ICS65.020.30CCSB43NXSLX寧夏飼料工業(yè)協(xié)會團體標準T/NXSLX0210—2025牛肌內(nèi)脂肪細胞外泌體分離鑒定技術(shù)規(guī)程Technicalspecificationforisolationandidentificationofbovineintramuscularadipocyteexosomes2025-11-7發(fā)布 2025-12-7實施寧夏飼料工業(yè)協(xié)會??發(fā)布T/NXSLX0210T/NXSLX0210—2025前 言本文件按照GB/T《標準化工作導則 第1部分標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草則》的規(guī)定起草。本文件某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由寧夏大學提出。本文件由寧夏飼料工業(yè)協(xié)會歸口。本文件起草單位：寧夏大學、寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所、海原縣科學技術(shù)局、固原富民農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司、平羅縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局。本文件主要起草人：魏大為、馬藝倫、張久盤、龔紅芳、馬云、顧自春、張桂杰、宋雅萍、姜超、焦若普、楊東梅、張娟、蔡蓓、張令鍇、胡亞美、聶路瑋、劉源、田平、何學良、李川霞、咸海龍。IT/NXSLX0210T/NXSLX0210—2025PAGEPAGE1牛肌內(nèi)脂肪細胞外泌體分離鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了牛肌內(nèi)脂肪細胞外泌體分離鑒定技術(shù)的術(shù)語和定義、技術(shù)要求、衛(wèi)生與安全要求及數(shù)據(jù)記錄與報告。本文本適用于牛肌內(nèi)脂肪細胞外泌體的分離與鑒定。規(guī)范性引用文件（且相關(guān)動物實驗按照GB/T35892標準執(zhí)行）。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T35892實驗動物福利倫理審查指南GB/T37864生物樣本庫質(zhì)量和能力通用要求GB/T27425科研實驗室良好規(guī)范GB/T42398細胞培養(yǎng)潔凈室設(shè)計技術(shù)規(guī)范GB/T38477基因表達的測定蛋白印跡法術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。牛原代肌內(nèi)脂肪細胞BovinePrimaryIntramuscularAdipocytesγ、FABP4無外泌體胎牛血清條件培養(yǎng)基ConditionedMediumwithExosome-DepletedFBS使用預先去除了外泌體的胎牛血清所配制的細胞培養(yǎng)基（15%的無外泌體FBS+1%的100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素+84%的DMEM培養(yǎng)基）。技術(shù)要求樣品采集GB/T35892GB/T37864細胞分離細胞實驗室的建設(shè)、管理與運行應嚴格遵循GB/T27425與GB/T42398標準的要求。組織樣本經(jīng)PBS清洗3次后剪成約1mm3的小塊。將組織塊均勻貼附于細胞培養(yǎng)瓶底，間距約0.5-1cm；于細胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）倒置培養(yǎng)1h待組織塊略干燥后，輕輕加入細胞生長培養(yǎng)基（含10%FBS）繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細胞遷出情況。消化傳代與純化當原代肌內(nèi)脂肪細胞沿著組織塊遷出并鋪滿瓶底約80%0.25%并通過差速貼壁法進行純化。細胞鑒定通過油紅O染色法與BODIPY熒光染色法對牛肌內(nèi)脂肪細胞中的脂滴含量進行檢測。外泌體收集用細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基置換70%PBS215%FBS37℃、5%CO?48h~72h。上清收集收集細胞培養(yǎng)液，4℃2000×g10min，0.22μm-80℃凍存（1。外泌體的分離采用超速離心法的方式：取出濾液后依次進行500×g離心10min收集上清、10,000×g離心30min去除大顆粒、100,000×g超速離心70min，最終獲得外泌體沉淀。外泌體的純化4100,000×g70min。棄去上清，所得沉淀即為純化的牛肌內(nèi)脂肪細胞外泌體。外泌體質(zhì)量鑒定形態(tài)學鑒定采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察。外泌體應呈現(xiàn)典型的杯狀或雙凹圓盤形形態(tài)。粒徑與濃度鑒定使用納米顆粒跟蹤分析儀（NTA）或動態(tài)光散射儀（DLS）進行檢測。主要顆粒的峰值粒徑應分布在30nm-150nm范圍內(nèi)。蛋白濃度：采用BCA蛋白定量試劑盒檢測，外泌體懸液蛋白濃度應≥0.5mg/mL。標志物鑒定外泌體標志物的鑒定應按照GB/T38477中的規(guī)定進行。通過WesternBlot檢測，其陽性標志物CD9（膜蛋白）、CD63（膜蛋白）和TSG101（胞質(zhì)蛋白）均應呈現(xiàn)特異性陽性條帶。衛(wèi)生與安全要求實驗室的生物安全管理應嚴格遵循GB19489標準的全部要求。數(shù)據(jù)記錄與報告詳見附錄A。T/NXSLX0210T/NXSLX0210—202511