所用試劑盡可能少及高效率的原則，本方法采用70mL90%二甲亞砜水溶液60℃溫度下超聲3.0h的方式來去除樣品基體中淀粉的干擾。3.2.3酸解條件的優(yōu)化在煙葉細胞壁中，纖維素、半纖維素通過化學鍵形成結構牢固的化合物，采用酸水解是解離纖維素和半纖維素的常用方法。本方法參考NY/T3494兩步酸解法[23]，對濃酸、稀酸兩步酸解過程中的酸濃度、酸解時間和酸解溫度等關鍵影響因素進行優(yōu)化。由于不同類型煙葉、煙梗、薄片樣品經去除色素、糖、淀粉后，樣品的基質差別基本被消除，剩余的骨架進入酸解過程，而薄片樣品的纖維素、半纖維素含量較煙葉高，因此選擇薄片樣品來開展酸解條件部分的優(yōu)化。濃酸酸解酸度考察第一步濃酸酸解過程的酸濃度對于細胞壁的打開，纖維素、半纖維素的解離起著關鍵性的作用，因此分別采用2mL65%、70%、72%、75%、80%硫酸溶液進行酸解，其他不變（濃酸常溫階段：30℃水浴條件下酸解2小時；稀酸高溫階段：烘箱120℃條件下酸解2小時）結果如表11和圖5所示：表11不同酸度對纖維素、半纖維素測定結果的影響硫酸濃度（%）纖維素（%）半纖維素（%）6518.696.627019.026.777219.956.877518.936.108017.325.05圖5不同酸度對纖維素、半纖維素測定結果的影響由圖表可知：當酸度從65%升到72%時，纖維素、半纖維素的值緩慢升高，且在72%濃度時，纖維素、半纖維素的值達到最大值；在當酸度由75%升到80%時，二者都呈現(xiàn)下降趨勢，這是由于酸度過高易造成纖維素的炭化，造成纖維素、半纖維素結果偏低。通過本實驗確定72%硫酸溶液為合適的酸解濃度。濃酸酸解溫度考察為考察濃酸常溫過程溫度對纖維素、半纖維素結果的影響，樣品加入2mL72%硫酸溶液后分別在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃水浴條件下進行酸解，結果如表12和圖6所示：表12濃酸酸解溫度對纖維素、半纖維素測定結果的影響72%硫酸酸解溫度（℃）纖維素（%）半纖維素（%）2518.876.153019.956.513518.646.064017.375.334517.305.15圖6濃酸酸解溫度對纖維素、半纖維素測定結果的影響由圖表可知：隨著酸解溫度從25℃升到30℃，纖維素、半纖維素呈微量增長趨勢；酸解溫度30℃條件下，纖維素、半纖維素的結果最大；當酸解溫度升到35℃，40℃，45℃時，則出現(xiàn)明顯下降趨勢；實驗過程中也發(fā)現(xiàn)，當酸解溫度升到40℃后，樣品體系顏色明顯變深，出現(xiàn)結團不均勻現(xiàn)象，過高溫度可能導致煙葉樣品炭化，從而引起纖維素、半纖維素結果的偏低。因此選擇30℃作為濃酸酸解溫度條件。濃酸酸解時間考察為選擇濃酸常溫過程合適的酸解時間，樣品加入2mL72%硫酸溶液后分在30℃水浴條件下分別進行1.0、1.5、2.0、2.5、3.0小時酸解，結果如表13和圖7。表13濃酸酸解時間對纖維素、半纖維素測定結果的影響72%硫酸酸解時間（h）纖維素（%）半纖維素（%）1.014.974.801.516.456.202.019.346.752.517.676.173.016.195.68圖7濃酸酸解時間對纖維素、半纖維素測定結果的影響由圖表可知：酸解時間從1.0h增加到2.0h，纖維素、半纖維素呈逐漸增加趨勢，2.0h數(shù)值最大，超過2.0h則呈現(xiàn)明顯下降趨勢。說明，在酸解時間2.0h為合適時間，酸解時間過短，則纖維素、半纖維素未完全酸解，酸解時間過長，超過2.0h則酸解的單糖進一步的損失，導致了測量結果偏低。由此選擇2.0h作為濃酸酸解時間。稀酸酸解溫度考察為考察稀酸高溫過程溫度對纖維素、半纖維素結果的影響，將濃酸常溫酸解后樣品稀釋后分別在110℃、115℃、120℃、125℃、130℃烘箱條件下進行酸解，結果如表14和圖8所示：表14稀酸酸解溫度對纖維素、半纖維素測定結果的影響烘箱酸解溫度（℃）纖維素（%）半纖維素（%）11016.405.6911519.545.9912019.846.2612519.546.0913018.085.55圖8稀酸條件下酸解溫度對纖維素、半纖維素測定結果的影響由圖表可知：烘箱溫度從110℃升到120℃，纖維素、半纖維素的數(shù)值逐漸升高，且120℃時纖維素、半纖維素數(shù)值達到最大；110℃則酸解時間不夠，酸解不完全；而125℃時，酸解溫度過高，酸解的單糖進一步的損失，導致了測量結果偏低。因此選擇120℃作為稀酸酸高溫溫度條件。稀酸酸解時間考察為考察稀酸高溫過程酸解時間的影響，樣品濃酸常溫酸解稀釋后，分在120℃烘箱條件下分別進行1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h酸解，結果如表15和圖9所示：表15稀酸酸解時間對纖維素、半纖維素測定結果的影響烘箱酸解時間(h)纖維素（%）半纖維素（%）1.012.324.531.519.185.942.020.056.872.519.526.583.019.616.54圖9稀酸條件下酸解時間對纖維素、半纖維素測定結果的影響由圖表可以得出：酸解時間在1.0-2.0h時纖維素、半纖維素的數(shù)值逐漸升高，在2.0h時纖維素、半纖維素達到最大值；1.0-1.5h則酸解時間不夠，酸解不完全；而2.5h時，酸解時間過長，酸解的單糖進一步的損失，導致了測量結果偏低。因此選擇2.0h作為稀酸酸高溫時間條件。綜上所述兩步酸解的最優(yōu)條件為：72%硫酸在30℃水浴條件下酸解2小時；加水稀釋酸度降低后，在烘箱120℃條件下酸解2小時。3.3待測液穩(wěn)定性本部分采用JJF1343-2022《標準物質的定值及均勻性、穩(wěn)定性評估》[28]中有關穩(wěn)定性研究方法對檢驗數(shù)據進行評估。取95%的置信區(qū)間，若|b1|<t0.95,5×s(b1)，說明樣品的濃度對時間變量無明顯差異，樣品穩(wěn)定性良好。為考察樣品前處理后待測溶液的穩(wěn)定性，將待測液在室溫放置在0、3、6、9、18、36、72h后進樣。不同時間進樣后的測定結果如表16所示：結果表明，72h內樣品待測液中纖維素、半纖維素穩(wěn)定性良好。表16樣品待測溶液穩(wěn)定性考察放置時間（h）樣品待測液（%）纖維素半纖維素測定結果018.846.59318.616.53619.246.74918.976.791818.526.663619.416.727218.706.54統(tǒng)計結果RSD（%）1.751.54斜率，b1-0.001-0.003b018.906.67斜率不確定度，s（b1）0.020.69統(tǒng)計臨界值，t0.95,52.572.57t0.95,5×s（b1）0.041.77|b1|<t0.95,5×S（b1）通過通過3.4方法驗證3.4.1線性關系考察準確稱取糖標準樣品（阿拉伯糖8mg、半乳糖12mg、葡萄糖70mg、木糖7mg、甘露糖10mg，精確至0.1mg），用配制好的硫酸稀釋液溶解，然后轉移至250mL容量瓶內定容，配制成糖混合標準一級母液。用移液管分別移取100μL、200μL、400μL、800μL、1600μL至100mL容量瓶，用配置好的硫酸稀釋液定容于100mL容量瓶中，配制成標準工作溶液，即配即用。將系列標準溶液在相同條件下分別進樣后，所得的譜圖以及各單糖的定性見圖10，按時間順序分別為：阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖，木糖，甘露糖。以糖的濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，得到相應的線性方程以及相關系數(shù)，并且根據三倍信噪比(S/N=3)計算儀器檢出限。其線性關系和檢出限如表17、18所示。結果表明：各種糖具有非常好的線性關系，相關系數(shù)R2≥0.999，檢出限0.0022mg/L-0.0046mg/L。圖10單糖混標溶液的離子色譜圖（注：1.阿拉伯糖；2.半乳糖；3.葡萄糖；4.木糖；5.甘露糖；）圖11葡萄糖線性關系圖表17線性關系、相關系數(shù)、檢出限、定量限標準品線性回歸方程相關系數(shù)（R2）檢出限（μg/mL）定量限（μg/mL）阿拉伯糖y=3.273x-0.011070.99980.00220.0073半乳糖y=3.6158x-0.03140.99980.00360.0120葡萄糖y=4.4229x+0.06240.99980.00460.0153木糖y=4.0952x+0.00480.99970.00420.0140甘露糖y=2.3196x-0.02660.99900.00220.0073表18纖維素、半纖維素檢出限、定量限指標檢出限（%）定量限（%）纖維素（以葡萄糖計）0.020.07半纖維素（以木糖計）0.020.063.4.2樣品重復性用四種不同類型煙葉考察本方法的日內和日間重復性，每天5個平行測定，連續(xù)測定5天，結果如表19、表20所示：表19纖維素日內、日間重復性樣品時間12345日內平均值（%）日內RSD（%）日間平均值（%）日間RSD（%）A烤煙第一天6.266.056.396.386.226.262.226.292.64第二天6.136.546.316.216.386.312.51第三天6.346.486.252.48第四天6.245.956.046.126.016.071.85第五天6.366.556.496.636.646.531.76B白肋煙第一天6.566.456.396.686.226.462.696.521.98第二天6.436.846.616.716.586.632.30第三天6.376.596.816.546.446.552.58第四天6.546.056.346.526.216.333.29第五天6.636.536.796.836.416.642.65C香料煙第一天6.256.376.676.446.626.472.706.342.83第二天6.146.486.166.276.496.312.68第三天6.396.596.726.636.556.581.85第四天6.476.266.076.116.286.242.54第五天16.086.076.131.06D梗絲第一天11.5311.7311.7611.3811.9411.671.8611.471.24第二天11.1211.3911.2411.5911.6611.402.00第三天11.3711.6411.8011.5311.4611.561.44第四天11.3211.2111.1911.3811.4711.311.04第五天11.2511.4411.3711.4511.5211.410.90表20半纖維素日內、日間重復性樣品時間12345日內平均值（%）日內RSD（%）日間平均值（%）日間RSD（%）A烤煙第一天2.642.502.692.712.622.633.132.543.39第二天2.612.702.682.562.562.622.51第三天2.442.392.412.542.482.452.44第四天2.432.552.382.422.512.462.84第五天2.462.552.492.632.622.552.97B白肋煙第一天2.422.242.372.322.342.342.832.354.36第二天2.412.422.412.382.512.432.10第三天2.372.492.432.542.442.452.62第四天2.432.352.444.21第五天2.122.372.193.47C香料煙第一天2.492.592.622.522.612.572.252.602.58第二天2.452.612.482.562.522.522.52第三天2.692.732.662.712.692.700.97第四天2.472.672.622.582.562.582.89第五天2.552.762.582.642.662.643.08D梗絲第一天4.974.975.124.884.904.971.935.173.19第二天5.025.115.011.23第三天5.375.265.2361.29第四天5.124.985.055.135.355.132.71第五天5.255.445.375.455.525.411.89由表可知，測得纖維素日內、日間RSD≤2.83％、半纖維素的日內、日間RSD≤4.36％，說明本方法具有較好的重復性。3.4.3回收率實驗取不同類型煙草樣品分別加入高、中、低微晶纖維素、木聚糖按上述相關步驟分別進行5個平行加標實驗，結果如表21、表22所示，結果表明：微晶纖維素的回收率96.5-103.4%、RSD0.82-2.23%，木聚糖的回收率96.2-104.3%，RSD0.91-2.69%，說明方法的回收率和精密度良好。表21纖維素回收率及精密度（n=5）樣品樣品纖維素含量（mg）加入微晶纖維素量（mg）回收率（%）RSD（%）A（烤煙）31.915.498.3~101.21.2530.897.7~100.31.1461.698.2~101.61.36B（白肋煙）32.915.497.5~103.42.2330.898.3~99.20.8261.696.5~100.61.60C（香料煙）31.715.497.4~100.41.2830.897.8~102.71.8961.697.1~100.61.38D（梗絲）57.425.696.6~101.51.8751.298.6~102.41.51102.497.5~100.81.31表22半纖維素回收率及精密度（n=5）樣品樣品半纖維素含量（mg）加入木聚糖量（mg）回收率%RSD%A（烤煙）12.75.296.3~101.52.1610.496.5~100.91.7020.897.8~99.70.91B（白肋煙）11.85.297.1~104.32.6910.497.4~101.81.6420.898.5~102.81.71C（香料煙）13.25.296.2~102.52.3610.497.8~100.81.1520.898.6~101.21.16D（梗絲）25.410.497.5~102.11.7520.898.8~103.61.9541.698.2~101.51.303.5共同實驗項目組分別在福建中煙工業(yè)有限責任公司、上海煙草集團有限責任公司、鄭州煙草研究院、湖南中煙工業(yè)有限責任公司、重慶中煙工業(yè)有限責任公司、浙江中煙工業(yè)有限責任公司、內蒙古昆明卷煙有限責任公司等7個實驗室進行了方法的驗證比對實驗。實驗樣品共選用了8種不同類型的煙草樣品：其中1號為烤煙、2號梗絲、3號薄片、4號香料煙、5號白肋煙、6號雪茄煙、7號烤煙型成品卷煙、8號混合型成品卷煙。每個實驗室分別按照本方法進行樣品前處理和檢測，得到該實驗室的結果，結果見表23、表24。由表可見：7家實驗室的8個樣品的檢測結果RSD均在10%以內，表明各實驗室間數(shù)據比對良好。表23不同實驗室纖維素檢測結果和統(tǒng)計處理數(shù)據表（單位%）樣品編號實驗室1實驗室2實驗室3實驗室4實驗室5實驗室6實驗室7平均值RSD16.726.746.897.557.156.876.786.964.30211.9011.6312.5012.4912.0111.3911.8511.973.45318.9918.4619.3319.3618.5118.2618.5818.792.3546.446.386.507.266.366.126.736.545.5656.546.156.556.796.146.096.326.374.1567.086.957.277.466.286.066.706.837.5376.936.606.757.466.656.386.776.795.0287.307.307.417.717.046.697.007.214.58表24不同實驗室半纖維素檢測結果和統(tǒng)計處理數(shù)據表（單位%）樣品編號實驗室1實驗室2實驗室3實驗室4實驗室5實驗室6實驗室7平均值RSD12.812.922.923.012.922.932.842.912.3124.945.245.654.925.135.3036.496.446.786.476.413.0542.602.852.882.882.702.682.682.754.1552.852.392.562.532.242.322.292.468.6662.712.762.692.632.312.292.562.567.4772.682.772.632.782.542.482.512.634.6282.823.052.952.962.832.772.842.893.354結論項目最終確定的檢測步驟為：準確稱取樣品0.5g于50mL離心管中，采用40mL80%乙醇-飽和氯化鈉溶液去除可溶性糖等干擾，用70mL90%二甲亞砜溶液去除淀粉等干擾物質，加入2mL72％硫酸溶液30℃水浴解聚2.0h，再加入56mL水稀釋后于120℃烘箱中酸解2.0h，稀釋定容后，采用離子色譜法測定酸解液中的單糖，以葡萄糖濃度計算纖維素含量，以半乳糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖的濃度計算半纖維素含量。本方法各種糖的線性良好，R2＞0.999，檢出限0.0022mg/L-0.0046mg/L，滿足檢測要求；纖維素含量的日內、日間RSD≤3.29％，半纖維素含量的日內、日間≤4.36％，均小于5%，重復性好；微晶纖維素的回收率96.5-103.4%%、木聚糖的回收率96.2-104.3%，準確度高；可作為行業(yè)標準在煙草系統(tǒng)內推廣使用。參考文獻張力田．碳水化合物化學[M]．北京:輕工業(yè)出版社，1988,66．王瑞新.煙草化學[M].北京:中國農業(yè)出版社,2003.于建軍.卷煙工藝學[M].北京:中國農業(yè)出版社,2003,13-23.左天覺.煙草的生產、生理和生物化學[M].朱尊權,等.譯.上海:上海遠東出版社,1993:371-373.李興波,閆克玉,丁海燕,等.河南烤煙(40級)細胞壁物質含量及其規(guī)律性研究[J].鄭州輕工業(yè)學院學報,1999,14(3):27-30.閆克玉,閆洪洋,李興波,等.烤煙煙葉細胞壁物質的對比分析[J].煙草科技,2005(10):6-11.蒲俊,劉彥嶺.烤煙纖維素含量與煙葉品質的相關性研究[J].中國農業(yè)文摘:農業(yè)工程,2019,31(2):67-70.劉曉冰,孟霖,梁盟,等.武陵山區(qū)烤煙上部葉片纖維素、木質素含量與質量指標間相關性研究[J].中國農學通報,2015,31(7):235-240.張槐苓,葛翠英,穆懷靜,等.煙草分析與檢驗[M].鄭州:河南科學技術出版社,1994:103-111.郭小義,戴云輝,郭紫明,等.應用纖維素測定儀測定煙草中的纖維素[J].煙草科技,2009(1):43-46.廖臻,王嵐,蔣次清,等.煙草中總細胞壁物質含量的測定方法[P].中國:CN102221512A,2011-10-19.楊蕾,陶自偉,潘純祥,等.超聲和酶解除雜質法測定煙草中總細胞壁物質含量[J].中國煙草學報,2016,22(2):108-114.尚軍,呂祥敏,王鵬,等.流動分析法測定煙草中的纖維素[J].煙草科技,2012(7):40-42.張紅漫,鄭榮平,陳敬文,等.NREL法測定木質纖維素原料組分的含量[J].分析實驗室,2010,29(11):15-18.張文博,賀建龍,蔣浩,等.木質纖維物質中纖維素和半纖維素含量的測定[J].江蘇農業(yè)科學,2017,45(5):281-284.劉永剛,冉宜駿,高銘澤,等.桑葉中纖維素和木質素含量的測定[J].飼料研究,2019，42(7):58-60.王倩,宋曉霞,周帥,等.食用菌栽培基質中木質纖維素組分測定方法的建立[J].食用菌學報,2019,26(4):100-106.SchlotzhauerWS，SchmeltzI，HickeyLC.Pyrolyticformationofphenolsfromsomehighmolecularweighttobaccoleafconstituentsandrelatednon-tobaccomaterials[J].TobaccoScience，1967,11:31-34.SchlotzhauerWS，ChortykOT，HigmanHC，etal.Pyrolyticstudiesonfractionssequentiallyextractedfromtobacco[J].TobaccoNewYork，1969,13:153-155.SchlotzhauerWS，ChortykOT.Pyrolyticstudiesontheoriginofphenoliccompoundsintobaccosmoke[J].TobaccoScience,1981,25(6):6-10.ZaneA，WenderSH.Pyrolysisproductsofrutin,quercetin,andchlorogenicacid[J].TobaccoScience,1963,7:21-23YC/T347-2010煙草及煙草制品中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸洗木質素的測定洗滌劑法[S].NY/T3494-2019農業(yè)生物質原料纖維素、半纖維素、木質素測定[S].王瑞，田耀旗，謝正軍.玉米淀粉在DMSO/水體系中溶解性與精細結構變化[J].食品與機械,2017(3):27-30.YC/T216-2013煙草及煙草制品淀粉的測定連續(xù)流動法[S]．郭小義,戴云輝,郭紫明,等.應用纖維素測定儀測定煙草中的纖維素[J].煙草化學，2009(1)：43-46.孔蘭芬，侯英，潘純祥,等.重鉻酸鉀氧化-連續(xù)流動法測定煙草中纖維素含量[J].江西農業(yè)學報,2018,30(6):71-74.JJF1343-2022標準物質的定值及均勻性、穩(wěn)定性評估[S].RfelliG，SartiniE．Characterisationofbrewpubbeercarbohydratesusinghighperformanceanionexchangechromatographycoupledwithpulsedamperometricdetection[J].FoodChemistry,2014,142(1)：152-158．石彩玲,田俠,孫一鳴,等．離子色譜一脈沖積分安培法同時測定甘薯中10種可溶性糖組分[J].中國食品學報，2023,23(9)：324-328．SluiterA，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《煙草及煙草制品主要大分子物質的測定》第2部分木質素目錄TOC\o"1-4"\h\z\u1概述 11.1項目背景 11.2國內外研究情況 11.3項目主要研究內容和技術路線 31.3.1項目主要研究內容 31.3.2技術路線 42煙草及煙草制品中木質素含量的兩步酸解測定方法 42.1適用范圍 42.2實驗部分 42.2.1方法原理 42.2.2試劑與溶液 52.2.3儀器設備 52.2.4樣品前處理 6樣品制備 6醇洗 6二甲亞砜洗 6兩步酸解 7抽濾定容 72.2.5測試 7酸溶木質素測試 7酸不溶木質素測試 72.2.6結果的計算與表述 7結果計算 7結果表述 83結果與討論 93.1前處理的優(yōu)化 93.1.1色素干擾的去除 93.1.2蛋白質干擾的去除 10萃取劑的選擇 10萃取溫度的選擇 11萃取劑用量/萃取時間的選擇 113.1.3酸解條件的優(yōu)化 12濃酸酸解酸度考察 12濃酸酸解溫度考察 13濃酸酸解時間考察 14稀酸酸解溫度考察 15稀酸酸解時間考察 16酸解條件優(yōu)化結果 173.1.4標準溶液儲備液和樣品溶液穩(wěn)定性考察 17標準溶液儲備液穩(wěn)定性考察 17前處理后樣品溶液穩(wěn)定性考察 183.2方法驗證 193.2.1酸溶木質素標準曲線 193.2.2木質素檢測的重復性考察 193.2.3酸溶木質素回收率考察 203.2.4不同實驗室間比對實驗 214總結 22參考文獻 23煙草及煙草制品主要大分子物質的測定第2部分木質素1概述1.1項目背景大分子是指分子量在5000以上的生物學物質，煙草大分子物質主要有纖維素、半纖維素、木質素、果膠、淀粉、蛋白質，占煙葉重量30%左右。煙草木質素是煙草細胞壁的重要組成成分，在煙葉調制過程不斷發(fā)生降解，是影響煙葉原料質量的關鍵指標之一[1-3]。在卷煙抽吸過程中，木質素通過燃燒和熱裂解產生的脂肪族小分子醛類、乙酸、苯酚、一氧化碳、稠環(huán)芳烴等小分子化合物，是卷煙焦油中稠環(huán)芳香類、芳香胺和酚類等有害物質的主要來源，對卷煙的安全性有重要影響[4,5]。同時，木質素對感官質量的影響具有兩面性，在煙葉的調制和醇化階段，煙草中的木質素通過生化降解，產生一系列芳香族小分子致香成分，對煙草的吸食品質具有正面的影響；木質素也是一些香味化合物的前提物，抽吸過程中產生的香蘭素、苯甲醇等香味化合物，對卷煙感官評吸效果產生有益影響；同時卷煙抽吸過程中，煙草木質素熱裂解生成的酚類和脂肪族小分子醛類等物質，則帶來刺激、澀口的吃味，是影響煙草內在品質的不利因素。木質素含量越高，產生的青雜氣息、燒紙味越重[6-8]。綜上所述，煙草中的木質素是影響煙葉原料質量、感官品質的重要物質，對煙草中木質素進行準確測定并深入研究有利于卷煙產品質量的提升。1.2國內外研究情況（1）煙草木質素簡介煙草木質素是煙草細胞壁的重要組成成分，與纖維素、半纖維素共同構建形成了煙草植株的骨架[2]。煙草木質素與半纖維素以共價鍵結合，具有加固細胞壁機械強度，提高細胞運輸能力，增強煙株抗倒伏性以及抵御病原菌微生物侵害等生物學功能。閆克玉[8]等研究發(fā)現(xiàn)：同一產區(qū)同一品種煙葉，木質素含量隨煙葉部位的升高而降低，下部葉最高，中部居中，上部的最低，可能是由于下部煙葉所處的生長環(huán)境差，光合積累的營養(yǎng)物質較少，而且在煙葉成熟過程中一部分營養(yǎng)物質被輸送至中部葉和上部葉，致使木質素等細胞壁物質含量高。鄧宇[5]等研究也表明木質素含量影響卷煙香氣質、刺激性、雜氣，隨著木質素含量降低，香氣質明顯提升，雜氣、刺激降低，但其與勁頭不具有明顯相關性。因此，無論是從煙葉質量評價，還是從卷煙的煙氣改善、降焦減害，甚至加熱卷煙設計等方面出發(fā)，準確測定煙草中木質素含量具有十分重要的意義。（2）木質素結構木質素結構是復雜的有機聚合物，其在維管植物和一些藻類的支持組織中形成重要的結構材料，在木本植物中，木質素占25%，是世界上第二位最豐富的有機物（纖維素是第一位）[9]。由于自然界中木質素與纖維素、半纖維素等往往相互連接，形成木質素-碳水化合物復合體（Lignin-CarbohydrateComplex），故目前沒有辦法分離得到結構完全不受破壞的原本木質素。木質素（圖1）由一系列碳碳鍵和碳氧鍵形成三維網狀構成，結構上主要由三種羥基苯丙烷單體（圖2），即愈創(chuàng)木基丙烷（G基）、紫丁香基（S基）、對羥苯基丙烷（H基）經酶脫氫聚合形成[9]。在煙草植物體內，木質素與纖維素、半纖維素之間通過氫鍵、共價鍵等復雜形式結合在一起，這造成了對木質素的分離和準確測定極具挑戰(zhàn)性。圖1木質素結構圖2木質素的三種主要單體結構（3）木質素檢測技術進展木質素的測定方法有Klason法、紫外分光光度法、紅外光譜定量分析法和核磁共振法等[10-17]；煙草行業(yè)采用的標準方法《煙草及煙草制品中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸洗木質素的測定洗滌劑法》[18]，是改進后的Klason法，該方法先用酸性洗滌劑去除糖類、蛋白質、半纖維素及脂肪等成分后，再以72％的硫酸處理，最后測定未溶于酸的木質素含量，由于未測定酸處理過程溶于酸的木質素含量，導致該法測得結果偏小，無法反映木質素的實際含量[19]。同時該方法應用過程中存在：所用試劑高達13種(含高毒苯、易制毒丙酮和若干非常規(guī)試劑)，環(huán)保安全性低、使用受限；操作過程繁瑣(多次回流、洗滌、稱重)、實驗周期較長(16小時/批次)、無法批量測定（每批4個樣）?！掇r業(yè)生物質原料纖維素、半纖維素、木質素測定》（NY/T3494-2019）[13]等標準是基于兩步酸解法進行前處理，可以準確測定農作物秸稈木質素含量、操作簡單、環(huán)保安全；但由于煙草中的蛋白質含量較高[19]，干擾酸溶木質素的測定，因此該標準無法直接適用于煙草基質。綜上所述，木質素是影響煙葉質量和感官評吸的重要指標之一，在行業(yè)中有較大、較迫切的檢測需求。因此，項目組擬采用NY/T3494[13]的方法原理，在去除煙草基質中色素、蛋白質等干擾物質的基礎上，采用兩步酸解法進行前處理，即采用濃硫酸在常溫下將木質素解聚，酸度降低后在高溫條件下將木質素進一步降解、轉化，建立適用于煙草及煙草制品中木質素含量檢測的方法標準，為煙葉原料和卷煙產品的品質提升提供技術支撐。1.3項目主要研究內容和技術路線1.3.1項目主要研究內容1、通過相關文獻調研和前期預研，擬定以兩步酸解法為前處理方法，灰分法測定酸不溶木質素、紫外分光光度法測定酸溶木質素，兩者加和得到煙草中木質素的總量。2、對煙草和煙草制品同時進行分析和驗證，開展參數(shù)優(yōu)化與評價，具體包含：（1）在樣品前處理環(huán)節(jié)：摸索煙草中的色素、蛋白質等干擾去除手段；（2）在兩步酸解環(huán)節(jié)，優(yōu)化酸度、溫度和時間等酸解條件；（3）開展方法評價、行業(yè)實驗室間比對，擬定標準征求意見稿。1.3.2技術路線在前期研究工作的基礎上，確立的項目技術路線如圖3所示：酸溶木質素酸溶木質素方法重復性方法驗證方法精密度方法線性關系建立煙草木質素檢測方法調研與選擇前處理方法優(yōu)化基質干擾的去除調研與選擇檢測方法改進酸不溶木質素圖3項目的技術路線2煙草及煙草制品中木質素含量的兩步酸解測定方法2.1適用范圍本方法規(guī)定了煙草及煙草制品中主要大分子物質木質素含量的兩步酸解測定方法。本方法適用于煙草及煙草制品中主要大分子物質木質素含量的測定。2.2實驗部分2.2.1方法原理試樣依次采用80%乙醇-飽和氯化鈉溶液去除色素、90%二甲亞砜-水溶液去除蛋白質等干擾后，加入72%硫酸溶液解聚，加水稀釋，高溫酸解，抽濾分離。濾液采用紫外分光法測定酸溶木質素，濾渣經干燥、灰化，采用質量法測定酸不溶木質素。2.2.2試劑與溶液除非另有說明，在分析中僅使用分析純及以上的試劑，以及符合GB/T6682規(guī)定的一級水。水應為蒸餾水或至少應達到GB/T6682三級水的水平。木質素，純度≥99%。無水乙醇。濃硫酸，98%（質量分數(shù)）。二甲基亞砜。氯化鈉。80%乙醇-飽和氯化鈉水溶液：稱取64g氯化鈉于1000mL燒杯中，加入200mL水溶解后，再加入800mL無水乙醇，混勻，加蓋靜置，待溶液澄清后過濾。90%二甲基亞砜-水溶液：移取900mL二甲基亞砜于1000mL容量瓶，用水定容。72%硫酸溶液：移取174mL水于1000mL燒杯中，緩緩加入326mL98％濃硫酸，攪拌，冷卻。0硫酸稀釋液：移取1.6mL72%硫酸溶液于1000mL容量瓶，用水定容。1酸溶木質素標準儲備液：準確稱取木質素標樣100mg（精確至0.1mg）于100mL燒杯中，用硫酸稀釋液溶解，轉移至100mL容量瓶定容，得到濃度為1mg/mL酸溶木質素標準儲備液，于4℃避光條件下，有效期為1個月。2酸溶木質素系列工作標準溶液：分別移取200、400、600、800、1000μL酸溶木質素標準儲備液于100mL容量瓶，用硫酸稀釋液定容，配制成酸溶木質素系列標準工作液，即配即用。2.2.3儀器設備紫外分光光度計。分析天平，感量0.1mg。超聲波發(fā)生器，可加熱控溫，頻率37/40KHz。離心機，適用50mL離心管，轉速不低于4000r/min。防爆烘箱。馬弗爐。恒溫水浴鍋。抽濾裝置。布氏漏斗。0濾布，尼龍網，500目。1G4玻璃砂芯坩堝，30mL。2容量瓶，10mL、100mL、250mL、500mL、1000mL。3定量加液器或移液管。4具塞錐形瓶，150mL。5離心管，50mL。6玻璃棒。7耐壓玻璃管，110mL，耐壓強度不小于0.6MPa。8干燥器。9燒杯，100mL、1000mL。2.2.4樣品前處理樣品制備按YC/T31《煙草及煙草制品試樣的制備和水分測定烘箱法》制備試樣，并測定其水分含量。醇洗準確稱取試樣0.5g（質量記為m0）于50mL離心管中，加入40mL80%乙醇-飽和氯化鈉水溶液，超聲30min后4000r/min離心5min，棄上清液，得醇洗試樣。二甲亞砜洗將經醇洗后的試樣用70mL90%二甲亞砜-水溶液沖洗至150mL錐形瓶，60℃超聲3h。采用布氏漏斗和濾布抽濾，濾渣依次用水、無水乙醇各洗滌三次（每次約10mL），棄濾液，濾渣晾干后轉移至110mL耐壓玻璃管。兩步酸解在裝有濾渣的耐壓玻璃管中加入2.0mL72%硫酸溶液，玻棒攪勻，置于30℃恒溫水浴鍋酸解2h。水浴酸解后，在耐壓玻璃管中緩慢加入56mL水，旋緊蓋子，置于120℃烘箱中酸解2h，取出冷卻。抽濾定容冷卻后的酸解液經G4玻璃砂芯坩堝抽濾（抽濾前，坩堝預先在575℃馬弗爐中灼燒至恒重），用90～100℃熱水清洗耐壓玻璃管和濾渣至少3次，坩堝帶濾渣待處理。所得濾液轉移至250mL容量瓶，冷卻至室溫后用水定容。準確移取2.0mL于10mL容量瓶，用水定容待測。2.2.5測試酸溶木質素測試采用紫外分光光度計在205nm波長下測定標準工作溶液和試樣溶液的吸光值[11]，外標法進行定量。根據所配標準溶液的濃度及其吸光值，建立標準工作曲線，線性相關系數(shù)不低于0.99。若樣品濃度超出標準工作溶液濃度范圍，則稀釋后測定。待測液24h內測試完成。酸不溶木質素測試將帶濾渣的坩堝置于烘箱，在105℃條件下烘3h～4h至恒重[13]，移至干燥器內冷卻至室溫后準確稱量，坩堝和濾渣總質量記為m1。將烘干后帶濾渣的坩堝置于馬弗爐中，在575℃條件下灼燒至少3.0h[13]，直至所有有機物被灰化?；一Y束后降溫至105℃，取出坩堝放入移至干燥器內冷卻至室溫后準確稱量，坩堝和灰分的總質量記為m2。2.2.6結果計算與表述結果計算.1酸溶木質素試樣中以干基計酸溶木質素含量，以質量分數(shù)（%）表示，按式（1）計算：ASL=A×V×Dm0×10式中：ASL——試樣中酸溶木質素含量，單位為質量分數(shù)（%）；m0——稱樣量，單位為克（g）；A——濾液中酸溶木質素濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；V——濾液定容體積，單位為毫升（mL）；D——濾液定容后溶液的稀釋倍數(shù)；w——試樣水分含量，單位為百分數(shù)（%）。.2酸不溶木質素試樣中以干基計酸不溶木質素含量，以質量分數(shù)（%）表示，按式（2）計算：AIL=(m1式中：AIL——試樣中酸不溶木質素含量，單位為質量分數(shù)（%）；m0——稱樣量，單位為克（g）；m1——玻璃砂芯坩堝和酸不溶殘渣的質量，單位為克（g）；m2——玻璃砂芯坩堝和灰分的質量，單位為克（g）；w——試樣水分含量，單位為百分數(shù)（%）。.3木質素總量試樣中木質素總含量，以質量分數(shù)（%）表示，按式（3）計算：Lig=ASL+AIL………（3）式中：Lig——試樣中木質素總含量，單位為質量分數(shù)（%）；ASL——試樣中酸溶木質素含量，單位為質量分數(shù)（%）；AIL——試樣中酸不溶質素含量，單位為質量分數(shù)（%）。結果表述取兩次平行測定結果平均值作為最終測試結果，精確至0.01%。兩次平行測定結果相對平均偏差不應大于10%。3結果與討論3.1前處理的優(yōu)化3.1.1色素干擾的去除煙草中含有植物色素等，對酸溶木質素的紫外測定產生干擾，此外糖類、脂類等物質也影響后續(xù)的抽濾過程。通過文獻調研發(fā)現(xiàn)，YC/T216-2013《煙草及煙草制品淀粉的測定連續(xù)流動法》采用25mL80%乙醇-飽和氯化鈉溶液可洗去0.25g煙草樣品中色素、糖類和醌類等化合物的干擾[20]。但通過前期實驗發(fā)現(xiàn)樣品經除色素、除蛋白質干擾兩步萃取除去可溶物，剩余的骨架大約在40%～60%，為了提高檢測的準確性，需加大樣品稱樣量。因此，項目組借鑒YC/T216-2013對加大樣品稱樣量后的萃取劑用量進行考察。稱取0.5g試樣，分別加入20mL、30mL、40mL、50mL80%乙醇-飽和氯化鈉溶液，超聲萃取30min。分別再加入30mL、20mL、10mL、0mL80%乙醇-飽和氯化鈉溶液，混勻過濾后準確移取1mL用80%乙醇溶液-飽和氯化鈉稀釋定容到100mL，采用紫外分光光度計測定其在205nm下的吸光值A0，結果如表1、圖4所示：表1不同萃取體積的選擇樣品吸光值A020mL30mL40mL50mLA(烤煙)0.38550.53710.54070.5432B(白肋煙)0.42170.57160.57680.5820C(香料煙)0.38060.52090.52060.5254D(梗絲)0.32940.37840.37820.3791圖4不同萃取體積的選擇結果表明：隨著萃取試劑體積的增大，萃取液的吸光值逐漸升高；當萃取劑體積達30~50mL，萃取液的吸光值趨于穩(wěn)定。因此，項目組采用40mL80%乙醇-飽和氯化鈉溶液超聲的條件去除樣品中色素等干擾。3.1.2蛋白質干擾的去除萃取劑的選擇由于煙草蛋白質等組分在200~220nm附近有紫外吸