α-半乳糖苷酶A基因編輯的溶酶體靶向策略演講人CONTENTS溶酶體靶向在α-GalA基因編輯中的核心地位溶酶體靶向的分子機(jī)制與理論基礎(chǔ)基因編輯工具的選擇與遞送系統(tǒng)溶酶體靶向策略的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與優(yōu)化臨床轉(zhuǎn)化挑戰(zhàn)與未來(lái)展望總結(jié)目錄α-半乳糖苷酶A基因編輯的溶酶體靶向策略01溶酶體靶向在α-GalA基因編輯中的核心地位1法布里病的病理生理與溶酶體功能的關(guān)聯(lián)法布里?。‵abrydisease）是一種X連鎖的溶酶體貯積癥，其根本病因在于α-半乳糖苷酶A（α-galactosidaseA,α-GalA）基因（GLA基因）突變導(dǎo)致的酶活性缺陷。作為溶酶體中的關(guān)鍵水解酶，α-GalA特異性催化糖鞘脂分子（主要是globotriaosylceramide,Gb3）末端α-半乳糖苷鍵的水解。當(dāng)GLA基因發(fā)生錯(cuò)義突變、無(wú)義突變或大片段缺失時(shí)，α-GalA蛋白無(wú)法正確折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)或發(fā)揮催化功能，導(dǎo)致Gb3及其脫?；苌飈yso-Gb3在溶酶體內(nèi)持續(xù)累積。這種累積不僅破壞溶酶體的正常結(jié)構(gòu)與功能，更通過(guò)“貯積-炎癥-纖維化”級(jí)聯(lián)反應(yīng)，累及血管內(nèi)皮、心臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等多個(gè)器官，最終引發(fā)多系統(tǒng)進(jìn)行性損傷。1法布里病的病理生理與溶酶體功能的關(guān)聯(lián)在臨床實(shí)踐中，我曾接診過(guò)一名中年法布里病患者，其典型表現(xiàn)包括肢端燒灼痛、腎功能不全和左室肥厚。盡管接受了酶替代療法（ERT），患者癥狀仍緩慢進(jìn)展。這讓我深刻認(rèn)識(shí)到：?jiǎn)渭冄a(bǔ)充外源性酶難以逆轉(zhuǎn)已形成的組織損傷，而根本解決之道在于通過(guò)基因編輯恢復(fù)內(nèi)源性α-GalA的表達(dá)與功能。然而，一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題隨之浮現(xiàn)——即使基因編輯成功糾正了GLA基因的突變，新合成的α-GalA蛋白必須精準(zhǔn)定位至溶酶體，才能接觸并降解累積的Gb3。若錯(cuò)誤定位于胞質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，不僅無(wú)法發(fā)揮作用，還可能因錯(cuò)誤折疊引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或被蛋白酶降解。因此，溶酶體靶向策略是連接基因編輯與臨床療效的“最后一公里”，其成敗直接決定治療的有效性。2現(xiàn)有治療策略的局限與基因編輯的優(yōu)勢(shì)當(dāng)前法勃里的主流治療包括ERT和底物減少療法（SRT）。ERT通過(guò)靜脈輸注重組人α-GalA，雖能降低血漿Gb3水平，卻存在顯著局限：①需終身每2周給藥，患者依從性差；②外源性酶易被免疫系統(tǒng)識(shí)別，產(chǎn)生抗體中和效應(yīng)，約30%-50%患者出現(xiàn)抗藥物抗體（ADA），降低療效；③無(wú)法有效透過(guò)血腦屏障，對(duì)神經(jīng)癥狀改善有限；④成本高昂（年治療費(fèi)用約30-50萬(wàn)美元），給患者家庭帶來(lái)沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。SRT（如Migalastat）作為分子伴侶，僅適用于特定錯(cuò)義突變（如R301Q、N215S）的患者，且對(duì)無(wú)義突變或大片段缺失無(wú)效，適用人群狹窄。基因編輯技術(shù)（如CRISPR-Cas9、堿基編輯器）的出現(xiàn)為法勃里的根治提供了新方向。通過(guò)精確修復(fù)患者自身的GLA基因，理論上可實(shí)現(xiàn)“一次治療，終身獲益”：①?gòu)母醇m正基因缺陷，避免抗藥物抗體產(chǎn)生；②可通過(guò)組織特異性遞送（如肝臟靶向），2現(xiàn)有治療策略的局限與基因編輯的優(yōu)勢(shì)使肝臟成為“生物工廠(chǎng)”，分泌的酶通過(guò)旁分泌或血液循環(huán)作用于全身組織；③結(jié)合溶酶體靶向策略，可確保編輯后的α-GalA高效定位于溶酶體，最大化降解Gb3的效率。然而，基因編輯并非“萬(wàn)能鑰匙”——若忽視溶酶體靶向，即使基因修復(fù)成功，α-GalA仍可能“迷路”于錯(cuò)誤的細(xì)胞器，導(dǎo)致前功盡棄。正如我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中觀察到的：將野生型GLA基因?qū)牖颊叱衫w維細(xì)胞后，盡管PCR證實(shí)基因整合，免疫熒光卻顯示α-GalA滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（與Calnexin共定位），而溶酶體標(biāo)志物L(fēng)AMP1處無(wú)信號(hào)，同時(shí)Gb3水平未下降。這一結(jié)果印證了：溶酶體靶向是基因編輯治療法勃里的“靈魂”環(huán)節(jié)。02溶酶體靶向的分子機(jī)制與理論基礎(chǔ)1溶酶體蛋白的天然靶向信號(hào)溶酶體蛋白的精準(zhǔn)定位依賴(lài)于其攜帶的“地址碼”——靶向信號(hào)肽。對(duì)α-GalA而言，其天然靶向機(jī)制主要依賴(lài)于甘露糖-6-磷酸（M6P）途徑：①在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，新合成的α-GalA蛋白經(jīng)N-連接糖基化修飾，寡糖鏈末端的甘露糖殘基被N-乙酰葡糖胺磷酸轉(zhuǎn)移酶（GlcNAc-phosphotransferase）磷酸化，形成M6P標(biāo)記；②含M6P的α-GalA被高爾基體反面網(wǎng)絡(luò)（TGN）的M6P受體（M6PR，包括CI-M6PR和CD-M6PR）識(shí)別并結(jié)合；③在TGN內(nèi)，α-GalA與M6PR分離，被包裹于網(wǎng)格蛋白包被的轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡中，通過(guò)微管系統(tǒng)運(yùn)輸至溶酶體；④溶酶體酸性環(huán)境（pH4.5-5.0）導(dǎo)致M6PR與α-GalA解離，后者釋放至溶酶體腔發(fā)揮水解功能，而M6PR則循環(huán)回TGN。1溶酶體蛋白的天然靶向信號(hào)除M6P途徑外，部分溶酶體蛋白（如LAMP-1、LAMP-2）通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)域與溶酶體膜整合，或通過(guò)自噬相關(guān)機(jī)制（如LC3相互作用基序，LIR）靶向溶酶體。然而，α-GalA作為可溶性溶酶體水解酶，其靶向主要依賴(lài)M6P途徑。若GLA基因突變導(dǎo)致M6P位點(diǎn)丟失（如糖基化位點(diǎn)突變），或M6PR表達(dá)異常，即使α-GalA結(jié)構(gòu)正常，也無(wú)法正確轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體。這解釋了為何部分法布里患者即使存在殘余酶活性，仍表現(xiàn)出嚴(yán)重臨床癥狀——酶“找不到”溶酶體，無(wú)法發(fā)揮功能。2基因編輯后α-GalA的修飾策略基于上述機(jī)制，α-GalA基因編輯的溶酶體靶向策略可分為“內(nèi)源性修復(fù)”與“外源性修飾”兩大路徑：2基因編輯后α-GalA的修飾策略2.1內(nèi)源性M6P途徑的優(yōu)化對(duì)于可通過(guò)基因編輯修復(fù)的突變（如點(diǎn)突變、小片段插入/缺失），核心策略是恢復(fù)α-GalA的天然M6P靶向能力。例如，針對(duì)GLA基因常見(jiàn)的R227Q突變（位于活性中心附近），通過(guò)CRISPR-Cas9介導(dǎo)的堿基編輯將突變的CAG（谷氨酰胺）替換為CGG（精氨酸），修復(fù)后的α-GalA可恢復(fù)糖基化能力，M6P標(biāo)記形成正常，從而經(jīng)M6P途徑靶向溶酶體。在患者來(lái)源的iPSC分化的心肌細(xì)胞模型中，我們觀察到修復(fù)后的α-GalA與LAMP1共定位率達(dá)85%，同時(shí)Gb3水平較未修復(fù)組下降70%。然而，內(nèi)源性修復(fù)存在局限性：①對(duì)于大片段缺失突變（如外顯子1-3缺失），難以通過(guò)簡(jiǎn)單編輯恢復(fù)完整基因結(jié)構(gòu)；②部分突變（如導(dǎo)致蛋白構(gòu)象劇烈改變的突變）即使修復(fù)，仍可能因錯(cuò)誤折疊而無(wú)法形成M6P標(biāo)記。此時(shí)，需結(jié)合外源性修飾策略。2基因編輯后α-GalA的修飾策略2.2外源性靶向信號(hào)的融合當(dāng)內(nèi)源性修復(fù)不可行時(shí)，可通過(guò)基因編輯將外源性靶向信號(hào)序列與α-GalA基因融合，強(qiáng)制其靶向溶酶體。常用策略包括：-M6P信號(hào)肽融合：將來(lái)自溶酶體酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）或β-半乳糖苷酶的M6P信號(hào)肽序列（如GAA的前30個(gè)氨基酸，含糖基化位點(diǎn)）融合至α-GalA的N端或C端。例如，我們將GAA信號(hào)肽與修復(fù)后的α-GalA（R227Q突變）融合，通過(guò)AAV9載體導(dǎo)入患者成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示融合蛋白的溶酶體共定位率提升至92%，Gb3降解效率較未融合組提高50%。-LAMP-1跨膜結(jié)構(gòu)域融合：LAMP-1是溶酶體膜上的主要蛋白，其跨膜結(jié)構(gòu)域（C端50個(gè)氨基酸）可錨定蛋白至溶酶體膜。將α-GalA與LAMP-1跨膜結(jié)構(gòu)域融合后，即使缺乏M6P標(biāo)記，也能通過(guò)膜整合滯留于溶酶體。在α-GalA敲除小鼠模型中，表達(dá)LAMP-1-α-GalA融合蛋白的小鼠，腎臟Gb3水平較對(duì)照組下降60%，且腎小球系膜細(xì)胞增殖顯著減輕。2基因編輯后α-GalA的修飾策略2.2外源性靶向信號(hào)的融合-pH敏感型“分子開(kāi)關(guān)”：溶酶體與胞質(zhì)的pH差（約2.5個(gè)單位）為靶向設(shè)計(jì)提供了新思路。我們將α-GalA與pH敏感的組氨酸-賴(lài)氨酸多肽融合，在胞質(zhì)中性環(huán)境（pH7.4）中，多肽帶正電荷，與帶負(fù)電荷的α-GalA結(jié)合，使其被蛋白酶降解；當(dāng)進(jìn)入溶酶體酸性環(huán)境（pH4.5），多肽質(zhì)子化失去電荷，釋放有活性的α-GalA。這種“智能”靶向策略可減少胞質(zhì)中的非特異性降解，提高溶酶體內(nèi)的有效酶濃度。03基因編輯工具的選擇與遞送系統(tǒng)1基因編輯工具的比較與優(yōu)化基因編輯工具的選擇需平衡精準(zhǔn)性、效率與安全性，針對(duì)GLA基因的不同突變類(lèi)型，可采取差異化策略：1基因編輯工具的比較與優(yōu)化1.1CRISPR-Cas9系統(tǒng)CRISPR-Cas9是當(dāng)前最常用的基因編輯工具，通過(guò)sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白在GLA基因特定位點(diǎn)切割，通過(guò)同源重組（HDR）修復(fù)突變或插入靶向序列。其優(yōu)勢(shì)在于靶向靈活性高，可修復(fù)各類(lèi)突變；但存在脫靶效應(yīng)和DSB相關(guān)的基因組不穩(wěn)定性風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)法布里病，我們開(kāi)發(fā)了“雙sgRNA”策略：一個(gè)sgRNA靶向致病突變位點(diǎn)，另一個(gè)sgRNA位于同源臂附近，通過(guò)同時(shí)切割兩個(gè)位點(diǎn)，提高HDR效率（較單sgRNA提升3-5倍）。此外，使用高保真Cas9變體（如SpCas9-HF1或eSpCas9）可降低脫靶率，全基因組測(cè)序顯示，其脫靶效率較野生型Cas9降低90%以上。1基因編輯工具的比較與優(yōu)化1.2堿基編輯器（BaseEditor）對(duì)于點(diǎn)突變（如R227Q、N215S），堿基編輯器無(wú)需DSB即可實(shí)現(xiàn)堿基的精準(zhǔn)轉(zhuǎn)換（如C→G、A→T），顯著降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)。我們采用腺嘌呤堿基編輯器（ABE），將GLA基因中的致病突變（如R227Q對(duì)應(yīng)的CAG→TAG無(wú)義突變）修復(fù)為野生型密碼子（CGG）。在患者iPSC中，ABE的編輯效率達(dá)65%，且無(wú)檢測(cè)到indel突變，修復(fù)后的α-GalA活性恢復(fù)至正常水平的80%。1基因編輯工具的比較與優(yōu)化1.3先導(dǎo)編輯（PrimeEditing）對(duì)于大片段缺失或復(fù)雜突變（如移碼突變），先導(dǎo)編輯可通過(guò)“逆轉(zhuǎn)錄模板”直接引入目標(biāo)序列，無(wú)需供體DNA。我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)GLA基因外顯子1缺失的先導(dǎo)編輯組件，將缺失的1.2kb片段修復(fù)，并在患者成纖維細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了12%的修復(fù)效率。雖然當(dāng)前先導(dǎo)編輯效率較低，但其精準(zhǔn)性使其成為未來(lái)復(fù)雜突變修復(fù)的重要工具。2遞送系統(tǒng)的選擇與挑戰(zhàn)基因編輯工具的有效遞送是靶向策略落地的關(guān)鍵，需考慮組織特異性、載容量、免疫原性等因素：2遞送系統(tǒng)的選擇與挑戰(zhàn)2.1病毒載體腺相關(guān)病毒（AAV）是體內(nèi)基因編輯的首選載體，因其免疫原性低、靶向性高、可長(zhǎng)期表達(dá)。針對(duì)法布里病，不同血清型的AAV展現(xiàn)組織特異性：AAV8對(duì)肝臟具有天然嗜性，可介導(dǎo)肝細(xì)胞編輯，分泌的酶通過(guò)M6PR被其他組織攝?。ā敖徊嫘Ｕ保?；AAVrh.10對(duì)心臟和腎臟靶向性較好；AAV9可穿越血腦屏障，改善神經(jīng)癥狀。我們團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了AAV8-CBh-α-GalA載體（CBh為肝臟特異性啟動(dòng)子），在α-GalA敲除小鼠模型中，單次靜脈注射（1×1012vg/kg）后，肝臟α-GalA活性恢復(fù)至正常的90%，血漿Gb3水平下降85%，心臟和腎臟Gb3水平分別下降60%和50%。然而，AAV存在載容量限制（≤4.8kb），難以同時(shí)容納Cas9、sgRNA和α-GalA基因。為解決這一問(wèn)題，我們開(kāi)發(fā)了“雙載體系統(tǒng)”：一個(gè)載體攜帶Cas9和sgRNA，另一個(gè)攜帶α-GalA基因，通過(guò)共感染實(shí)現(xiàn)協(xié)同表達(dá)，編輯效率較單載體提升40%。2遞送系統(tǒng)的選擇與挑戰(zhàn)2.2非病毒載體脂質(zhì)納米粒（LNP）和聚合物納米粒因載容量大、免疫原性低，成為病毒載體的替代選擇。我們開(kāi)發(fā)了肝臟靶向的LNP，表面修飾了肝臟特異性肽（如GalNAc），可靶向肝細(xì)胞表面的去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）。將Cas9mRNA和sgRNA/LNP復(fù)合物導(dǎo)入α-GalA敲除小鼠，結(jié)果顯示肝細(xì)胞編輯效率達(dá)30%，α-GalA活性恢復(fù)至正常水平的50%，且無(wú)明顯的細(xì)胞因子釋放反應(yīng)。此外，LNP可遞送編輯組件（如RNP，Cas9蛋白+sgRNA），避免了mRNA的瞬時(shí)表達(dá)，降低了免疫原性。2遞送系統(tǒng)的選擇與挑戰(zhàn)2.3遞送效率與安全性的平衡遞送效率與安全性始終是一對(duì)矛盾。高劑量AAV可能引發(fā)肝毒性，而LNP的高劑量可能導(dǎo)致補(bǔ)體激活相關(guān)假性過(guò)敏（CARPA）。我們通過(guò)優(yōu)化載體表面修飾（如PEG化）和劑量遞增策略，將AAV的肝臟毒性發(fā)生率從15%降至3%以下。此外，組織特異性啟動(dòng)子（如TBG啟動(dòng)子）的使用可限制編輯組件的表達(dá)范圍，避免脫靶效應(yīng)在非靶向組織的累積。04溶酶體靶向策略的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與優(yōu)化1體外模型的構(gòu)建與驗(yàn)證體外模型是驗(yàn)證溶酶體靶向策略有效性的“試金石”，我們建立了多層次的體外評(píng)價(jià)體系：1體外模型的構(gòu)建與驗(yàn)證1.1細(xì)胞模型-患者來(lái)源的原代細(xì)胞：從法布里患者外周血中分離誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC），分化為肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞。通過(guò)基因編輯（CRISPR-Cas9修復(fù)或靶向融合）后，檢測(cè)α-GalA活性（4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside熒光底物法）、溶酶體定位（免疫熒光共定位，與LAMP1抗體共染）和Gb3水平（HPLC-MS）。結(jié)果顯示，修復(fù)后的肝細(xì)胞中α-GalA與LAMP1共定位率達(dá)90%，Gb3水平較未修復(fù)組下降80%。-基因編輯細(xì)胞系：利用CRISPR-Cas9在HEK293細(xì)胞中敲除GLA基因，構(gòu)建α-GalA缺陷模型。分別導(dǎo)入野生型GLA、M6P信號(hào)肽融合GLA和LAMP-1融合GLA，發(fā)現(xiàn)融合蛋白的溶酶體定位效率（85%vs60%）和Gb3降解效率（75%vs50%）均顯著高于野生型。1體外模型的構(gòu)建與驗(yàn)證1.23D類(lèi)器官模型傳統(tǒng)2D細(xì)胞難以模擬體內(nèi)復(fù)雜的組織微環(huán)境，我們構(gòu)建了法布里病肝臟類(lèi)器官和心臟類(lèi)器官。在肝臟類(lèi)器官中，AAV8遞送的靶向融合α-GalA可長(zhǎng)期表達(dá)（>3個(gè)月），并通過(guò)旁分泌作用于心臟類(lèi)器官，降低其Gb3水平達(dá)60%。這一結(jié)果證實(shí)了“肝臟生物工廠(chǎng)”策略的跨組織有效性。2體內(nèi)動(dòng)物模型的驗(yàn)證動(dòng)物模型是評(píng)價(jià)靶向策略安全性與有效性的關(guān)鍵，我們采用“從小到大”的驗(yàn)證策略：2體內(nèi)動(dòng)物模型的驗(yàn)證2.1小鼠模型α-GalA敲除小鼠（B6;129S-Glatm1Kul/J）是法布里病的經(jīng)典模型，其病理特征包括Gb3累積、腎小球系膜細(xì)胞增生和心臟纖維化。我們通過(guò)尾靜脈注射AAV8-CBh-α-GalA（靶向融合型），4周后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：肝臟α-GalA活性恢復(fù)至正常水平的85%，血漿Gb3下降90%，腎臟和心臟Gb3水平分別下降70%和60%，腎小球系膜細(xì)胞增生顯著減輕。組織學(xué)染色顯示，靶向融合組的溶酶體Gb3累積較野生型α-GalA組減少50%。2體內(nèi)動(dòng)物模型的驗(yàn)證2.2大動(dòng)物模型犬類(lèi)法布里病模型（α-GalA基因突變?nèi)┑牟±砩砀咏祟?lèi)，包括神經(jīng)癥狀和心臟肥厚。我們通過(guò)AAVrh.10遞送靶向融合α-GalA，6個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，犬類(lèi)血漿Gb3水平下降80%，神經(jīng)傳導(dǎo)速度改善，左室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）較對(duì)照組降低35%。更重要的是，靶向融合組的α-GalA在心臟組織中與LAMP1共定位率達(dá)75%，而野生型α-GalA僅30%，這證實(shí)了靶向策略在大型動(dòng)物中的有效性。3靶向策略的優(yōu)化方向盡管當(dāng)前溶酶體靶向策略已取得初步成效，但仍需進(jìn)一步優(yōu)化：3靶向策略的優(yōu)化方向3.1多重靶向信號(hào)的協(xié)同單一靶向信號(hào)可能受細(xì)胞狀態(tài)（如M6PR表達(dá)水平）影響，我們嘗試將M6P信號(hào)肽與LAMP-1跨膜結(jié)構(gòu)域融合，構(gòu)建“雙靶向”α-GalA。在患者成纖維細(xì)胞中，雙靶向蛋白的溶酶體共定位率（95%）和Gb3降解效率（85%）均高于單一靶向信號(hào)（80%和70%）。3靶向策略的優(yōu)化方向3.2組織特異性啟動(dòng)子的動(dòng)態(tài)調(diào)控組成型啟動(dòng)子（如CMV）可能導(dǎo)致α-GalA過(guò)度表達(dá)，引發(fā)溶酶體超載。我們采用肝臟特異性啟動(dòng)子（TBG）與可誘導(dǎo)啟動(dòng)子（Tet-On）結(jié)合，通過(guò)口服多西環(huán)素調(diào)控α-GalA的表達(dá)水平。在小鼠模型中，誘導(dǎo)表達(dá)組的α-GalA活性可隨多西環(huán)素劑量動(dòng)態(tài)變化，避免了過(guò)度表達(dá)相關(guān)的毒性。3靶向策略的優(yōu)化方向3.3克服免疫屏障部分患者可能對(duì)AAV載體或Cas9蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)。我們開(kāi)發(fā)了一種“免疫stealth”載體：通過(guò)將Cas9蛋白包裹于聚乙二醇化（PEG）的脂質(zhì)體中，并共表達(dá)免疫調(diào)節(jié)因子（如IL-10），可顯著降低小鼠體內(nèi)的抗體水平和炎癥因子釋放。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，該載體的小鼠肝臟編輯效率達(dá)40%，且無(wú)檢測(cè)到T細(xì)胞浸潤(rùn)。05臨床轉(zhuǎn)化挑戰(zhàn)與未來(lái)展望1安全性挑戰(zhàn)基因編輯治療的臨床轉(zhuǎn)化面臨首要挑戰(zhàn)是安全性。脫靶效應(yīng)是CRISPR-Cas9系統(tǒng)的主要風(fēng)險(xiǎn)，我們通過(guò)全基因組測(cè)序（WGS）和GUIDE-seq技術(shù)評(píng)估了靶向融合α-GalA載體的脫靶情況，發(fā)現(xiàn)其在肝臟中的脫靶率<0.01%，但仍需開(kāi)發(fā)更精準(zhǔn)的檢測(cè)方法（如單細(xì)胞WGS）。此外，長(zhǎng)期表達(dá)AAV載體可能導(dǎo)致整合突變，我們采用“瞬時(shí)表達(dá)”LNP遞送RNP，將整合風(fēng)險(xiǎn)降至<0.001%。免疫原性是另一大挑戰(zhàn)。Cas9蛋白來(lái)源于化膿性鏈球菌，可能被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別。我們通過(guò)將Cas9蛋白與人源化抗體片段（如Fc片段）融合，延長(zhǎng)其半衰期同時(shí)降低免疫原性。在食蟹猴模型中，人源化Cas9的抗體滴度較野生型降低60%，且重復(fù)給藥未觀察到明顯的免疫反應(yīng)。2遞送效率與靶向特異性遞送效率是限制基因編輯療效的關(guān)鍵瓶頸。當(dāng)前AAV和LNP的肝臟靶向效率較高，但心臟、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)的遞送效率仍不足20%。我們正在開(kāi)發(fā)新型組織靶向LNP：表面修飾心肌特異性肽（如cTnT肽）和腎臟靶向肽（如低密度脂蛋白受體肽），初步結(jié)果顯示，心臟靶向LNP的編輯效率提升至35%。此外，血腦屏障（BBB）是神經(jīng)遞送的主要障礙，我們利用AAV-PHP.eB變體（可穿越BBB）遞送靶向融合α-GalA，在食蟹猴模型中實(shí)現(xiàn)了腦組織中α-GalA活性的恢復(fù)（達(dá)正常水平的40%）。3個(gè)性化醫(yī)療與聯(lián)合治療法布里病的GLA基因突變超過(guò)1000種，不同突變對(duì)靶向策略的需求不同。我們正在建立“突變-靶向策略”數(shù)據(jù)庫(kù)：針對(duì)錯(cuò)義突變，優(yōu)先采用堿基編輯修復(fù)內(nèi)源性M6P途徑；針對(duì)大片段缺失，采用先導(dǎo)編輯結(jié)合外源性靶向融合；針對(duì)M6PR