ICS65.020.01

CCSB05

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內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2397—2021

黑土區(qū)甜葉菊組織培養(yǎng)育苗移栽技術(shù)規(guī)程

Codeofprcticeoftissuecultureandseedlingtransplantingofstevia

inblacksoilarea

2021-09-26發(fā)布2021-10-26實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2397—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳提出。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC20）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心、扎賚特旗農(nóng)牧和科技事業(yè)

發(fā)展中心。

本文件主要起草人：楊彥明、劉復(fù)偉、烏恩、陳新宇、張悅忠、李志新、于長(zhǎng)生、潘云鶴、董津蒙、

王凌云、白桂香、艾俊國(guó)、陶鳳英。

I

DB15/T2397—2021

黑土區(qū)甜葉菊組織培養(yǎng)育苗移栽技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了內(nèi)蒙古黑土區(qū)甜葉菊組織培養(yǎng)育苗移栽技術(shù)的無菌環(huán)境準(zhǔn)備、無菌苗培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、

試管苗移栽關(guān)鍵技術(shù)。

本文件適用于內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市、興安盟、通遼市。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB13735聚乙烯吹塑農(nóng)用地面覆蓋薄膜

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

甜葉菊steviarebaudianahemsl.

菊科甜葉菊屬多年生草本植物，原產(chǎn)于南美巴拉圭和巴西交界的高山草地。

4無菌環(huán)境準(zhǔn)備

4.1濕熱滅菌

培養(yǎng)基（不耐高溫成分除外）、無菌水、玻璃器皿（三角瓶、空三角瓶、培養(yǎng)皿）、金屬器械（剪

刀、鑷子）等采用高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行濕熱滅菌處理。滅菌鍋內(nèi)加水至底部有水析出，放入物品、關(guān)嚴(yán)

蓋子，調(diào)整溫度121℃，時(shí)間20min。待溫度上升至95℃以上時(shí)，將出氣閥和安全閥關(guān)閉；當(dāng)氣壓降

至0.05Mpa以下時(shí),出氣閥和安全閥打開排氣，冷卻后開蓋取出。

4.2干熱滅菌

耐熱器械（部分玻璃器皿、坩堝）采用干熱滅菌，利用烘箱加熱到170℃，持續(xù)90min。

4.3過濾滅菌

植物激素（6-BA、NAA、IBA）采用過濾滅菌。采用濾膜網(wǎng)孔直徑0.45μm以下的微孔過濾滅菌器。

4.4灼燒滅菌

無菌操作器械采用灼燒滅菌。灼燒滅菌可采用接種用電熱滅菌器或酒精燈灼燒滅菌。

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4.5擦拭、噴霧滅菌

桌面、墻面、雙手、植物材料表面用藥劑涂擦、噴霧滅菌，用75%的酒精或0.1%的新潔爾滅菌。

超凈工作臺(tái)用75%的酒精噴灑。

4.6紫外線滅菌

接種室、培養(yǎng)室定期用紫外燈滅菌。打開室內(nèi)及超凈工作臺(tái)，用紫外燈殺菌20min～30min，關(guān)

閉紫外燈，10min后進(jìn)入緩沖間。

4.7熏蒸滅菌

接種室和培養(yǎng)室每年用高錳酸鉀和甲醛混合熏蒸1～2次。熏蒸時(shí)，關(guān)閉房間，用大燒杯盛裝甲醛和

高錳酸鉀溶液，用量為甲醛10ml/m3、高錳酸鉀5g/m3，熏蒸2d～3d，2d～3d后人員方可進(jìn)入。

5無菌苗培養(yǎng)

5.1種子處理

取甜葉菊種子，每10粒1份，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將種子裝入無菌離心管中消毒。75%酒精消毒10s→

0.1%HgCl2消毒6min，每隔5s～10s搖動(dòng)1次離心管，無菌水沖洗4～5次，后置于無菌濾紙下吸干。

用70%乙醇30s→0.1%HgCl2消毒6min→15%H2O2消毒20min，每隔5s～10s搖動(dòng)1次離心管，無菌水

沖洗4～5次，后置于無菌濾紙下吸干。

5.2種子裝瓶

將滅菌后裝有培養(yǎng)基的三角瓶在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開，封口膜倒放于臺(tái)面。將消毒、吸水干燥后的種

子用鑷子均勻播于培養(yǎng)基上，播后將瓶口用酒精燈灼燒滅菌，冷卻后封口、扎緊。

5.3種子培養(yǎng)

將播種后的三角瓶在25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)至發(fā)芽后，繼續(xù)保持光照10h/d～16h/d培養(yǎng)至苗

高3cm～5cm待用。

6組織培養(yǎng)

6.1培養(yǎng)基選擇及制備

6.1.1MS培養(yǎng)基

取40gMS粉，溶于1L蒸餾水，調(diào)pH為5.8，加瓊脂5g，滅菌20min后，冷卻備用。

6.1.21/2MS培養(yǎng)基

取20gMS粉，溶于1L蒸餾水，調(diào)pH為5.8，加瓊脂8.5g，滅菌20min后，冷卻備用。

6.1.3誘導(dǎo)培養(yǎng)基

MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂。

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DB15/T2397—2021

6.1.4增殖培養(yǎng)基

MS+1.0mg/L6-BA+O.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂。

6.1.5生根培養(yǎng)基

1/2MS+0.1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+0.2mg/LIBA+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂。

6.2材料選擇及接種

取無菌苗上的帶腋芽莖段作為外植體，用蒸餾水沖洗干凈，將莖段切割成1cm左右?guī)б秆啃∏o段，

于超靜工作臺(tái)上用75%酒精消毒10s，再用0.1%HgCl2消毒6min，每隔5s～10s攪動(dòng)1次，無菌水沖

洗5次，消毒處理后的外植體，接種在MS培養(yǎng)基中，約30d后腋芽長(zhǎng)成芽苗。無菌苗可作為組織培養(yǎng)外

植體，在超凈工作臺(tái)中將無菌苗切下1cm左右小段，轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

6.3培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為24℃～28℃，光照時(shí)間為16h/d，光照強(qiáng)度為2000lx。

6.4試管苗增殖

將無菌苗切成單株，接種于增殖培養(yǎng)基中，每瓶接種5株。

6.5試管苗生根

選取生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致的試管苗，并將苗切成單株，接種于生根培養(yǎng)基中，每瓶接種5株。

7試管苗移栽

7.1試管移栽

將試管苗根部培養(yǎng)基清洗干凈移栽于苗盤，以濕潤(rùn)河沙為栽培基質(zhì)，覆蓋塑料薄膜，溫度控制在

20℃～30℃，中午適當(dāng)遮蔭，20d后統(tǒng)計(jì)試管苗成活率。塑料薄膜使用符合GB13735的規(guī)定。

7.2大田移栽

當(dāng)?shù)厝掌骄鶜鉁胤€(wěn)定在12℃～15℃