2025年核酸檢驗面試題庫及答案一、核酸檢驗基礎(chǔ)理論1.請簡述實時熒光定量PCR（qPCR）的基本原理及Ct值的臨床意義。實時熒光定量PCR基于DNA半保留復制原理，通過擴增過程中熒光信號的實時監(jiān)測實現(xiàn)對靶核酸的定量分析。反應體系包括引物、探針、dNTP、Taq酶及待檢核酸模板。擴增分為變性（95℃解鏈）、退火（引物與模板結(jié)合）、延伸（Taq酶催化dNTP聚合）三個階段。熒光探針（如TaqMan探針）在延伸階段被Taq酶切割，釋放熒光基團，儀器通過檢測熒光信號強度變化繪制擴增曲線。Ct值（循環(huán)閾值）指熒光信號達到設(shè)定閾值時的擴增循環(huán)數(shù)，與初始模板量呈對數(shù)負相關(guān)：模板量越多，Ct值越小。臨床中，Ct值可用于判斷樣本中病原體載量（如新冠病毒），結(jié)合實驗室設(shè)定的陽性閾值（通常為35-40），Ct值≤閾值為陽性，＞閾值需結(jié)合復檢或其他指標綜合判斷。2.反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）與常規(guī)PCR的主要區(qū)別是什么？在核酸檢測中如何選擇應用？RT-PCR與常規(guī)PCR的核心區(qū)別在于模板類型：常規(guī)PCR以DNA為模板，RT-PCR以RNA為模板。RT-PCR需先通過反轉(zhuǎn)錄酶（如M-MLV或AMV）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行PCR擴增。應用場景上，RT-PCR主要用于檢測RNA病毒（如新冠病毒、流感病毒）、細胞內(nèi)mRNA表達水平等；常規(guī)PCR用于DNA病毒（如乙肝病毒）、細菌基因組、基因突變檢測等。選擇時需根據(jù)靶標核酸類型決定：若檢測對象為RNA（如RNA病毒核酸），必須使用RT-PCR；若為DNA（如細菌16SrRNA基因、DNA病毒），則用常規(guī)PCR。3.核酸擴增抑制物的常見類型及消除方法有哪些？常見抑制物包括：（1）樣本基質(zhì)成分：全血中的血紅蛋白、免疫球蛋白；組織中的膽紅素、多糖；糞便中的膽鹽、尿素；（2）化學物質(zhì)：EDTA（過量影響Mg2+濃度）、乙醇（提取殘留）、次氯酸鹽（消毒殘留）；（3）生物成分：蛋白酶、核酸酶（未徹底滅活時破壞模板）。消除方法：（1）優(yōu)化樣本前處理：如全血樣本使用含蛋白酶K的裂解液充分消化，糞便樣本增加離心洗滌步驟減少雜質(zhì)；（2）調(diào)整反應體系：增加Mg2+濃度（中和負電荷抑制物）、使用BSA（結(jié)合抑制物）；（3）選擇抗抑制性強的酶：如熱啟動Taq酶或經(jīng)改造的高保真酶；（4）稀釋樣本：若抑制物濃度過高，可將提取的核酸適度稀釋后檢測（需注意稀釋可能降低靈敏度）。二、實驗室操作技能4.請詳細描述新冠病毒核酸檢測的全流程（從樣本接收至報告發(fā)放）。（1）樣本接收與登記：核對樣本信息（姓名、編號、采集時間），檢查容器密封性、樣本類型（咽拭子/鼻拭子/肺泡灌洗液）及保存條件（2-8℃或-20℃），記錄異常情況（如漏液、標簽模糊）并反饋。（2）樣本前處理（生物安全柜內(nèi)操作）：-滅活：56℃孵育30分鐘（或按試劑說明書），破壞病毒結(jié)構(gòu)同時保留核酸完整性；-核酸提?。菏褂么胖榉ɑ蛑岱āＲ源胖榉槔杭尤肓呀庖海ê惲蚯杷犭移茐牡鞍祝?、磁珠（吸附核酸），經(jīng)洗滌（75%乙醇去除雜質(zhì)）、洗脫（TE緩沖液或純水釋放核酸）得到純化產(chǎn)物；-質(zhì)量初篩：通過紫外分光光度計檢測A260/A280（1.8-2.0為合格），或肉眼觀察洗脫液是否澄清（渾濁提示蛋白殘留）。（3）體系配制與加樣：-試劑準備：從-20℃取出擴增試劑，室溫平衡15分鐘，渦旋離心后分裝；-加樣：在樣本制備區(qū)將提取的核酸加入反應管（每管10-20μL），同時設(shè)置陰性質(zhì)控（無核酸水）、陽性質(zhì)控（已知陽性標準品）、內(nèi)標（監(jiān)測提取及擴增效率）；-密封與轉(zhuǎn)移：反應管離心去氣泡，轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。（4）擴增檢測：-儀器參數(shù)設(shè)置：變性95℃3分鐘，循環(huán)40次（95℃15秒，60℃30秒），采集熒光信號（FAM通道檢測ORF1ab基因，HEX/VIC檢測N基因）；-運行監(jiān)控：觀察擴增曲線是否符合預期（S型），避免儀器中途斷電或溫度異常。（5）結(jié)果分析與審核：-判讀規(guī)則：內(nèi)標Ct值≤35（有效擴增），陰性質(zhì)控無擴增或Ct＞40，陽性質(zhì)控Ct≤30；-樣本結(jié)果：雙靶標Ct≤35為陽性，單靶標陽性需復檢，雙靶標無擴增或Ct＞40為陰性；-報告生成：記錄檢測時間、儀器編號、操作人員，審核人確認后簽發(fā)電子/紙質(zhì)報告。5.核酸提取過程中如何避免交叉污染？請列舉3項關(guān)鍵措施。（1）分區(qū)操作：嚴格遵循PCR實驗室“四區(qū)”要求（試劑準備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)），各區(qū)物品專用（移液器、離心管、手套），不得交叉使用。（2）防氣溶膠措施：-使用帶濾芯的吸頭（阻止液體倒吸入移液器）；-樣本處理時避免劇烈震蕩（如渦旋后緩慢開蓋）；-每日工作后用75%乙醇或含氯消毒液（如1000mg/L次氯酸鈉）擦拭臺面，紫外線照射30分鐘（破壞殘留核酸）。（3）陽性樣本處理：-陽性樣本單獨放置于生物安全柜角落；-提取陽性樣本后更換手套，用新吸頭處理下一個樣本；-若發(fā)生樣本泄漏，立即用吸水紙覆蓋（滴加1000mg/L含氯消毒液），靜置10分鐘后清理，再用75%乙醇擦拭。6.擴增儀溫度校準的重要性是什么？如何判斷儀器溫度準確性？擴增儀溫度準確性直接影響PCR效率：溫度過高（如變性階段＞98℃）會破壞Taq酶活性；退火溫度偏差（±1℃）可能導致引物錯配（非特異性擴增）或不結(jié)合（無擴增）。校準方法：（1）使用溫度驗證儀：將多個溫度探頭放置于反應孔不同位置（邊緣、中心），運行梯度程序（如50-95℃），記錄各孔實際溫度與設(shè)定溫度的差異（應≤±0.5℃）。（2）擴增驗證實驗：用已知濃度的標準品，在待校準儀器與標準儀器（經(jīng)計量認證）上同時擴增，比較Ct值偏差（偏差＞1.5個循環(huán)提示溫度異常）。（3）日常監(jiān)控：每月使用校準過的溫度計插入反應孔（模擬樣本管），檢測變性（95℃）、退火（60℃）階段的實際溫度，記錄并歸檔。三、質(zhì)量控制與風險管理7.實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制（IQC）的核心要素有哪些？失控時應如何處理？IQC核心要素包括：（1）質(zhì)控品選擇：涵蓋低、中、高濃度（覆蓋臨床臨界值），與檢測樣本基質(zhì)一致（如咽拭子模擬基質(zhì)）；（2）頻率與數(shù)量：每批次檢測至少1個陰性質(zhì)控、1個陽性質(zhì)控（弱陽性，Ct值接近閾值），每日運行1次室內(nèi)質(zhì)控圖；（3）判定規(guī)則：采用Westgard多規(guī)則（如12s警告，13s失控，22s批內(nèi)失控），結(jié)合實驗室自定義標準（如陽性質(zhì)控Ct值波動范圍±2個循環(huán)）；（4）記錄與分析：保存質(zhì)控數(shù)據(jù)至少2年，定期分析趨勢（如Ct值逐漸升高提示試劑效價下降）。失控處理流程：（1）立即暫停檢測，檢查可能原因：試劑是否過期、擴增儀溫度是否異常、提取過程是否操作失誤（如漏加樣本）；（2）復測失控批次：使用新試劑、新質(zhì)控品重新提取并擴增；（3）若仍失控，追溯前24小時檢測結(jié)果，召回可能受影響的報告，聯(lián)系第三方實驗室復檢；（4）記錄失控原因及糾正措施（如更換批次、校準儀器），經(jīng)質(zhì)量負責人審核后恢復檢測。8.如何處理“灰區(qū)”結(jié)果（如新冠病毒單靶標陽性，Ct值35-40）？（1）復檢：使用原提取核酸重復檢測（同一試劑），若雙靶標均陽性則確認；若仍單靶標陽性，換用不同廠家試劑（如另一種PCR試劑或恒溫擴增方法）復檢。（2）樣本重采：通知臨床重新采集樣本（避免首次采集不規(guī)范），重新提取檢測。（3）結(jié)合臨床：查看患者癥狀（如發(fā)熱、咳嗽）、流行病學史（近14天接觸史）、其他檢測結(jié)果（抗原檢測、抗體檢測），綜合判斷是否為陽性。（4）記錄與在報告中注明“單靶標陽性（Ct值XX），建議24小時后復檢”，并與臨床醫(yī)生溝通說明結(jié)果的不確定性。9.生物安全柜使用時的關(guān)鍵注意事項有哪些？如何判斷其防護效果？注意事項：（1）操作前：開啟安全柜至少15分鐘（凈化空氣），用75%乙醇擦拭內(nèi)部（從上到下，從里到外）；（2）操作中：-手臂緩慢進出，避免氣流擾動；-物品放置于柜內(nèi)中后部（遠離前窗），避免遮擋回風槽；-禁止在柜內(nèi)使用酒精燈（破壞層流），需加熱時使用水浴鍋；（3）操作后：清理廢棄物（放入醫(yī)療廢物袋，雙層包裝），紫外線照射30分鐘，記錄使用時間。防護效果判斷：（1）人員防護：通過挑戰(zhàn)試驗（如在柜內(nèi)釋放微生物氣溶膠，檢測操作者呼吸帶的微生物濃度，應≤1CFU/平板）；（2）樣本防護：在柜內(nèi)放置開放的無菌平板（含培養(yǎng)基），運行30分鐘后培養(yǎng)，應無菌落生長；（3）定期檢測：每6個月由專業(yè)機構(gòu)檢測風速（垂直氣流≥0.38m/s，流入氣流≥0.5m/s）、高效過濾器（HEPA）完整性（掃描檢漏法，泄漏率＜0.01%）。四、法規(guī)與職業(yè)素養(yǎng)10.依據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》，實驗室需滿足哪些基本要求？（1）分區(qū)設(shè)置：至少4個獨立區(qū)域（試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)），各區(qū)域有明確標識，空氣壓力梯度為遞減（試劑準備區(qū)＞樣本處理區(qū)＞擴增區(qū)＞產(chǎn)物分析區(qū)）。（2）人員資質(zhì)：實驗室負責人需具有中級以上技術(shù)職稱，從事基因擴增工作3年以上；操作人員需經(jīng)過培訓（理論+實操），考核合格后上崗。（3）設(shè)備管理：配備生物安全柜、核酸提取儀、實時熒光定量PCR儀、高速離心機、紫外分光光度計等，所有設(shè)備需定期校準（每年至少1次）并記錄。（4）質(zhì)量體系：制定SOP（標準操作程序）涵蓋樣本接收、提取、擴增、結(jié)果判讀等全流程，建立失控處理、記錄保存（至少2年）、投訴處理等制度。11.作為核酸檢驗人員，應具備哪些職業(yè)素養(yǎng)？請結(jié)合崗位特點說明。（1）嚴謹?shù)墓ぷ鲬B(tài)度：核酸檢測結(jié)果直接影響臨床診斷（如新冠陽性需隔離），任何操作失誤（如加樣錯誤、標記混淆）都可能導致誤診。需嚴格執(zhí)行SOP，每步操作后核對樣本編號，避免“想當然”。（2）高度的生物安全意識：接觸感染性樣本（如新冠陽性標本）時，需規(guī)范穿戴防護裝備（N95口罩、護目鏡、雙層手套），操作后及時消毒，防止職業(yè)暴露。（3）持續(xù)學習能力：核酸檢測技術(shù)更新快（如數(shù)字PCR、納米孔測序），需主動學習新方法（如掌握自動化提取儀的編程）、新法規(guī)（如2024年《病原微生物實驗室生物安全管理條例》修訂內(nèi)容），提升檢測效率和準確性。（4）良好的溝通能力：與臨床科室溝通樣本采集問題（如拭子未到達咽后壁影響結(jié)果），與患者解釋“灰區(qū)”結(jié)果的意義（避免恐慌），與技術(shù)支持團隊協(xié)作解決儀器故障（如快速判斷是軟件問題還是硬件問題）。12.若發(fā)現(xiàn)同事未按SOP操作（如未對樣本進行滅活直接提?。?，你會如何處理？（1）立即制止：在生物安全柜內(nèi)操作時，輕聲提醒同事暫停操作，避免繼續(xù)錯誤（如未滅活的樣本可能含有活病毒，增加感染風險）。（2）評估風險：檢查樣本類型（如新冠病毒屬于乙類傳染病，需嚴格滅活）、已操作步驟（如是否已打開樣本管），若已暴露，需對操作區(qū)域進行額外消毒（如噴灑2000mg/L含氯消毒液）。（3）溝通糾正：待同事完成當前步驟后，私下說明問題（引用SOP中“樣本需56℃滅活30分鐘”的規(guī)定），解釋潛在風險（如感染、核酸降解），建議重新滅活樣本并重新提取。（4）上報記錄：若同事多次違規(guī)，需向?qū)嶒炇邑撠熑藞蟾?，同時記錄事件經(jīng)過（時間、地點、處理措施），納入質(zhì)量改進計劃（如加強培訓考核）。五、新技術(shù)與行業(yè)趨勢13.數(shù)字PCR（dPCR）與實時熒光定量PCR的主要區(qū)別是什么？其臨床應用優(yōu)勢有哪些？區(qū)別：（1）定量原理：qPCR通過Ct值相對定量（需標準曲線），dPCR將反應體系分割為數(shù)萬個微滴（或微孔），每個微滴含0或1個模板分子，擴增后統(tǒng)計陽性微滴比例，通過泊松分布計算絕對拷貝數(shù)。（2）靈敏度：dPCR可檢測低至1拷貝/μL的模板（qPCR通常≥10拷貝/μL），適合稀有突變（如腫瘤循環(huán)DNA）檢測。（3）抗干擾性：dPCR對抑制物耐受性更強（微滴分隔降低抑制物濃度），適合復雜樣本（如血漿、腦脊液）。臨床優(yōu)勢：（1）精準定量：無需標準品，直接報告拷貝數(shù)（如乙肝病毒載量＜20IU/mL的精確檢測）；（2）稀有突變檢測：可識別0.01%的突變頻率（如EGFRT790M耐藥突變），優(yōu)于qPCR的1-5%；（3）弱陽性樣本確認：對qPCR灰區(qū)結(jié)果（Ct35-40），dPCR可通過絕對定量判斷是否為真正陽性（如新冠病毒低載量樣本）。14.自動化核酸提取儀的常見類型及使用注意事項有哪些？類型：（1）磁珠法提取儀：通過機械臂轉(zhuǎn)移磁珠，完成裂解、結(jié)合、洗滌、洗脫步驟（如羅氏cobas6800），適合大樣本量（96孔板）；（2）柱提法提取儀：利用離心柱吸附核酸（如QIAGENQIAcube），適合小樣本量（1-12管）；（3）微流控提取儀：在芯片內(nèi)完成提取（如賽默飛AppliedBiosystems普瑞麥迪），體積小、速度快（30分鐘內(nèi)完成）。注意事項：（1）試劑匹配：選擇與儀器配套的提取試劑（磁珠粒徑、裂解液成分需適配機械臂參數(shù)），避免磁珠殘留或結(jié)合效率降低；（2）樣本類型：全血樣本需預處理（如去除紅細胞），避免堵孔；組織樣本需充分勻漿（否則核酸釋放不全）；（3）日常維護：定期清潔機械臂（防止磁珠殘留），校準加樣針（避免移液體積偏差＞5%），更換廢液槽（防止液體滲漏污染）；（4）質(zhì)量監(jiān)控：每批提取后檢測內(nèi)標（如加入人工