AbMole-RapamycinY27632和SCH772984助力揭示EGFR-TKIs耐藥機制由中國藥科大學基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床藥學學院的ZhenZhenPan，KaiWang，XiNiaoWang，XuanShengDing以及廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院的JianYeZhang等多名研究人員在MolCancer.期刊（IF=37.3）上，發(fā)表了題為“CholesterolpromotesEGFR-TKIsresistanceinNSCLCbyinducingEGFR/Src/Erk/SP1signaling-mediatedERRαre-expression”的文章。在該文章中，使用了購自AbMole的Rapamycin（M1768），Y-27632（M1817）和SCH772984（M2084）三種產(chǎn)品，揭示了EGFR-TKIs耐藥的分子機制，并提出了克服耐藥性的潛在研究方案。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）常應用于EGFR突變的非小細胞肺癌（NSCLC）。然而，NSCLC獲得性耐藥的產(chǎn)生不可避免，并在很大程度上限制了EGFR-TKIs的應用。在本研究中，研究人員使用PC-9細胞建立耐藥細胞模型（圖1A），并將H1975細胞也作為Gefitinib的耐藥模型進行實驗，檢測三種膽固醇在不同細胞中的水平，發(fā)現(xiàn)膽固醇在耐藥細胞中的表達均增加，表明在NSCLC獲得耐藥過程中發(fā)生了膽固醇積累（圖1B-C）。此外，耐藥細胞異種移植瘤的腫瘤組織中也含有更多的膽固醇和更高的Ki67表達，說明膽固醇積累誘導的細胞增殖是耐藥的原因。圖1A.將PC-9細胞暴露于Gefitinib或Osimertinib12周，建立Gefitinib耐藥PC-9/GR和Osimertinib耐藥PC-9/OR細胞。B.使用膽固醇檢測試劑盒測定NSCLC細胞的細胞質(zhì)或脂筏中的膽固醇水平。C.細胞與0.5mg/mL的Filipin一起孵育2小時。共聚焦圖像顯示藍色的游離膽固醇，并分析熒光強度。之后，通過檢索數(shù)據(jù)庫，研究人員發(fā)現(xiàn)ERRα在肺腺癌中明顯增加（圖2A）。并且經(jīng)研究顯示，ERRα的mRNA和蛋白水平在耐藥細胞異種移植瘤中顯著上調(diào)，提示ERRα表達增強與NSCLC進展和耐藥的發(fā)生有關(guān)（圖2B-C）。隨后，研究人員用MβCD去除膽固醇，發(fā)現(xiàn)可降低ERRα的表達（圖2D-E），表明膽固醇的積累能通過上調(diào)ERRα的表達，從而使NSCLC對ERGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥性。圖2A.ERRα在正常肺部組織和肺腺癌組織中的表達。數(shù)據(jù)和P值從OncoMine數(shù)據(jù)庫中獲得。B.RT-qPCR和Westernblot檢測結(jié)果顯示了ERRα的mRNA和蛋白在指定細胞中的水平。C.IHC染色檢測ERRα在腫瘤中的表達。D.用2.5mMMβCD、10μM膽固醇或2.5mMMβCD+10μM膽固醇處理細胞6h，然后通過RT-qPCR測定指示細胞中ERRα的mRNA水平。E.用2.5mMMβCD,10μM膽固醇或2.5mMMβCD+10μM膽固醇處理細胞24h,然后用WB檢測ERRα蛋白水平。然后，通過使用XCT790下調(diào)ERRα的表達，研究人員發(fā)現(xiàn)能通過增加ROS水平和導致細胞周期停滯在G0/G1期，從而增加耐藥細胞對EGFR抑制劑的敏感性（圖3A）。同時，Gefitinib或Osimertinib能抑制PC-9細胞的EGFR激活和ERRα的表達，但不能抑制相應的耐藥細胞EGFR激活和ERRα表達（圖3B）。然而，如果使用其他抑制劑抑制耐藥細胞的p-EGFR，同樣也會抑制ERRα的表達（圖3C-D）。說明在TKIs耐藥進展過程中，ERRα表達受EGFR信號激活的正向調(diào)控。圖3A.用Gefitinib,Osimertinib單獨或與XCT790聯(lián)合處理細胞48小時，然后進行MTT檢測。B.Western印跡顯示給藥Gefitinib或Osimertinib后p-EGFR、EGFR和ERRα蛋白的水平。C.Western印跡顯示用Osimertinib或Lapatinib處理后的蛋白質(zhì)水平。D.將PC-9、PC-9/GR、H1975和PC-9/OR細胞用1μMGefitinib或0.1μMOsimertinib處理6h，RT-qPCR顯示ERRα的mRNA水平。接下來，研究人員用多種抑制劑抑制在EGFR激活時最常見的異常激活通路，發(fā)現(xiàn)Src和Erk激酶抑制劑能抑制NSCLC細胞中ERRα的蛋白和mRNA的表達（圖4A-B），進一步實驗發(fā)現(xiàn)，EGFR/Src/Erk級聯(lián)的重新激活維持了ERRα在EGFR-TKIs耐藥的NSCLC細胞中的重新表達。圖4A-BWesternblot和RT-qPCR檢測用mTOR、STAT3、NF-κB、Smad3、ROCK、EGFR、ErkEGFR和Src主要定位在脂筏部分（圖5）。且經(jīng)進一步研究發(fā)現(xiàn)，在EGFR-TKIs耐藥過程中，膽固醇的積累會吸引EGFR和Src在脂筏中組裝，并促進兩種蛋白的互作，從而激活EGFR/Src/Erk信號通路和ERRα表達。圖5提取脂質(zhì)筏中的蛋白質(zhì)，Western印跡顯示EGFR和Src蛋白在20%非脂筏部分和脂筏部分的水平。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，信號通路對ERRα的調(diào)控可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，并通過數(shù)據(jù)庫對轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)合位點進行預測。結(jié)果表明，SP1是最有可能調(diào)控ERRα的轉(zhuǎn)錄因子。與預測結(jié)果一致，SP1的過表達能增強ERRα的表達（圖6A），而阻斷EGFR/Src/Erk抑制劑對ERRα表達的抑制作用（圖6B）。說明SP1是膽固醇/EGFR/Src/Erk軸的下游因子，能通過與ERRα啟動子區(qū)域結(jié)合，直接促進ERRα的轉(zhuǎn)錄。圖6A.用空pCDNA3.1或pCDNA3.1-SP1轉(zhuǎn)染細胞48h，Westernblot檢測SP1和ERRα的蛋白水平。B.用空pCDNA3.1或pCDNA3.1-SP1以及EGFR、Erk、Src抑制劑轉(zhuǎn)染細胞48h。通過WB試驗測定ERRα的蛋白水平。最后，研究人員發(fā)現(xiàn)與單獨使用EGFR-TKIs相比，使用洛伐他汀聯(lián)合Gefitinib或Osimertinib能降低膽固醇，并可顯著降低耐藥細胞的增殖，且洛伐他汀的作用能被Mevalonate或補充膽固醇所抵消（圖7）。但當ERRα的表達被XCT790下調(diào)時，則不能抵消，說明洛伐他汀對NSCLC耐藥細胞的增敏作用在體外是ERRα依賴性的。體內(nèi)實驗證實，洛伐他汀或XCT790與Gefitinib協(xié)同作用，能抑制異種移植瘤生長。說明通過洛伐他汀降低膽固醇和抑制ERRα是克服NSCLC中EGFR-TKIs耐藥的可行策略。圖7用Gefitinib或Osimertinib、Gefitinib或Osimertinib+10μM洛伐他汀、Gefitinib或Osimertinib+10μM洛伐他汀+100μMMevalonate、Gefitinib或Osimertinib+10μM洛伐他汀+10μM膽固醇處理細胞48小時。然后通過MTT測定法測量細胞活力。本研究使用了購自AbMole的Rapamycin（M1768），Y-27632（M1817）和SCH772984（M2084）三種產(chǎn)品，分別為mTOR，ROCK和Erk的抑制劑。為了確定EGFR信號激活后，哪種信號通路驅(qū)動ERRα重新表達，研究人員分別用Rapamycin、AG-490、BAY11-7082、SIS3、Y-27632、SCH772984和WH-4-023等抑制劑檢測了最常見的異常激活通路，包括mTOR、STAT3、NF-κB、Smad、ROCK、Erk和Src。最終發(fā)現(xiàn)Src和Erk激酶抑制劑能持續(xù)抑制NSCLC細胞中ERRα蛋白和mRNA的表達（圖4A-B）。進一步分析表明，在耐藥細胞中，EGFR、Src和Erk信號傳導對Gefitinib或Osimertinib的抑制作用不敏感（圖8A）。之后，為了剖析調(diào)控層次，分別使用EGFR、Src和Erk抑制劑處理NSCLC細胞。發(fā)現(xiàn)EGFR信號被阻斷后，p-Src和p-Erk受到抑制。然而，使用WH-4-023下調(diào)p-Erk的表達，對p-Src水平?jīng)]有影響（圖8B）。這些數(shù)據(jù)表明，EGFR/Src/Erk級聯(lián)的重新激活維持了ERRα在EGFR-TKIs耐藥的NSCLC細胞中的重新表達。圖8A.用1μMGefitinib或0.1μMOsimertinib處理細胞48h，Westernblot檢測蛋白水平。B.用Gefitinib、Osimertinib、Lapatinib、WH-4-023或SCH772984處理細胞48h，Westernblot檢測蛋白水平。熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn)，ERRα啟動子活性被Plicamycin、Gefitinib、Osimertinib、Lapatinib、WH-4-023和SCH772984下調(diào)（圖9A-B）。CHIP檢測顯示，與抗IgG抗體相比，抗SP1抗體免疫沉淀的ERRα啟動子結(jié)合位點至少富集了12倍，表明SP1能直接結(jié)合到ERRα的啟動子區(qū)域（-1304～-1290bp）（圖9C-D）。此外，抑制EGFR/Src/Erk級聯(lián)能減少SP1與ERRα啟動子的結(jié)合（圖9E）。這些結(jié)果表明，膽固醇介導的EGFR/Src/Erk信號激活可增加SP1的核轉(zhuǎn)位，并通過促進SP1與ERRα啟動子區(qū)結(jié)合，從而直接增強ERRα轉(zhuǎn)錄。圖9A-B進行熒光素酶測定以確定ERRα啟動子活性。C.SP1的結(jié)合位點在啟動子區(qū)域1304-1290bp。D.CHIP-qPCR分析顯示，H1975細胞中SP1結(jié)合位點的啟動子擴增片段在抗SP1抗體和抗IgG抗體的作用下沉淀。E.H1975細胞經(jīng)Osimertinib、SCH772984、WH-4-023處理48小時后進行CHIP-qPCR分析。簡言之，該研究發(fā)現(xiàn)ERRα的再表達是Gefitinib和Osimertinib耐藥的維持因素。長期暴露于Gefitinib或Osimertinib中，導致NSCLC脂筏中膽固醇的積累，從而為