ICS65.150

CCSB50

21

遼寧省地方標準

DB21/T4330—2025

夏洛來羊體外胚胎生產及手術法胚胎移植

技術規(guī)范

Technicalspecificationforinvitroembryoproductionandsurgical

embryotransferofCharlottesheep

2025-11-30發(fā)布2025-12-30實施

遼寧省市場監(jiān)督管理局??發(fā)布

DB21/T4330—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由遼寧省農業(yè)農村廳提出并歸口。

本文件起草單位：錦州醫(yī)科大學、朝陽市朝牧種畜場有限公司、遼寧省農業(yè)發(fā)展服務中心。

本文件主要起草人：王春強、張賀春、韓迪、張喆、馬巍、李純錦、張楚依、田俊英、王恩輝、李

寧、楊友成。

本文件發(fā)布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋，

我們將及時答復并認真處理，根據實際情況依法進行評估及復審。

歸口管理部門通訊地址：遼寧省農業(yè)農村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號），聯(lián)系電話

起草單位通訊地址：錦州醫(yī)科大學（遼寧省錦州市凌河區(qū)松坡路三段40號），聯(lián)系電話：（0416）

3675111，3675222。

I

DB21/T4330—2025

夏洛來羊體外胚胎生產及手術法胚胎移植技術規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了夏洛來羊供體羊選擇與飼養(yǎng)管理、供體羊激素處理、卵母細胞采集、卵母細胞體外成

熟及鑒定、體外受精、胚胎體外培養(yǎng)及鑒定、胚胎冷凍保存及解凍、受體羊選擇及飼養(yǎng)管理、手術法胚

胎移植和妊娠診斷的體外胚胎生產及手術法胚胎移植主要環(huán)節(jié)的技術要求。

本文件適用于夏洛來羊體外胚胎生產及移植。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期的對應版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T5458液氮生物容器

NY/T1571羊胚胎移植技術規(guī)程

NY/T1900畜禽細胞與胚胎冷凍保種技術規(guī)范

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

體外胚胎生產invitroembryoproduction

指對供體母羊進行激素處理和活體采集卵母細胞，或從屠宰場摘取卵巢后采集卵母細胞，在體外條

件下對卵母細胞進行成熟培養(yǎng)、體外受精、胚胎培養(yǎng)，生產可用于胚胎移植的胚胎的過程。

3.2

羊胚胎移植技術ovineembryotransfertechnology

通過手術法收集的良種母羊體內早期胚胎，或通過體外受精及其他方式獲得的體外早期胚胎，移植

到相同生理狀態(tài)的同種受體母羊體內，使之繼續(xù)發(fā)育成新個體的生物技術。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

CIDR：孕激素陰道栓（ControlledInternalDrugReleasingdevice）

FSH：促卵泡生成素（follicle-stimulatinghormone）

PG：前列腺素（Prostaglandin)

COCs：卵丘-卵母細胞復合體（Cumulus-oocytecomplex)

PMSG：孕馬血清促性腺激素（PregnantMareSerumGonadotropin）

IVM：卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液(InVitroMaturation)

1

DB21/T4330—2025

IVF：體外受精液(InVitroFertilization)

IVC：體外培養(yǎng)液(InVitroCulture)

5供體羊與受體羊的選擇與飼養(yǎng)管理

5.1選擇條件

按照NY/T1571對供體羊和受體羊進行選擇。

5.2飼養(yǎng)管理

按照NY/T1571對供體羊和受體羊進行飼養(yǎng)管理。

6供體羊激素處理

6.1藥品

所需藥品按NY/T1571執(zhí)行。

6.2激素處理方式

在發(fā)情周期的任意一天早6：00放CIDR，記為第0d；第7d更換CIDR。第12d～14d，采用逐漸遞

減法連續(xù)3d肌注FSH，每天早6：00和晚18：00各1次。3d注射總量為360mg，第1d每次注射80mg，第

2d每次注射60mg、第3d每次注射40mg。在第一次注射FSH的同時肌注PG2mL，在第6次注射FSH的同

時取出CIDR。

7卵母細胞采集

7.1活體采卵

供體羊的保定、麻醉、消毒、手術過程按NY/T1571執(zhí)行。供體羊腹腔打開后，食指和中指從刀口

進入，在骨盆腔、恥骨前沿觸摸子宮角，并將子宮、卵巢引出刀口外。用吸有抽卵液（配制方式詳見附

錄A）的10mL注射器抽取突出卵巢表面的卵泡，邊緣用紗布止血。將卵泡液體置于60mm平皿內，在體

視鏡下?lián)斐鏊新涯讣毎?/p>

卵丘細胞2層以上，胞質均勻為合格的COCs。手術后供體的子宮角需噴涂普魯卡因青霉素凝膠，大

腿部需注射土霉素進行消炎處理，同時肌肉注射4mg～6mg的PGF2α，消除卵巢上黃體。

7.2離體采卵

取屠宰1h內的羊卵巢，放入含100IU/mL青鏈霉素雙抗的37℃生理鹽水中，運回實驗室。用剪

刀將卵巢周圍的結締組織去除干凈，38.5℃生理鹽水清洗卵巢3次，并浸泡于生理鹽水中。用吸水紙

吸附卵巢上的生理鹽水，再用吸有抽卵液的注射器抽吸突出卵巢表面的卵泡，將卵泡液體置于60mm

平皿內，在體視鏡下?lián)斐鏊新涯讣毎?/p>

8卵母細胞體外成熟及成熟鑒定

2

DB21/T4330—2025

將撿出的卵母細胞用抽卵液洗滌3次，再用IVM液（配制方式詳見附錄A）洗滌3次，按50枚/孔～80

枚/孔的密度，放入0.6mL/孔IVM液并覆蓋0.3mL礦物油的四孔板內。38.5℃、5%CO2、飽和濕度的37℃

二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。卵母細胞成熟標準為：第一極體形態(tài)正常、胞質均勻、顆粒均勻、卵周隙

內無雜質以及透明帶形態(tài)正常。

9體外受精

9.1鮮精體外受精

9.1.1對種公羊的選擇

按照NY/T1571對種公羊進行選擇。

9.1.2采精

采精前對種公羊外生殖器清洗消毒。采集的精液外觀及氣味正常，精子活力大于0.7，畸形率小于

15%，可進行后續(xù)操作。精液用稀釋液按1:1稀釋，放入含有30℃溫水的250mL燒杯中，置于4℃冰箱

中平衡1.5h，待用。

9.1.3鮮精上浮

取0.2mL平衡好的鮮精加入裝有2mLIVF液（輸卵管緩沖液SOF）的圓底試管底部，將試管傾斜45°，

置于二氧化碳培養(yǎng)箱內，待精子上浮30min后，取上層約1mL液體于1.5mL離心管內，用1500r/min轉

速離心4min兩次，棄去上清，留約0.1mL，輕輕混勻，制成精子混懸液，備用。

9.1.4體外受精

用含量0.1%的透明質酸酶對成熟后的卵母細胞進行處理，除去部分卵丘細胞，并用IVF液洗滌3

次后置于裝有0.5mLIVF液的四孔培養(yǎng)皿內。取30μL精子混懸液至四孔培養(yǎng)皿內，與卵母細胞共同

孵育。將精子和卵母細胞共同孵育18h～24h的受精卵用IVC液洗滌3次，去除粘附于卵母細胞表面

的精子。

9.2凍精體外受精

從符合GB/T5458的液氮中迅速取出凍精細管，投入37℃水浴鍋解凍15s～20s，取出細管并用

紗布擦拭，剪掉細管的兩端，將精液推入1.5mL的離心管內，用移液槍將精液移入含1mLIVF液的試

管底部，上浮30min后，按照操作步驟9.1.3和9.1.4進行體外受精。

10胚胎體外培養(yǎng)及鑒定

10.1胚胎體外培養(yǎng)

將受精卵置于IVC四孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至48h，顯微鏡下統(tǒng)計卵裂率，按照NY/T1571對胚胎進行

等級鑒定，其中1、2級胚胎可用于胚胎移植,發(fā)育至囊胚的胚胎可用于胚胎冷凍。早期胚胎發(fā)育模式圖

見附錄B。

10.2胚胎質量鑒定

3

DB21/T4330—2025

采集的胚胎用事先在培養(yǎng)箱預熱的平皿接收，寫好編號，置于26℃的恒溫板上。用實體顯微鏡在

平皿中分檢可用的胚胎放入含有胚胎保持液的平皿中，蓋好平皿蓋后待處理。早期胚胎發(fā)育模式圖見附

錄B。按照NY/T1571對胚胎進行等級鑒定，其中1、2級胚胎可用于胚胎移植或冷凍保存。

11胚胎冷凍保存與解凍

11.1胚胎的冷凍保存

按照NY/T1900對胚胎進行冷凍保存。

11.2冷凍胚胎的解凍

從液氮中取出裝有胚胎的細管，空氣中停留10s～15s后投入35℃水浴鍋中，輕輕晃動細管約

15s，待細管中有氣泡產生，剪去細管塞，將胚胎移入0.2mol/L～0.5mol/L蔗糖磷酸鹽緩沖液中3min～

5min，將胚胎移至保存液中洗滌3次～4次后對胚胎進行鑒定，2級以上胚胎可進行移植。

12手術法胚胎移植

12.1受體羊同期發(fā)情處理

在發(fā)情周期的任意一天早8:00放入CIDR，同時注射PGF2α2mL，記為第0d，第6d早8:00去栓

的同時肌注300IUPMSG，此后三天觀察發(fā)情。

12.2受體羊胚胎移植

受體母羊移植部位的消毒方法與采卵時的消毒方法相同。用腹腔鏡觀察受體母羊卵巢上的黃體情況，

對有1cm～2cm且圓潤飽滿黃體的受體進行手術法子宮角移植?？梢浦?枚1級胚胎，或2枚2級胚

胎。消炎處理按7.1執(zhí)行。

12.3胚胎發(fā)育期與受體移植時間的對應關系

胚胎發(fā)育期與受體移植時間的對應關系見附錄C，移植時機應根據受體時間選擇對應時期胚胎進行

移植。

13妊娠診斷

連續(xù)觀察2個～3個情期后受體無發(fā)情表現(xiàn)再用B超檢測，或直接在45d～60d通過B超的方法

檢查一次，結合母羊表現(xiàn)可判定是否受孕。

4

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附錄A

（資料性）

體外胚胎生產培養(yǎng)液配制

A.1抽卵液的配制

在TCM199-hepes液的基礎上，添加2%FBS、0.7mg/mL肝素鈉和100IU/mL雙抗。

A.2卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液(IVM)的配制

在TCM199液的基礎上，添加10%FBS、0.05IU/mL的FSH、0.05IU/mL的LH、1μg/mL的雌二醇、24.2

g/mL的丙酮酸鈉、0.1mM半胱氨酸、10ng/mL的EGF和100IU/mL的雙抗。

A.3體外受精液(IVF)的配制

輸卵管緩沖液SOF液體的成分:6.29mg/mL氯化鈉、0.534mg/mL氯化鉀、0.162mg/mL磷酸二氫鉀、

0.6μL/mL乳酸鈉、0.089mg/mL硫酸鎂、2.1mg/mL碳酸氫鈉、0.0357mg/mL丙酮酸鈉、0.299mg/mL

二水氯化鈣、1%NEAA、2%BAA、100IU/mL雙抗。

體外受精液成分：在SOF液的基礎上，添加20%FBS、6IU/mL肝素鈉和100IU/mL慶大霉素。

A.4體外培養(yǎng)液(IVC)的配制

體外培養(yǎng)液成分：在SOF液的基礎上，添加3mg/mL牛血清白蛋白。

5

DB21/T4330—2025

附錄B

（資料性）

早期胚胎發(fā)育模式圖

早期胚胎發(fā)育模式見圖B.1。

a)1細胞b)2-細胞c)4-細胞d)8-細胞e)16-細胞f)早期桑葚期

g)緊縮桑葚胚胎h)早期胚胎i)囊胚j)擴張囊胚k)孵化囊胚l)擴張的孵化囊胚

標引序號說明：

a)—未受精卵或1-細胞胚胎，為1.0日齡胚胎；

b)—2-細胞胚胎，為1.0～2.0日齡胚胎；

c)—4-細胞胚胎，為2.0～2.5日齡胚胎；

d)—8-細胞胚胎，為2.5～3.0日齡胚胎；

e)—16-細胞胚胎，為3.0～4.0日齡胚胎；

f)—早期桑葚胚，為4.0～5.0日齡胚胎；

g)—緊縮桑葚胚，為5.0～5.5日齡胚胎；

h)—早期囊胚，為5.5～6.0日齡胚胎；

i)—囊胚，為6.0～6.5日齡胚胎；

j)—擴張囊胚，為6.0～7.0日齡胚胎；