燦爛弧菌刺激后刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液的免疫應(yīng)答比較研究摘要：隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，刺參病害問題日趨嚴(yán)重，目前常見的疾病主要包括腐皮綜合征、口圍腫脹癥、爛邊癥、爛胃病等。其中腐皮綜合征已成為刺參養(yǎng)殖業(yè)最常見也是危害最嚴(yán)重的疾病，而燦爛弧菌是引起養(yǎng)殖刺參腐皮綜合征的主要病原菌，該株細(xì)菌能夠在溫度較低的環(huán)境中生長。為研究燦爛弧菌刺激后刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液的免疫應(yīng)答差異，本文以燦爛弧菌為刺激源,采取體腔注射方式感染刺參，通過酶學(xué)技術(shù)分別對刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液上清中的酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的免疫酶活進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示，燦爛弧菌刺激后，不同時間點(diǎn)內(nèi)刺參體腔液上清和波里氏囊內(nèi)液體上清的ACP、AKP、CAT和SOD都是顯著不同的(P﹤0.05)。在ACP活力測定中，波里氏囊內(nèi)體腔液ACP在早期免疫應(yīng)答中可能起著更重要的作用。在AKP活力測定中，感染前期體腔內(nèi)體腔液AKP呈現(xiàn)了持續(xù)性顯著升高，具備更迅速的應(yīng)答力，后期波里氏囊內(nèi)體腔液AKP更快速的發(fā)揮作用。在CAT活力測定中，在感染病原菌前期,波里氏囊內(nèi)體腔液CAT不斷升高，后期體腔內(nèi)體腔液CAT顯著增高。在SOD活力測定中，刺參體腔內(nèi)體腔液與波里氏囊內(nèi)體腔液內(nèi)SOD，在抵御燦爛弧菌刺激的過程中，無明顯差異。這說明SOD在體腔和波里氏囊內(nèi)都占據(jù)了一個主要的地位。關(guān)鍵詞：刺參；燦爛弧菌；波里氏囊；體腔液；免疫相關(guān)酶Acomparativestudyontheimmuneresponsesofthebodycavityfluidofjaponicusanditsbursaaftervibrioresplendentstimulation.Abstract:Withtheexpansionofthescaleoffarming,trepangdiseaseproblemisincreasinglyserious,thecurrentcommondiseasesincludingsoyasheetsyndrome[14],mouthswellingaround,rotten,suchasdisease,stomachtroubleside,therottingskinsyndromehasbecomeatrepangaquacultureisalsoharmthemostseriousillness.Themostcommonandbrilliantvibrioisthemainpathogenicbacteriainaquaculturetrepangrottingskinsyndrome,thestrainsofbacteriacangrowinlowtemperatureenvironment,inordertounderstandthesplendidvibriostimulation,Trepangcavityandwavemagnitudeofcoelomicfluidinsidebursaofacidphosphatase(ACP),alkalinephosphatase(AKP),catalase(CAT),superoxidedismutase(SOD)ofthechange,thisarticlestimuli,trepangbrilliantvibrioinfectioninbodycavityinjectionwaytrepang,respectivelythroughenzymatictechnologyresearchtrepang'spouchcoelomicfluidcavityandwaveresponse,theimmuneresponseandcomparetheirdifferences,soastostudywavemagnitudeofsacfunctioninthetrepangsplendidvibrioinfectioninthereply.Keywords:Apostichopusjaponicus;Brilliant

vibrio;Polianvesicle;Coelomicfluid;Immune-relatedenzymes

目錄TOC\o"1-3"\h\u第一章文獻(xiàn)綜述 61.1刺參的概況 錯誤!未定義書簽。1.1.1刺參 錯誤!未定義書簽。1.1.2刺參的養(yǎng)殖 錯誤!未定義書簽。1.1.3刺參的發(fā)展史 錯誤!未定義書簽。1.1.4刺參在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的地位 錯誤!未定義書簽。1.2刺參體腔液 錯誤!未定義書簽。1.2.1體腔液 錯誤!未定義書簽。1.2.2刺參體腔液 錯誤!未定義書簽。1.2.3刺參體腔液的效用 錯誤!未定義書簽。1.2.4體腔液的研究 錯誤!未定義書簽。1.3燦爛弧菌 錯誤!未定義書簽。1.3.1燦爛弧菌的概念 錯誤!未定義書簽。1.3.2燦爛弧菌國內(nèi)外的研究進(jìn)展 錯誤!未定義書簽。1.3.3燦爛弧菌在刺參養(yǎng)殖中的危害 錯誤!未定義書簽。1.4刺參的免疫防御系統(tǒng) 41.4.1刺參的細(xì)胞免疫 41.4.2刺參的體液免疫 51.5研究目的及意義 錯誤!未定義書簽。第二章實(shí)驗(yàn)部分 錯誤!未定義書簽。2.1實(shí)驗(yàn)材料 錯誤!未定義書簽。2.1.1實(shí)驗(yàn)動物 錯誤!未定義書簽。2.1.2菌懸液的制備 錯誤!未定義書簽。2.1.3實(shí)驗(yàn)器材 62.2實(shí)驗(yàn)方法 62.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 62.2.2刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液的收集與處理 62.2.3刺參體腔液上清的免疫酶活力測定 72.2.4數(shù)據(jù)分析 7第三章實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 83.1燦爛弧菌刺激后刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液ACP活力比較 83.2燦爛弧菌刺激后刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液AKP活力比較 93.3燦爛弧菌刺激后刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液CAT活力比較 103.4燦爛弧菌刺激后刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液SOD活力比較 錯誤!未定義書簽。3.4討論 14第四章結(jié)論與展望 錯誤!未定義書簽。4.1結(jié)論 錯誤!未定義書簽。4.2展望 15參考文獻(xiàn) 錯誤!未定義書簽。致謝 19第一章文獻(xiàn)綜述1.1刺參的概況1.1.1刺參刺參(Apostichopusjaponicus)隸屬于棘皮動物門，是海參綱中后口動物的一種，是無脊椎動物的一種，其與脊索動物最為相似。除此之外，刺參也是中國海珍品養(yǎng)殖之中必不可少的一部分，其高昂的經(jīng)濟(jì)價(jià)值使其成為現(xiàn)今中國海水養(yǎng)殖品種之中不可或缺也是產(chǎn)值最高的品種[1]。1.1.2刺參的養(yǎng)殖刺參在其養(yǎng)殖過程中存在以下特點(diǎn)：1、池塘營養(yǎng)物質(zhì)單一化；2、食物鏈短；3、餌料的殘留、刺參的排泄廢棄物以及部分有機(jī)體的分解容易引發(fā)水體的污染[5]。在養(yǎng)殖期間，為了保證養(yǎng)殖水體的良好水質(zhì)，需要定期進(jìn)行大量的換水,從而導(dǎo)致水體透明度較高，與之相對的是水體表層有機(jī)物質(zhì)含量相較于底層數(shù)量少,細(xì)菌總數(shù)也少，底層水體中細(xì)菌總量受到底泥表層細(xì)菌的影響,顯現(xiàn)出的情況是細(xì)菌數(shù)量顯著高于表層。附著基作為特殊的池塘部分，是細(xì)菌繁殖的天然場所，在它之上附著有大量的底棲生物附著[6]。刺參養(yǎng)殖池塘的底泥中含有大量的刺參排泄物、殘餌以及一些大型藻類的殘?bào)w,這種環(huán)境與細(xì)菌的生長繁殖相得益彰,底泥中滋生大量細(xì)菌也便是應(yīng)有之意了。刺參攝食范圍比較雜亂，沒有明確的選擇性[3]，會選擇在池塘底層攝入大量的底泥、有機(jī)物質(zhì)以及大量的細(xì)菌，另外刺參的腸道中存在大量穩(wěn)定細(xì)菌菌群，其功能是輔助消化[4]，從而導(dǎo)致腸道中細(xì)菌數(shù)量較多。刺參腸道與養(yǎng)殖環(huán)境中菌群變化的影響因素有以下幾點(diǎn)：1、水體中浮游生物2、水溫3、無機(jī)營養(yǎng)鹽4、刺參的攝食活動情況。細(xì)菌數(shù)量隨著水溫的變化進(jìn)行變化，兩者的趨勢趨于相同，大部分異養(yǎng)細(xì)菌其新陳代謝能力受到溫度的影響,這也是細(xì)菌季節(jié)性變化的重要因素之一[1]，除此之外，水溫影響的范圍也包括刺參攝食與生理活動，這能夠間接影響刺參腸道與養(yǎng)殖環(huán)境中菌群的變化。在秋季9月份的時候，池塘的水溫大致在20℃左右,刺參結(jié)束夏蟄開始了活動與攝食,而在10月份的時候，天氣轉(zhuǎn)涼，水溫下降到18℃左右，刺參的生命活動跡象開始頻繁起來，攝食、活動活躍，這導(dǎo)致這一時間段池塘開始沉積大量的刺參排泄物，細(xì)菌的增長也因此有了足夠的營養(yǎng)物質(zhì)。10月份也是養(yǎng)殖投餌的主要時間段，大量殘留的未被刺參攝食的殘餌也提供了營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)了細(xì)菌的增殖，大大增加了細(xì)菌的數(shù)量。時間轉(zhuǎn)到11月份，水溫漸漸降低，刺參開始了正常的冬眠活動，其代謝水平和繁殖能力也處于一個低谷期，與之相對應(yīng)的是細(xì)菌的數(shù)量開始逐漸的下降。而到了冬季12月份的時候，水溫處于一個較低的狀態(tài)，大概在6℃左右，刺參處于冬眠時期，低溫條件對細(xì)菌的繁殖和有機(jī)物質(zhì)的分解都起到了抑制的作用。這個時候細(xì)菌的含量將顯著低于11月，最終在1月份2℃,的水溫條件下細(xì)菌數(shù)量達(dá)到低谷[7-9]。而在來年開春的時間點(diǎn)，3月份或4月份隨著溫度的爬升，細(xì)菌數(shù)量也逐漸的增加。一直持續(xù)到6月份、7月份左右，這個時候水體表層中細(xì)菌數(shù)量有受到水溫或者水體有機(jī)物的影響而下降。1.1.3刺參的發(fā)展史棘皮動物體腔細(xì)胞的研究始于1900年左右[1]，一開始是集中于光學(xué)顯微鏡下的表觀形態(tài)學(xué)觀察,隨著近年來科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外相繼利用單克隆抗體、熒光標(biāo)記及分子生物學(xué)技術(shù)對棘皮動物體腔細(xì)胞的形態(tài)、功能和發(fā)生進(jìn)行了逐一深入研究，其研究對象主要集中于海參、海星和海膽。1.1.4刺參在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的地位最近一段時間以來，與中國蓬勃發(fā)展的刺參產(chǎn)業(yè)相對比的是其養(yǎng)殖技術(shù)的粗糙和泛化[2]。在刺參養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量日漸增漲的現(xiàn)今時段，各種不同的問題卻逐漸顯現(xiàn)出來，種質(zhì)的降低，病害的頻發(fā)，環(huán)境的污染和市面上產(chǎn)品品質(zhì)的降低等等問題都成為了制約刺參養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的因素。最直接的體現(xiàn)就是即使是同一品種同一批次出塘的刺參，顯著差異的規(guī)格會導(dǎo)致價(jià)格的巨大差異從而直接影響到經(jīng)濟(jì)效益。造成這種差異的原因分為內(nèi)因和外因，外因方面有：1、密度；2、社會等級；3、物理接觸[3]，內(nèi)因主要是刺參個體差異導(dǎo)致的免疫力有所差異[1,4]，但具體有關(guān)于免疫力高低與刺參自身生長性能方面之間的關(guān)系目前尚無定論。有感于此國內(nèi)外多個專家對不同大小，不同規(guī)格的野生和養(yǎng)殖刺參免疫力相比較，在體腔細(xì)胞密度、數(shù)量及免疫酶活性等方面進(jìn)行差異分析，以期能夠探明刺參個體質(zhì)量、生活環(huán)境和其免疫力之間的相互作用，也為了能更好的對刺參自身免疫機(jī)制進(jìn)行明確，從而為建立刺參免疫指標(biāo)提供基礎(chǔ)試驗(yàn)依據(jù)。1.2刺參體腔液1.2.1體腔液眾所周知，體腔細(xì)胞作為棘皮動物的重要組成部分，一直擔(dān)任著棘皮動物的免疫系統(tǒng)核心成分。它所包括的功能不僅僅是是細(xì)胞免疫的承擔(dān)者，同時也提供了體腔液免疫因子[10]。在棘皮動物的體腔中有類似于淋巴的體腔液，其功能也類似淋巴，參與了體腔液的免疫反應(yīng)，是一種類似于白細(xì)胞的存在。有研究指出，體腔細(xì)胞的數(shù)量能對棘皮動物自身的健康狀況和機(jī)體免疫能力有相應(yīng)程度的正反饋[11]。1.2.2刺參體腔液刺參體腔并不是中空的，它的內(nèi)部環(huán)境之中充斥著體腔液,而在體腔液之中存在著各種不同種類的體腔細(xì)胞。刺參由于其特殊的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致外物可以直接進(jìn)入體腔之中，甚至可以直接與與刺參體相接觸，所以對應(yīng)的后果是體腔細(xì)胞在抵御外來異物的侵入等免疫反應(yīng)的作用得到了凸顯。1.2.3刺參體腔液的效用刺參體腔液中含有部分免疫反應(yīng)的重要因子和免疫酶等[12]，所以它在免疫防御中也起到了至關(guān)重要的作用[13]。在這些免疫因子和免疫酶之中，有幾種尤為重要,堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等為刺參體液免疫中重要的幾種免疫酶類，其活性高低可在部分程度上對刺參的免疫力進(jìn)行反映[14]。1.2.3體腔液的研究體腔液免疫是刺參為數(shù)不多的能夠?qū)Σ『θ肭诌M(jìn)行防御的有效手段，作為其主要的免疫防御，體腔液也一直是刺參最重要的免疫組織之一。在體腔液之中有各種各樣的免疫因子，其中包括溶血素、活性酶、凝集素、和類補(bǔ)體物質(zhì)等[10-11,15-17]。研究表明，在水產(chǎn)動物的內(nèi)部尤其是體腔液以及血細(xì)胞之中含有大量與免疫防御功能相關(guān)的酶類(如溶菌酶、磷酸酶、過氧化物酶、脂酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶等)，而這些免疫相關(guān)酶的酶解過程就是將外來有害病原體在刺參體內(nèi)進(jìn)行消除降解的過程，我們通過內(nèi)部和外部相結(jié)合的手段可以有效調(diào)節(jié)動物體內(nèi)酶的水平，從而能夠相應(yīng)的影響到機(jī)體本身的免疫能力[15]。ACP和AKP酶是刺參體內(nèi)兩種重要的水解酶類，ACP酶在刺參的免疫系統(tǒng)中起著調(diào)理素的作用，它可以誘導(dǎo)刺參體腔細(xì)胞中的阿米巴細(xì)胞對外來的物質(zhì)進(jìn)行吞噬作用，ACP活性可以代表刺參體內(nèi)體腔細(xì)胞清除異物的能力[16]。1.3燦爛弧菌1.3.1燦爛弧菌的概念弧菌是海水養(yǎng)殖一直以來的難題之一，它能夠大面積的引起海水養(yǎng)殖魚類的細(xì)菌性疾病。除此之外，弧菌引發(fā)的疾病有著以下2種特點(diǎn)：1、流行面積廣2、發(fā)病率高。所以弧菌感染一直是養(yǎng)殖業(yè)的巨大隱患和危害之一，也一直是我們水產(chǎn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[17]。燦爛弧菌(Vibriosplendidus)可以分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型兩種，但是這兩種生物型都具有致病性。莫照蘭等[18]把從孵化14d患腹水癥的牙鲆苗中分離的病原菌鑒定為燦爛弧菌生物Ⅱ型，人工感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)它對牙鲆苗具有很強(qiáng)的致病性病原菌革蘭氏染色陰性，桿狀，有1根很長的極生單鞭毛，菌體大小為(0.7-1.0)×(1.8-2.0)μm，在2216E培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h的菌落圓形、半透明，直徑約1.0mm，在TCBS的菌落呈黃色，直徑約2.0mm，對弧菌抑制劑O/129(150μg/ml)敏感，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)酸、不產(chǎn)色素。1.3.2燦爛弧菌國內(nèi)外的研究進(jìn)展?fàn)N爛弧菌刺激后，酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力顯著升高，而超氧化物歧化酶、溶菌酶和酚氧化酶活力顯著降低；哈維氏弧菌刺激后,酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶和酚氧化酶活力顯著升高，堿性磷酸酶活力變化不規(guī)律；假交替單胞菌刺激后，酸性磷酸酶、溶菌酶和酚氧化酶活力顯著升高，超氧化物歧化酶活力先升高后降低，堿性磷酸酶活力變化不規(guī)律[19]；溶壁微球菌刺激后，酸性磷酸酶和酚氧化酶活力顯著升高，超氧化物歧化酶活力先升高后降低,溶菌酶活力先升高后降低，而后在72h恢復(fù)至對照水平,堿性磷酸酶活力變化不規(guī)律；停乳鏈球菌刺激后，除堿性磷酸酶活力在4h有所下降外,其余免疫相關(guān)酶活力均顯著升高[19,20]。在對仿刺參體腔液抗菌特性研究中發(fā)現(xiàn)，仿刺參體腔液上清對溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)的生長有明顯的抑制作用，而對燦爛弧菌(Vibriosplendidus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonasnigrifacien)和停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)的生長無明顯影響[21,22]。1.3.3燦爛弧菌在刺參養(yǎng)殖中的危害刺參疾病的多發(fā)季節(jié)在秋冬兩季，而在進(jìn)行優(yōu)勢菌分析的時候發(fā)現(xiàn)這兩季的弧菌數(shù)量與異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量比例達(dá)到了一個非常高的比例，尤其是在3、4月份也就是春季的時候，這個比例極大的提高，這說明了在刺參池塘的位置生長的一些弧菌具有極強(qiáng)的低溫耐受能力，而且鑒定之后發(fā)現(xiàn)，冬季和春季兩季均發(fā)先大量的燦爛弧菌。燦爛弧菌是引起養(yǎng)殖刺參"腐皮綜合征"的主要病原菌，該株細(xì)菌能夠在溫度較低的環(huán)境中生長。在多數(shù)情況下，燦爛弧菌與刺參腸道內(nèi)的益生菌也就是芽孢桿菌處于一個動態(tài)平衡的狀態(tài)。但是當(dāng)處于低溫狀態(tài)的時候，刺參自身的免疫力下降，導(dǎo)致抵抗力減弱，這時環(huán)境變化會使細(xì)菌菌群失衡，部分低溫致病菌繁殖迅速，從而引發(fā)疾病[23]。生態(tài)養(yǎng)殖是漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保證，而益生菌是生態(tài)養(yǎng)殖之中不可或缺二點(diǎn)一部分，利用益生菌來改善養(yǎng)殖環(huán)境、調(diào)節(jié)養(yǎng)殖動物腸道中菌群組成能有助于我們更好的進(jìn)行生態(tài)養(yǎng)殖[24-26]。1.4刺參的免疫防御系統(tǒng)1.4.1刺參的細(xì)胞免疫刺參隸屬于棘皮動物門海參綱，其缺少專門的防御屏障[11],只存在非特異性免疫系統(tǒng)[11-13]，其免疫應(yīng)答是由體腔細(xì)胞和多種體液免疫因子共同介導(dǎo)的，主要是對進(jìn)入體內(nèi)的異物進(jìn)行識別、降解、排除以及對傷口創(chuàng)面進(jìn)行修復(fù)[12]。近年來關(guān)于海參體腔細(xì)胞類型的研究主要集中于仿刺參，其分類依據(jù)圍繞體腔細(xì)胞的形態(tài)、大小及細(xì)胞內(nèi)的顆粒情況[11-13]，研究方法采用光學(xué)顯微鏡下的表觀形態(tài)學(xué)觀察。1.4.2刺參的體液免疫刺參體腔液之中含有各種相關(guān)的體液免疫因子，這些體液免疫因子有其必不可少的作用，它們能夠?qū)ν鈦砦镔|(zhì)進(jìn)行識別和攻擊。這些體液免疫因子包括不同類型的凝集素、溶血素、水解酶、類白介素、類補(bǔ)體樣因子等[18]。有研究表明仿刺參體腔液、體腔液上清液和體腔細(xì)胞中存在總補(bǔ)體溶血活性和補(bǔ)體類似物AjC3、AjC4[19,20]，表明仿刺參體內(nèi)存在有脊椎動物的補(bǔ)體類似物,且其活性與正常人補(bǔ)體活性相似。名稱作用凝集素受傷或包囊外源入侵者后維持機(jī)體正常運(yùn)作溶血素與靶細(xì)胞接觸后形成空洞而裂解靶細(xì)胞補(bǔ)體機(jī)體免疫防御機(jī)制的重要組成部分，對消除外來抗原的侵害和維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡具有重要作用1.5研究目的及意義刺參是我國北方沿海地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種[1]，冬、春低溫季節(jié)是刺參疾病的多發(fā)季節(jié)，大部分水產(chǎn)之中所使用的微生物制劑基本都是從陸地生物的腸道乃至于其養(yǎng)殖環(huán)境之中進(jìn)行分離所得到的[20,25]，所以會有類似于不耐受低溫和不完全適應(yīng)于刺參養(yǎng)殖環(huán)境之類的弊端。為了解決這種弊端，我們選擇從刺參自身入手，從它的疾病多發(fā)的時期也就是低溫的秋冬季節(jié)進(jìn)行土著益生菌的篩選這樣的篩選結(jié)果也許更加有利于對刺參疾病的防控。刺參體腔細(xì)胞是刺參主要的免疫反應(yīng)效應(yīng)器，在抵御外來異物入侵等免疫反應(yīng)中起到了不可或缺的作用。隨著刺參養(yǎng)殖行業(yè)的逐步發(fā)展，尤其是集約化養(yǎng)殖的普遍,養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的病害和種質(zhì)退化的現(xiàn)象也日益增多[8,24]。加強(qiáng)刺參自身免疫力的研究已經(jīng)刻不容緩，本研究就燦爛弧菌刺激后刺參體腔細(xì)胞的應(yīng)答響應(yīng)入手，旨在從其自身免疫反應(yīng)效應(yīng)器出發(fā)為研究促進(jìn)刺參免疫力的產(chǎn)品提供指導(dǎo)意見，從而推動整個刺參養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色化、健康化添磚加瓦[22]。波里氏囊作為海參水管系統(tǒng)的附屬物，過去普遍認(rèn)為其主要功能是調(diào)節(jié)水管系統(tǒng)內(nèi)壓力，但隨著生物技術(shù)的發(fā)展，其生物學(xué)功能逐漸被重新認(rèn)識。近年來研究證實(shí)：海參波里氏囊具有造血功能,在海參體腔細(xì)胞生成中起著關(guān)鍵性作用；波里氏囊對異物刺激可表現(xiàn)出明顯的炎癥反應(yīng)，有研究者甚至推測其在功能上類似于脊椎動物免疫器官—"淋巴結(jié)"。越來越多的研究證據(jù)表明，波里氏囊在海參免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，然而當(dāng)有病原微生物侵染時,海參波里氏囊會表現(xiàn)怎樣的應(yīng)答反應(yīng)，其是否參與海參的抗感染免疫尚不清楚[27]。實(shí)驗(yàn)部分2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)動物刺參購于山東省青島市某水生動物養(yǎng)殖基地，體重為(65.2±5.3g)，于鹽城工學(xué)院計(jì)算機(jī)樓養(yǎng)殖間的水族箱中充氣暫養(yǎng)，水溫16-18℃,鹽度30‰-31‰，pH8.2-8.4，定時換水，一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.1.2菌懸液制備實(shí)驗(yàn)以燦爛弧菌為刺激源,將細(xì)菌在28℃180r/min的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期后,取細(xì)菌培養(yǎng)懸液12000rpm/min,4℃離心2min，棄上清，用TSA液體培養(yǎng)基重懸細(xì)菌沉淀至終濃度為2×108cfu/ml，用于刺參腹腔注射刺激。2.1.3實(shí)驗(yàn)器材恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)、-80℃超低溫冰箱、解剖盤、解剖刀、鑷子、燒杯、培養(yǎng)皿、離心管、冰塊、濾紙、一次性注射器、移液槍、無酶管、酶槍頭等，以上器材均經(jīng)無菌處理。南京建成生物工程研究所的檢測試劑盒：堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為進(jìn)行燦爛弧菌刺激后刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液的免疫應(yīng)答比較研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的采樣時間點(diǎn)分別為0h、12h、24h、36h、48h、72h,96h。用1ml滅菌注射器吸取100μL燦爛弧菌菌懸液(2×108cfu/ml)對刺參進(jìn)行腹腔注射，63頭刺參被隨機(jī)分成7組。沒有注射的作為0h，注射后12h、24h、36h、48h、72h、96h,刺參體腔內(nèi)體腔液，每3個樣品隨機(jī)混合作為一個重復(fù)，分別收集3個重復(fù)；波里氏囊內(nèi)體腔液，每4或5個樣品隨機(jī)混合作為一個重復(fù)，分別收集2個重復(fù)，每組使用實(shí)驗(yàn)動物刺參9頭進(jìn)行免疫酶活的研究。2.2.2刺參體腔內(nèi)與波里氏囊內(nèi)體腔液的收集和處理對應(yīng)取樣時間點(diǎn)內(nèi)，從水箱中取出刺參并用濾紙吸干其體表水分，于培養(yǎng)皿上方，用剪刀從泄殖腔向上剖開刺參腹部，將體腔內(nèi)體腔液收集至培養(yǎng)皿。用2.5ml注射器迅速從培養(yǎng)皿內(nèi)吸取體腔內(nèi)體腔液2ml至10ml無酶管，每三頭混合一個樣品，9頭均取完后(冰浴);暴露波里氏囊，用2ml注射器抽取刺參波里氏囊內(nèi)體腔液至一無酶管，每四頭/五頭混合一個樣品，9頭均取完后(冰浴)。將收集的刺參體腔內(nèi)與波里氏囊內(nèi)體腔液樣品，放入離心機(jī)，配平后，4℃，3000r/min，離心10min。將離心后的刺參體腔內(nèi)與波里氏囊內(nèi)體腔液上清液分別轉(zhuǎn)移至新的酶活管中，-80℃凍存，用于酶活力的檢測。2.2.3刺參體腔液上清的免疫酶活力測定刺參體腔液上清和波里氏囊內(nèi)液體上清酶活力的測定指標(biāo)我們選取酸性磷酸酶(ACP)，堿性磷酸酶(AKP)[28]，過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)這幾種常見的與免疫相關(guān)的酶去研究這兩個部位免疫力的強(qiáng)弱。將2.2.2中儲存在-80℃中的體腔液上清樣品拿出來解凍進(jìn)行檢測。酸性磷酸酶活力的測定按照對硝基苯基磷酸酯底物法操作，將對硝基苯基磷酸酯溶于100mmol/L、pH4.5的醋酸鈉—醋酸緩沖液中，制成2mmol/L的對硝基苯基磷酸酯溶液。100μL樣品加入到對硝基苯基磷酸酯溶液中混勻，37℃30min，再加入2.9mL100mmol/L的NaOH溶液。測定405nm波長下的吸光值，產(chǎn)生1mg對硝基苯酚定義為1個酶活力單位(U)。堿性磷酸酶活力的測定將對硝基苯基磷酸酯溶于100mmol/L，pH9.5的甘氨酸—?dú)溲趸c緩沖液按照對硝基苯基磷酸酯底物法操作，測定405nm波長下的吸光值。產(chǎn)生1mg對硝基苯酚定義為1個酶活力單位(U)。超氧化物歧化酶活力測定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)法[16]，將50μL樣品加入到3mL反應(yīng)溶液(50mmol/L磷酸鹽緩沖液，0.75mmol/L氯化硝基四氮唑藍(lán)2oμ，mol/L核黃素，13μmol/L甲硫氨酸，pH7.8)中混勻，30℃使用40001x熒光照射5min，測定560nm波長下的吸光值。1mL反應(yīng)液中超氧化物歧化酶抑制率達(dá)50%時定義為1個酶活力單位(U)。過氧化氫酶(CAT)活性測定將50mmol/L，pH7.5的磷酸緩沖液加入75mmol/L濃度的H2O2中，直至240nm波長吸光值達(dá)到0.04~0.06，用作底物緩沖液，將100μL樣品加入到2.9mL底物緩沖液中，混勻測定240nm波長下的吸光值。每秒鐘轉(zhuǎn)化μmolH2O2定義為1個酶活力單位(U)。2.2.5數(shù)據(jù)分析酶活檢測實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。數(shù)據(jù)使用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析，差異性顯著定義為P<0.05。第三章實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論3.1燦爛弧菌刺激后刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液ACP活力比較圖1刺參體腔內(nèi)體腔液ACP活力變化圖圖2波里氏囊內(nèi)體腔液ACP活力變化圖由圖1分析，刺參在受到燦爛弧菌刺激后12h，體腔內(nèi)體腔液的ACP酶活力與0h相比顯著下降，在12-96h內(nèi)ACP活力先上升后呈平穩(wěn)趨勢。由圖2可知，燦爛弧菌刺激刺參12h后，相比于0h，波里氏囊內(nèi)體腔液的ACP活力明顯升高，而在12-24h內(nèi)又發(fā)生急劇下降，24-48h又呈明顯上升趨勢，在48-96h，囊內(nèi)ACP活力不斷下降且顯著低于對照組。在酸性磷酸酶活力的測定中，刺參經(jīng)燦爛弧菌刺激達(dá)12h時波里氏囊內(nèi)體腔液ACP活力急劇升高至對照組兩倍左右，說明囊內(nèi)體腔液酸性磷酸酶積極參與了刺參機(jī)體的免疫應(yīng)答[29,30]，并且相比于刺參體腔內(nèi)體腔液，波里氏囊內(nèi)體腔液酸性磷酸酶在針對燦爛弧菌刺激后的早期免疫應(yīng)答中可能起著相對重要的作用。3.2燦爛弧菌刺激后刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液AKP活力比較圖3刺參體腔內(nèi)體腔液AKP活力變化圖圖4波里氏囊內(nèi)體腔液AKP活力變化圖燦爛弧菌刺激后，刺參體腔內(nèi)體腔液堿性磷酸酶活力總體呈先上升后下降的趨勢，下降幅度相較于上升幅度較小，12-24h體腔內(nèi)ALP活力明顯上升，并且經(jīng)刺激24h時體腔內(nèi)體腔液堿性磷酸酶活力達(dá)到峰值，48-96h，刺參體腔內(nèi)體腔液的ALP呈下降趨勢。而波里氏囊內(nèi)的體腔液的ALP活力經(jīng)燦爛弧菌刺激后總體呈先上升后下降，再上升的趨勢,再下降的趨勢，囊內(nèi)ALP活力在72h時達(dá)到最高值。刺激后的12h,囊內(nèi)ALP活力上升,12-24hALP活力下降，下降幅度較小，而48-96h，波里氏囊內(nèi)體腔液的堿性磷酸酶活力先明顯上升后急劇下降，且上升和下降的幅度較大。刺參經(jīng)燦爛弧菌刺激后，刺參體腔內(nèi)體腔液在前期(0-24h)相比于波里氏囊內(nèi)體腔液ALP變化情況呈現(xiàn)了持續(xù)性升高，這說明在感染前期體腔內(nèi)體腔液ALP具備更迅速的應(yīng)答力，在后期(48-96h),波里氏囊內(nèi)體腔液ALP則發(fā)揮作用，更為迅速的抵御病原菌的入侵。3.3燦爛弧菌刺激后刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液CAT活力比較圖5刺參體腔內(nèi)體腔液CAT活力變化圖圖6波里氏囊內(nèi)體腔液CAT活力變化圖由圖5分析，燦爛弧菌刺激后的12-72h，刺參體腔內(nèi)體腔液的過氧化物歧化酶活力變化不規(guī)律，12h、48h、72h時，與對照組相比差異顯著，在96h時，CAT活力急劇上升,并且達(dá)到最高值。而波里氏囊內(nèi)CAT活力在12-24h明顯上升，48h又急劇下降，72-96hCAT活力逐漸恢復(fù)至正常狀態(tài)。刺參體腔內(nèi)CAT在早期變化起伏不明顯，相對來說，波里氏囊體腔液CAT活力在感染病原菌前期不斷升高，這說明在刺參前期應(yīng)答細(xì)菌感染的過程中，波里氏囊發(fā)揮著更重要的作用，扮演著重要的角色，而后期(96h),體腔內(nèi)體腔液CAT活力突然顯著升高，波里氏囊內(nèi)體腔液CAT也恢復(fù)至起始水平，可能是刺參機(jī)體逐漸恢復(fù)狀態(tài)，波里氏囊內(nèi)與體腔內(nèi)體腔液共同抵御對病原菌的結(jié)果[29-31]。3.4燦爛弧菌刺激后刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液SOD活力比較圖7刺參體腔內(nèi)體腔液SOD活力變化圖圖8波里氏囊內(nèi)體腔液SOD活力變化圖如圖7所示，刺參經(jīng)病原菌刺激12h時，體腔內(nèi)體腔液SOD活力變化相比于對照組，出現(xiàn)顯著下降現(xiàn)象，并持續(xù)此水平至48h，在48-96h階段，體腔內(nèi)體腔液SOD活力先下降后上升，在72h時,SOD活力最小且顯著低于對照組。波里氏囊內(nèi)體腔液的SOD活力整體變化趨勢與體腔內(nèi)相似，SOD活力變化呈先下降后上升再下降的趨勢，并且每一時間點(diǎn)的SOD活力與對照組相近。在測定起始階段(0-12h)，刺參體腔內(nèi)體腔液和波里氏囊內(nèi)體腔液SOD活力均出現(xiàn)顯著下降，說明該病原菌的刺激，抑制了刺參機(jī)體SOD系統(tǒng)的免疫應(yīng)答能力，在12-48h，刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)的體腔液SOD活力都呈先上升后下降趨勢。從整體趨勢來看,體腔內(nèi)體腔液SOD，波里氏囊內(nèi)體腔液SOD，在抵御燦爛弧菌刺激的過程中，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異，這說明SOD在體腔和波里氏囊內(nèi)都占據(jù)了一個主要的地位。此外,兩者后期變化一致性顯著降低,有可能是該病頻發(fā)的重要原因之一。3.4討論細(xì)菌作為細(xì)菌性疾病的引發(fā)者，一直是仿刺參的最主要病原，令人震驚的是，僅在仿刺參腐皮綜合癥就有著超過8種的細(xì)菌性病原,這直接表面了細(xì)菌性病害對整個仿刺參養(yǎng)殖業(yè)的阻礙與制約。仿刺參屬于無脊椎動物的一種，它的內(nèi)部沒有特異性免疫，僅僅能夠依靠體內(nèi)的免疫因子也就是相應(yīng)的酶來來識別、抑制、殺傷和清除病原。不同免疫因子通常具有明顯不同的免疫分工。酸性磷酸酶和堿性磷酸酶通過水解作用，一方面可以修飾病原外部的分子結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)機(jī)體對病原的吞噬作用，另一方面可以水解病原表面的磷酸基團(tuán)，從而直接殺死或抑制病原體。超氧化物歧化酶能夠清除機(jī)體吞噬或包囊病原體等過程中所產(chǎn)生的過量活性氧，防止過量活性氧對機(jī)體自身的氧化傷害，同時，在清除過量活性氧的過程中還能夠催化超氧陰離子，產(chǎn)生具有很高殺菌活性的H2O2,直接參與殺菌、抑菌過程。3.4.1酸性磷酸酶ACP酸磷酶是一組在酸性條件下水解各種磷酸酯的酶，它在pH=5.0是活性最強(qiáng)，對底物特異性較低。ACP在細(xì)胞內(nèi)主要定位于溶酶體內(nèi)，在細(xì)胞核、胞液、微粒體、高爾基體中也存在。它是由兩個相同的亞單位構(gòu)成的糖蛋白，在高等動物中存在于前列腺、肝、腎、骨等各種組織細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞損傷時，ACP釋放入血造成ACP含量升高。酸性磷酸酶是仿刺參吞噬細(xì)胞中溶酶體的標(biāo)志酶和巨噬細(xì)胞中的重要水解酶，它可以消化細(xì)胞中由異物顆粒形成的吞噬體[31,32]，增強(qiáng)對病原的吞噬作用，達(dá)到抑制或殺死病原菌的目的。在缺乏特異性免疫球蛋白的軟體動物體內(nèi)，酸性磷酸酶的作用顯得尤為重要，它能夠通過水解作用將表面帶有磷酸酯的異物破壞，從而達(dá)到預(yù)防病原體感染的目的，并可修飾或改變外來異物的表面分子組成，從而增強(qiáng)血細(xì)胞對異物的識別，起到調(diào)理的作用，加快吞噬細(xì)胞對異物的吞噬和降解速度。燦爛弧菌刺激12小時后，仿刺參體腔內(nèi)體腔液中的酸性磷酸酶活力顯著升高，這表明體腔內(nèi)體腔液中ACP可有效應(yīng)答病原菌的入侵。有研究表明[32]，在仿刺參應(yīng)答燦爛弧菌和假交替單胞菌過程中，體腔細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶介入要晚于體腔液上清中的酸性磷酸酶，這與受大腸桿菌(Escherichiacoli)感染櫛孔扇貝(Chlamysfarre-ri)血細(xì)胞和血清中酸性磷酸酶活力變化相似[33]。3.4.2堿性磷酸酶(ALP)堿性磷酸酶是一種能夠?qū)?yīng)底物去磷酸化的酶，在堿性條件下可以水解病原表面的磷酸基團(tuán)，達(dá)到殺死或抑制病原體的效果，其對水體環(huán)境中鈣質(zhì)、磷酸鈣等的形成有著十分重要的作用。堿性磷酸酶在機(jī)體內(nèi)分布廣泛，在消化道中主要參與脂質(zhì)、葡萄糖和無機(jī)磷酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，通常被認(rèn)為是消化道吸收營養(yǎng)物質(zhì)的標(biāo)志酶。對于水產(chǎn)動物來說，是一種不可或缺的生存必須酶類。堿性磷酸酶活力測定結(jié)果顯示，燦爛弧菌刺激后仿刺參體腔內(nèi)與波里氏囊內(nèi)體腔液堿性磷酸酶活力均顯著升高，與鰻弧菌刺激后的青蛤和櫛孔扇貝中的結(jié)果相似。這與哈維氏弧菌、假交替單胞、溶壁微球菌和停乳鏈球菌4株細(xì)菌刺激后的早期(4h、12h)，仿刺參體腔液中堿性磷酸酶活力均明顯低于對照水平的變化不同[34]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，仿刺參體腔內(nèi)與波里氏囊內(nèi)體腔液堿性磷酸酶均可有效應(yīng)答燦爛弧菌的入侵，且前期體腔內(nèi)體腔液應(yīng)答更為迅速，后期波里氏囊發(fā)揮至關(guān)重要的作用。3.4.3超氧化物歧化酶SODSOD對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，該酶能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。自由基主要是在細(xì)胞對異物的吞噬過程中產(chǎn)生的，過多的自由基對細(xì)胞和機(jī)體有很大的損傷，SOD是清除自由基最重要的一種抗氧化物酶。傳統(tǒng)SOD測定的方法是鄰苯三酚法，超氧化物歧化酶是無脊椎動物體內(nèi)重要的自由基清除，能夠清除機(jī)體吞噬病原體等過程中產(chǎn)生的過量活性氧，免除其對機(jī)體自身的損傷[31]，同時還可以催化超氧陰離子，產(chǎn)生具有強(qiáng)殺菌活性的H2O2，直接參與抑菌、殺菌過程。超氧化物歧化酶既直接參與到病原的殺傷、抑制過程，又在機(jī)體殺傷、清除病原過程中起到自我保護(hù)的重要作用，因此超氧化物歧化酶活力水平是反映機(jī)體免疫抵抗力的重要指標(biāo)[30]。相關(guān)研究表明，在仿刺參中，不同細(xì)菌刺激后4h，體腔液超氧化物歧化酶活力變化明顯，表明超氧化物歧化酶是仿刺參中的急性應(yīng)激類蛋白，與曼氏無針烏賊(Sepiellamaindroni)中的報(bào)道結(jié)果相似。此外，與紫貽貝(Mytilusedulis)中的結(jié)果相似，燦爛弧菌刺激后仿刺參體腔液超氧化物歧化酶活力顯著下降，表明注射的燦爛弧菌抑制了仿刺參超氧化物歧化酶系統(tǒng)的應(yīng)答能力。本文結(jié)果顯示，刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液SOD酶活均較高，無明顯差異，我們分析認(rèn)為是SOD在刺參免疫過程中扮演了重要的防御作用[30-35]。第四章結(jié)論與展望4.1結(jié)論本文采用了4種不同檢測技術(shù)，分別研究了在經(jīng)燦爛弧菌刺激后刺身體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液的免疫應(yīng)答，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出以下結(jié)論：(1)在ACP活力測定中，相比于體腔內(nèi)體腔液,囊內(nèi)體腔液ACP在針對燦爛弧菌刺激后的早期免疫應(yīng)答中可能起著更重要的作用。(2)在AKP活力測定中，刺參經(jīng)病原菌刺激后，相比于波里氏囊內(nèi)體腔液AKP變化情況，前期體腔內(nèi)體腔液AKP呈現(xiàn)了持續(xù)性顯著升高，體腔內(nèi)體腔液AKP具備更迅速的應(yīng)答力，抵御病原菌的入侵，后期波里氏囊內(nèi)體腔液AKP更快速的發(fā)揮作用。(3)在CAT活力測定中，在感染病原菌前期,波里氏囊內(nèi)體腔液CAT不斷升高，波里氏囊扮演者重要的角色；后期體腔內(nèi)體腔液CAT顯著增高，可能是波里氏囊的對病原菌的及時有效應(yīng)激，使機(jī)體恢復(fù)正常。(4)在SOD活力測定中，刺參經(jīng)燦爛弧菌刺激后，從整體變化趨勢看，刺參體腔內(nèi)體腔液與波里氏囊內(nèi)體腔液內(nèi)SOD，在抵御燦爛弧菌刺激的過程中，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異，這說明SOD在體腔和波里氏囊內(nèi)都占據(jù)了一個主要的地位。4.2展望本試驗(yàn)通過通過酶學(xué)技術(shù)研究刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液的免疫應(yīng)答響應(yīng)并比較兩者之間的差異，需深入研究：刺參體腔液中的多種免疫因子可有效應(yīng)答病原菌的刺激，然而，仿刺參體腔液中的免疫相關(guān)酶在不同病原菌刺激后的應(yīng)答特性尚不明確，有待探究。 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