ICS11.020CCSC05CAWAORG中國老年保健協(xié)會團體標準T/CAWAORG054.1—2025基于外周血淋巴細胞亞群分析的免疫力檢測評估及臨床應用1ClinicalapplicationandlabevaluatonofimmunitybasedonanalysisofperipheralbloodlymphocytesubsetsPart1:Detectionmethods2025-12-10發(fā)布 2026-01-01實施中國老年保健協(xié)會??發(fā)布T/CAWAORG054.1T/CAWAORG054.1—2025PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANIII目 次前 言 II引 言 III范圍 1規(guī)范性引用文件 1術語和定義 1縮略語 1檢測原理 2實驗條件 2試劑與材料 2儀器設備 3性能驗證 3技術流程圖 3檢驗前過程 3樣本處理 4樣本檢測和分析 5檢測報告 6質(zhì)量控制 6附錄A（規(guī)范性）淋巴細胞亞群檢測系統(tǒng)的性能驗證 7附錄B（資料性）使用細胞保存液多色流式細胞免疫表型分析散點圖及淋巴細胞百分率變化對比 9附錄C（資料性）樣本分析示例 11附錄D（資料性）免疫檢測指標參考范圍 12前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由北京銘道眾緣生物科技有限公司和中國老年保健協(xié)會老年健康標準分會聯(lián)合提出。本文件由中國老年保健協(xié)會歸口。本文件起草單位：北京銘道眾緣生物科技有限公司、北京朝陽醫(yī)院、中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、北京銘道醫(yī)學檢驗實驗室有限公司。本文件主要起草人：李先亮、紀智禮、賀強、周林、王巍、張繼紅、竇亞玲、郭瑛、孫彥波、姚偉麗。引 言背景免疫力是人體健康的基石。2023年8月28日，國家自然科學基金會發(fā)布了“免疫力數(shù)字解碼”重大30個亞群60組成T/CAWAORG054-2025第1部分：檢測方法第2部分：評估標準及臨床應用專利說明12.2（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）提取相關的專利的使用。本文件的發(fā)布機構對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機構承諾，他愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，專利持有人姓名：銘道創(chuàng)新（北京）醫(yī)療技術有限公司地址：北京市北京經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)科創(chuàng)三街24號10幢請注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。T/CAWAORG054.1T/CAWAORG054.1—2025PAGEPAGE10基于外周血淋巴細胞亞群分析的免疫力檢測評估及臨床應用1范圍本文件適用于具備流式細胞檢測能力的醫(yī)學檢驗實驗室和研究中心。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。WS/T360-2024流式細胞術檢測外周血淋巴細胞亞群指南WS/T661-2020靜脈血液標本采集指南術語和定義WS/T360-2024界定的以及下列術語和定義適用于本文件。白細胞分化抗原、前向散射光、側向散射光、設門、熒光強度、熒光補償、熒光微球。下列術語和定義適用于本文件。peripheralbloodmononuclearcell外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞和單核細胞。免疫力immunity人體自身的防御保護機制，是人體識別和消滅外來侵入的任何異物（病毒、細菌等）、處理衰老、損傷、死亡、變性的自身細胞，以及識別和處理體內(nèi)突變細胞和病毒感染細胞的能力。正常免疫力healthyimmunity3）T細胞與BnatralkilerNK（）CDT細胞和CDT5CDT細胞或CDT縮略語下列縮略語適用于本文件。PBS：磷酸鹽緩沖液EDTA/EDTA-K2：乙二胺四乙酸/乙二胺四乙酸二鉀PBMC：外周血中具有單個核的細胞CD：白細胞分化抗原NK：自然殺傷細胞DC：樹突狀細胞檢測原理TCD3、CD4、CD8；BCD19、CD20；NKCD16、CD56；DCCD11c、CD123TCD25（僅表達于特定淋巴細胞亞群和功能相關性（實驗條件實驗室溫度：實驗室溫度應穩(wěn)定（20℃～25℃）。樣本處理推薦在低溫條件（例如：在冰盒上）下完成整個操作流程。30%～70%。實驗室光線要求：實驗室應避免陽光直射。實驗室噪聲和振動：實驗室應有效隔離噪聲，并減少振動干擾。實驗室電源要求：連接儀器的電源應使用不間斷電源（UPS）。儀器資質(zhì)：所有儀器均須有醫(yī)療器械注冊證，使用中每年進行計量校準。試劑與材料試劑選用原則推薦使用免疫狀態(tài)量化評估檢驗試劑盒。試劑和材料PBS1×PBS緩沖液、EDTA、胎牛血清組成PBS緩沖液。裂解液NHClEDT樣本密度分離液密度為1.077±0.001g/mL。上機液由1×PBS、EDTA、純水組成。樣本運輸保存液由N2HP、K2PNaC、EDA-pH7.～7.。流式管12mm×75mm流式專用管。樣本離心管15ml尖嘴離心管。儀器設備流式細胞儀應為兩激光或三激光檢測系統(tǒng)，至少配備488nm和640nm激光器，具備六個熒光檢測通道。血細胞分析儀應為五分類血細胞分析儀。離心機離心力300～500g，水平轉子。建議配置低溫離心機。移液器量程（0.5～10μL、10～100μL、20～200μL、100～1000μL）。漩渦振蕩器點動式，圓周振蕩。性能驗證流式細胞儀的性能驗證驗證時機和驗證參數(shù)參考WS/T360-2024第5.1條流式細胞儀的性能驗證執(zhí)行。淋巴細胞亞群檢測系統(tǒng)的性能驗證包括試劑精密度驗證、穩(wěn)定性驗證、線性范圍驗證、不同檢測人員可比性驗證。具體見附錄A。技術流程圖技術流程見圖1。圖1技術流程圖檢驗前過程樣本采集選擇含有EDT-K2抗凝管采集靜脈血樣品5ml。，靜脈血的采集過程按照WS/T66-200第5條執(zhí)行，過程如下：選擇手臂肘前區(qū)靜脈，優(yōu)先順序為正中靜脈、貴要靜脈。（（約30秒。在靜脈采血部位近心端用手指按壓靜脈，使靜脈充盈暴露。30°左右的角度刺入靜脈。將EDA-完成采血，拔出采血針，進行止血。樣本處理樣本處理要求如下：6h。6h7218～25（2～8℃）運輸。7C。樣本核收核收要求實驗室收到的樣本應及時進行質(zhì)量控制檢查，樣本不宜出現(xiàn)溢灑、凝集、標識不清現(xiàn)象。核收記錄所有樣本在處理前均需進行核對、登記，包括樣本的來源、類型、采集時間，便于核查追溯。樣本處理白細胞計數(shù)PBMCPBMCPBMC應立即紅細胞裂解PBMC2ml，點振混勻，415min檢查紅細胞是否完全裂解（樣本管肉眼觀呈透明酒紅色），若未完全裂解，可適當延長孵育時間。5min400g，棄去上清?？贵w染色孵育抗體配置樣本染色將PBMC稀釋到2×106/mL細胞，嚴格按照試劑盒說明書推薦使用量使用抗體進行樣本染色。4℃避光孵育20min。洗滌使用PBS緩沖液進行樣本洗滌，離心5min，離心力400g，棄去上清。加上機液洗滌后加入400μL上機液制成細胞懸液，渦旋振蕩器點振混勻。進行流式細胞儀檢測。樣本檢測和分析樣本檢測開機按照儀器操作規(guī)程進行檢查和開機。穩(wěn)定性驗證在流式細胞儀開機后，使用質(zhì)控微球進行光路/液路穩(wěn)定性驗證，確保檢測通道分辨率的變異系數(shù)（CV）達到廠家規(guī)定標準（參照廠家儀器說明書）。室內(nèi)質(zhì)控質(zhì)控品和患者樣品在相同條件下進行免疫熒光染色，分析質(zhì)控數(shù)據(jù)，符合質(zhì)控要求后進行樣本測試。熒光補償在進行樣本檢測前，選擇與檢測通道一致的熒光素標記抗體和單染樣本染色孵育作為熒光單染對照?！緛碓矗篧S/T360-2024，7.2.4】建立檢測模板根據(jù)檢測項目，分別建立模板，包括B細胞檢測、NK細胞及NKT細胞檢測、T細胞及精細亞群檢測和DC細胞檢測。數(shù)據(jù)獲取FSC/SSC定淋巴細胞群。使淋巴細胞群處于散點圖中顯著位置，著重排除單核細胞和嗜堿性粒細胞在散點圖上的干擾。設門和熒光補償須保證細胞亞群能夠出現(xiàn)單獨分離的群，避免連續(xù)的細胞群出現(xiàn)。10000樣本分析BCD19+B、CD20+BBD。在NKCD-CDTCD5CD1對細胞計數(shù)。在TCD4CD8TTT的相對細胞計數(shù)。在DCCD1c、CD2數(shù)據(jù)分析可靠性驗證T、BNK100%±5%。CD4+TCD8+TCD3+T5%范圍內(nèi)。方案中各管含同一抗體指標，該指標在各管中的差異應≤5%。B。注：在完成數(shù)據(jù)分析后，應進行數(shù)據(jù)分析可靠性驗證，如果發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)有異常，需要重新檢查實驗過程和數(shù)據(jù)獲取，直至滿足標準為止?！緛碓矗篧S/T360-2024，3.3】檢測報告數(shù)據(jù)完成驗證無誤后，可導入實驗室信息系統(tǒng)（LIS）生成淋巴細胞亞群免疫力檢測報告。報告中應包含以下內(nèi)容：—樣本唯一編號、樣本類型、臨床診斷、檢測方法、檢測系統(tǒng)?！軝z者姓名、性別、年齡?！蜋z機構名稱?！獧z測機構名稱、地址及咨詢電話?！獧z測項目、檢測結果、計量單位、參考區(qū)間及異常提示。—檢驗者姓名、審核者姓名、標本采集時間、核收時間、報告時間。—報告還應包括實驗中所遇到的異常情況以及說明。質(zhì)量控制室內(nèi)質(zhì)控室間質(zhì)評實驗室應每年參加國家衛(wèi)健委或當?shù)嘏R檢中心組織的全血細胞分析室和淋巴細胞分析室間質(zhì)評活動，跟蹤室間質(zhì)評結果的回報，對于不合格結果，要及時分析原因，進行整改。不同實驗室間樣本比對人員培訓與考核進行免疫力檢測技術人員應為醫(yī)學檢驗專業(yè)技術人員。實驗室應定期組織人員進行專業(yè)培訓，考核內(nèi)容包括理論知識和實際操作，確保每位操作人員熟練掌握檢測流程和技術要點。培訓記錄和考核結果需存檔備查，以持續(xù)提升實驗室整體檢測水平。驗證時機

附 錄 A（規(guī)范性）淋巴細胞亞群檢測系統(tǒng)的性能驗證臨床開展初期、更換試劑品牌（自購試劑）或儀器的重大部件維修后。驗證內(nèi)容檢測項目的精密度、穩(wěn)定性、線性范圍、可比性和正確度。驗證方法使用配套試劑盒開展性能驗證。精密度驗證批內(nèi)精密度驗證選取53CV日間精密度驗證34穩(wěn)定性驗證樣品穩(wěn)定性驗證樣品室溫條件下在EDTA5mlEDTA真空采血管采集健康人5處理后樣品的穩(wěn)定性旨在明確處理后標本的最長待檢時間。采集健康人樣品5份，對完成染色－裂解－固定后的標本即線性范圍驗證5～9（如025%、50754次，取均值。分析實際測定值與理論值的相關性，相關系數(shù)r應≥0.975，確保檢測結果的準確性和可靠性。不同檢測人員的可比性驗證分別取5份新鮮EDTA附 錄 B（資料性）使用細胞保存液多色流式細胞免疫表型分析散點圖及淋巴細胞百分率變化對比未使用細胞保存液的EDTA抗凝血樣本和使用細胞保存液樣本的多色流式散點圖比對見圖B.1B.2。圖B.1EDTA抗凝血樣本圖B.2 細胞保存液樣本未使用細胞保存液的EDTA抗凝血樣本和使用細胞保存液樣本多色流式淋巴細胞亞群變化比對見圖B.3。圖B.3 使用細胞保存液前后各淋巴細胞百分率變化比對附 錄 C（資料性）（CD3/CD19/CD20）來檢測B在FSC-H/SSA-H散點圖中進行設門圈定淋巴細胞群；在Main的FSC-H/FSC-A散點圖中對單個細胞設門，去除粘連細胞；c）在lym的FITC-H/PE-H散點圖中對CD19+B細胞分析；d在lyFIT-H/erC-HCD2B注：Main：對淋巴細胞設門；Lym：對單個細胞設門。圖C.1樣本分析示例圖免疫檢測指標參考范圍見表D.1

附 錄 D（資料性）免疫檢測指標參考范圍表D.1免疫檢測指標參考圖項目單位性別參考區(qū)間白細胞計數(shù)10/L男/女3.56～9.5中性粒細胞絕對值10/L男/女1.8～6.3淋巴細胞絕對值10/L男/女1.1～3.2單核細胞絕對值10/L男/女0.1～0.6嗜酸性粒細胞絕對值10/L男/女0.02～0.52嗜堿性細胞絕對值10/L男/女0～0.06中性粒細胞百分數(shù)%男/女40～75淋巴細胞百分數(shù)%男/女20～50單核細胞百分數(shù)%男/女3～10嗜酸性粒細胞百分數(shù)%男/女0.4～8.0嗜堿性細胞百分數(shù)%男/女0～1免疫球蛋白Gg/L男/女8.6～17.4免疫球蛋白Ag/L男/女1.0～4.2免疫球蛋白Mg/L男0.3～2.2免疫球蛋白Mg/L女0.5～2.8補體C3g/L男/女0.7～1.4補體C4g/L男/女0.1～0.4CDT個/μl男/女550～2688CDCDT個/μl男/女297～1632CDCDT個/μl男/女165～1408CDCD1B個/μl男/女55～576CDCD2B個/μl男/女47