ICS65.020.01

CCSB04

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2995—2023

牧草中抗壞血酸的測定

鄰苯二胺熒光法

Determinationofascorbicacidinforagegrass

o-phenylenediaminefluorometry

2023-05-11發(fā)布2023-06-11實施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2995—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAM/TC19）歸口。

本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心、烏海市農(nóng)畜

產(chǎn)品質(zhì)量安全中心、錫林郭勒盟農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究所、阿拉善盟農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心。

本文件主要起草人：王文曦、吳洪新、云穎、康博洋、盈盈、劉宇寧、湖日爾、張燕東、趙麗君、

劉鵬斌、李潤航、朝魯孟、劉江英、劉洪林、衛(wèi)媛、降曉偉、趙志惠、李坤娜、李薇、付慧。

I

DB15/T2995—2023

牧草中抗壞血酸的測定測定

鄰苯二胺熒光法

1范圍

本文件規(guī)定了新鮮牧草中的抗壞血酸鄰苯二胺熒光光度的測定方法。

本文件適用于新鮮牧草中抗壞血酸的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T14699.1飼料采樣

GB/T20195動物飼料試樣的制備

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

試樣L(+)-抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為L(+)-脫氫抗壞血酸后，與鄰苯二胺反應(yīng)生成有熒光的喹唔啉，

其熒光強(qiáng)度與L(+)-抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，以此測定試樣中L(+)-抗壞血酸總量。

5試劑和材料

冰乙酸(CH3COOH)：濃度約為30%。

偏磷酸(HPO3)n：含量(以HPO3計)不小于38%。

乙酸鈉(CH3COONa)。

硼酸(H3BO3)。

鄰苯二胺(C6H8N2)。

酸性活性炭粉：稱取約200g活性炭粉（75μm～177μm），加入1L鹽酸（1+9），加熱回流

1h～2h，過濾，用水洗至濾液中無鐵離子為止，置于110℃～120℃烘箱中干燥10h，備用。檢驗

鐵離子方法：利用普魯士藍(lán)反應(yīng)。將20g/L亞鐵氰化鉀與1%鹽酸等量混合，將上述洗出濾液滴入，如

有鐵離子則產(chǎn)生藍(lán)色沉淀。

偏磷酸-乙酸溶液：稱取15g偏磷酸,加入40mL冰乙酸及250mL水，加溫，攪拌使之逐漸溶解，

冷卻后加水至500mL于4℃冰箱可保存7d～10d。

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DB15/T2995—2023

乙酸鈉溶液(500g/L)：稱取500g乙酸鈉，加入水溶解至1000mL，冷卻后，儲存于聚乙烯瓶中。

硼酸-乙酸鈉溶液：稱取3g硼酸，用500g/L乙酸鈉溶液溶解并稀釋至100mL，臨用時配制。

鄰苯二胺溶液(200mg/L)：稱取20mg鄰苯二胺，用水溶解并稀釋至100mL，臨用時配制。

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品：抗壞血酸（C6H8O6）純度不小于99%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)

物質(zhì)。

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000μg/mL）：準(zhǔn)確稱取適量的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用偏磷酸-乙酸溶液

（5.7）溶解并配制成（1000μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，該貯備液在2℃～8℃避光條件下可保存一周。

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)工作液(100.0μg/mL):準(zhǔn)確吸取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液10.0mL，

用偏磷酸-乙酸溶液（5.7）稀釋至100mL，臨用時配制。

水為GB/T6682規(guī)定的二級水。

6儀器和設(shè)備

熒光分光光度計：具有激發(fā)波長338nm及發(fā)射波長420nm。配有1cm四通比色皿。

分析天平：感量0.01mg和0.01g。

組織勻漿機(jī)。

7試樣制備

按照GB/T14699.1中有關(guān)規(guī)定采集樣品，去雜質(zhì)后充分混勻，按照GB/T20195制備試樣，新鮮樣品

利用四分法取樣后，充分破碎作為分析樣品。制備好的試樣及時檢測。

8測定步驟

提取

稱取試樣5g～10g（精確至0.01g，取樣量視含量而定）于100mL的玻璃燒杯中，用偏磷酸-乙酸

溶液（5.7）將其轉(zhuǎn)至100mL的容量瓶中，定容至刻度，搖勻，為樣液，另吸取10.0mL抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)工

作液（5.13）于100mL的容量瓶中，定容至刻度，搖勻，為標(biāo)準(zhǔn)液，將樣液和標(biāo)準(zhǔn)液分別全部轉(zhuǎn)移至200

mL具塞錐形瓶中，加入2g活性炭（5.6），用力振搖1min，過濾，棄去最初數(shù)毫升濾液，分別收集其

余全部濾液，即為試樣氧化液和標(biāo)準(zhǔn)氧化液，待測定。

測定

8.2.1分別準(zhǔn)確吸取5.00mL試樣氧化液于兩個50.0mL容量瓶中，作為“試樣液”和“試樣空白液”。

8.2.2分別準(zhǔn)確吸取5.00mL標(biāo)準(zhǔn)氧化液于兩個50.0mL容量瓶中，作為“標(biāo)準(zhǔn)液”和“標(biāo)準(zhǔn)空白液”。

8.2.3于“試樣空白液”和“標(biāo)準(zhǔn)空白液”中各加2.5mL硼酸-乙酸鈉溶液（5.9），混合搖動15min，

用水稀釋至50.0mL，在4℃冰箱中放置2h～3h，取出待測。

8.2.4于“試樣液”和“標(biāo)準(zhǔn)液”中各加2.5mL的500g/L乙酸鈉溶液（5.8），用水稀釋至50.0mL，

待測。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)液氧化液[L(+)-抗壞血酸質(zhì)量濃度10μg/mL]0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、

分別置于10mL具塞刻度試管中,用水補(bǔ)充至2.0mL。另準(zhǔn)確吸取“標(biāo)準(zhǔn)空白液”2.0mL于10mL帶蓋刻

2

DB15/T2995—2023

度試管中。在暗室迅速向各管中加入5.0mL鄰苯二胺溶液（5.10），振搖混合，在室溫下反應(yīng)35min，

于激發(fā)波長338nm、發(fā)射波長420nm處測定熒光強(qiáng)度。以“標(biāo)準(zhǔn)液”系列熒光強(qiáng)度分別減去“標(biāo)準(zhǔn)空白

液”熒光強(qiáng)度的差值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的L(+)-抗壞血酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算直線回

歸方程。

試樣的測定

分別準(zhǔn)確吸取2.0mL“試樣液”和“試樣空白液”于10mL具塞刻度試管中，在暗室迅速向各管中

加入5.0mL鄰苯二胺溶液（5.10），振搖混合，在室溫下反應(yīng)35min，于激發(fā)波長338nm、發(fā)射波長420

nm處測定熒光強(qiáng)度。以“試樣液”熒光強(qiáng)度減去“試樣空白液”的熒光強(qiáng)度的差值于標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得

或回歸方程計算測定試樣溶液中L(+)-抗壞血酸總量。

平行實驗

按上述步驟，對同一試樣進(jìn)行平行試驗測定。

注：整個測定過程應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。

9結(jié)果計算和表示

試樣中抗壞血酸含量X按式（1）計算：

C×V100

X=×?×………………(1)

m1000

式中：

X——試樣中L(+)-抗壞血酸的總量，單位為毫克每百克（mg/100g）；

C——待測樣液中L(+)-抗壞血酸的質(zhì)量濃度，單位為微克（μg）；

V——熒光反應(yīng)所用試樣體積，單位為毫升(mL)；

F——試樣溶液的稀釋倍數(shù)；

100——換算系數(shù)；

M——實際檢測試樣質(zhì)量，單位克(g)；

1000——換算系數(shù)。

結(jié)果用2次平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字