ICS65.020.30

CCSB40

15

內蒙古自治區(qū)地方標準

DB15/T4169—2025

奶綿羊常規(guī)及性控冷凍精液生產(chǎn)技術規(guī)程

Codeofpracticeforproductionofdairysheepfrozenconventional

semenandsexed-semen

2025-08-15發(fā)布2025-09-15實施

內蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T4169—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由內蒙古大學、內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)技術推廣中心提出。

本文件由內蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標準化技術委員會（SAM/TC19）歸口。

本文件起草單位：內蒙古大學、內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)技術推廣中心、內蒙古農業(yè)大學、內蒙古烏蘭

察布市畜牧工作站、呼和浩特市農牧技術推廣中心、內蒙古樂科生物技術有限公司、河套學院、內蒙古

豐東知盈牧業(yè)科技有限公司、內蒙古賽科星家畜種業(yè)與繁育生物技術研究院有限公司、內蒙古自治區(qū)農

牧業(yè)科學院、蒙天然牧業(yè)科技發(fā)展有限公司。

本文件主要起草人：王申元、武志紅、張立、劉永斌、李喜和、張立果、武霞霞、董志岷、寇慧娟、

蘇小虎、宋永利、張滕、趙高平、朱怡靜、張功、包花拉、劉光男、劉建寧、莫德日樂吐、劉權、劉信、

阿侖、丁瑞、周揚、楊燕燕、薩仁格勒。

I

DB15/T4169—2025

奶綿羊常規(guī)及性控冷凍精液生產(chǎn)技術規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了奶綿羊常規(guī)及性控冷凍精液生產(chǎn)的器具準備與消毒、溶液配制、精液采集、精液處理、

精液冷凍、冷凍精液質量檢驗、貯存和運輸要求。

本文件適用于奶綿羊常規(guī)及性控冷凍精液的生產(chǎn)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB20557山羊冷凍精液

GB/T31581牛性控冷凍精液生產(chǎn)技術規(guī)程

NY/T3186羊冷凍精液生產(chǎn)技術規(guī)程

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

奶綿羊dairysheep

以產(chǎn)奶為主要生產(chǎn)方向的綿羊品種。

頂體完整率acrosomeintegrityrate

頂體完整的精子數(shù)量占所觀察精子數(shù)量的百分比。

質膜完整率plasmamembraneintegrity

質膜完整的精子數(shù)量占所觀察精子數(shù)量的百分比。

冷凍精液frozensemen

經(jīng)特殊方法處理并超低溫冷凍后在液氮中（-196℃）長期保存的精液。

4器具準備與消毒

1

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按照NY/T3186要求執(zhí)行。

5溶液配制

精子稀釋液

按照附錄A執(zhí)行。

其它溶液

精子分離緩沖液、精子熒光染色液、食品紅染色液、精子染色原液和精子收集液按照GB/T31581要

求配制。

6精液采集

按照NY/T3186要求執(zhí)行。

7精液處理

精液品質檢查

7.1.1鮮精外觀

正常的精液色澤為乳白色或淡黃色，質地均勻、無異物。

7.1.2鮮精密度

精子密度測定儀檢測鮮精密度，合格鮮精精子密度≥8×108個/mL。

7.1.3鮮精活力

活力檢查按照GB20557要求執(zhí)行，合格精子活力≥70%。

常規(guī)精液稀釋

7.2.1稀釋密度

精液稀釋解凍后每支0.25mL細管中前進運動精子數(shù)≥1.5×107個。

7.2.2稀釋步驟

評估合格的精液依據(jù)最終精子密度為每毫升不小于2×108個計算出稀釋后總體積。選用合適體積的

器皿加1倍體積37℃預熱的TrisA液稀釋；37℃水浴10min后加2倍體積的TrisA液稀釋；再水浴10min

后加TrisA至總體積的一半稀釋，水浴10min。TrisA稀釋后的精液封口后置于含37℃水的250mL燒杯

中，在4℃低溫柜中平衡2h，加冷藏的TrisB液至總體積，再在4℃低溫柜中平衡1h，待分裝。

性控精液分離、稀釋

7.3.1精子分離

2

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評估合格的精液使用TrisA液按體積1:1等溫稀釋后，置于18℃～20℃的環(huán)境下保存、待用。精子

分離步驟按照GB/T31581要求執(zhí)行。分離精子收集液中每毫升添加0.01mg～0.05mg的過氧化氫酶和

0.2mg～0.5mg的谷胱甘肽還原酶。

7.3.2分離精子稀釋

分離后的精子收集液在4℃條件下平衡90min，然后4℃、850g離心20min，去除上清液，用含

20%卵黃的TrisA液稀釋精子，之后添加等體積的TrisB液，平衡20min；然后用等體積的TrisA液和TrisB

液將最終精子密度調整為每毫升≥1×107個。

7.3.3稀釋密度

精液稀釋解凍后每支0.25mL細管中前進運動精子數(shù)≥1×106個。

精液分裝與標識

平衡后的精液在4℃條件下用無菌0.25mL細管灌裝、封口、印字，細管上橫向打印生產(chǎn)單位代號、

品種、種公羊號、生產(chǎn)日期或批號、是否性控等標識信息（按照附錄B執(zhí)行）。

8精液冷凍

在4℃條件下將分裝后的細管按照棉塞同一方向碼放在冷凍架上，然后放入程序控制冷凍儀中。冷

凍程序設置為：4℃～-10℃時降溫速率5℃/min；-10℃～-100℃時降溫速率60℃/min；-100℃～

-140℃時降溫速率為20℃/min。其他操作按照程序控制冷凍儀操作規(guī)程執(zhí)行，冷凍結束后進行置液氮

中包裝、保存。

9冷凍精液質量檢驗

精液解凍

水浴37℃恒溫后，迅速從貯存罐中取出預留凍精，37℃水浴中45s；取出細管用無菌吸水紙擦拭

干凈，剪掉沒有海綿塞一端封口，用推針推動海綿塞，將精液推入1.5mL離心管中，待檢。

解凍后合格標準

9.2.1細管外觀

細管無裂痕，封口嚴密，標識清晰。

9.2.2活力

解凍后精子活力≥30%。

9.2.3精子畸形率

精子畸形率≤20%。檢測方法按照GB20557要求執(zhí)行。

9.2.4細菌數(shù)

細菌數(shù)≤800個/劑。檢測方法按照GB20557要求執(zhí)行。

3

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9.2.5頂體完整率

頂體完整率≥45%。檢測方法按照附錄C執(zhí)行。

9.2.6質膜完整率

質膜完整率≥35%。檢測方法按照附錄D執(zhí)行。

10貯存和運輸

按照GB20557要求執(zhí)行。

4

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

奶綿羊精液稀釋液配制

A.1試劑純度要求

所有試劑純度達到AR級以上。

A.21000mLTrisA液

Tris27.1g、檸檬酸14g、果糖10g、M19920mL、大豆卵磷脂10g、白藜蘆醇0.02g、青鏈霉

素各10000IU，加超純水至1000mL，調節(jié)溶液pH值到6.8，然后用0.22?的濾器過濾除菌。

A.3100mLTrisB液

TrisA液90mL、甘油10mL，磁力攪拌混勻，然后用0.22?的濾器過濾除菌。

A.4250mL含20%卵黃的TrisA液

取TrisA液199mL，51mL卵黃液，磁力攪拌15min后置4℃條件下靜置12h，去除表層卵脂，

液體在3850g的條件離心10min，取上清用0.22?的濾器過濾除菌。

5

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B

B

附錄B

（規(guī)范性）

奶綿羊細管冷凍精液標記方法

細管冷凍精液標識由5個部分組成，每部分之間空開2個字符位置，排列順序由棉塞端到封口端依

次為：

第一部分第二部分第三部分第四部分第五部分

生產(chǎn)單位代號性控標記品種代號生產(chǎn)日期奶綿羊號

2～4個字符七個字符兩個字符八個字符八個字符

第一部分以公司縮寫代號為準；第二部分“性控標記”標識：“N-Sexed”為常規(guī)凍精，“Sexed-

X”為雌性，“Sexed-Y”為雄性；第三部分品種代號以GB20557為依據(jù)；第四部分公羊號取該奶綿羊

身份證號碼后八個字符；第五部分凍精生產(chǎn)日期八位數(shù)按年、月、日次序排列。每部分之間空2個字符。

標記的字跡應清晰易認。

示例：

FDZYN-SexedEF2023012001252008

棉塞封口端超聲波封口端

FDZY為生產(chǎn)單位代號，N-Sexed為常規(guī)凍精，若為Sexed-X則為雌性標識代號，EF為東弗里升奶綿羊

的英文品種代號，20230120為凍精生產(chǎn)日期，01252008為該公羊身份證號碼。

6

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C

C

附錄C

（規(guī)范性）

奶綿羊冷凍精液精子頂體完整率檢測方法

C.1器材、試劑

熒光顯微鏡、烘片機、多聚賴氨酸粘附性載玻片、HSOF、PBS、4%多聚甲醛、FITC-PSA、DAPI、甘

油。

C.2操作步驟

C.2.1凍精準備

解凍凍精于1.5mL離心管中，加入1mLHSOF并混勻；1500rpm離心5min，棄上清液，留約20μ

L。

C.2.2固定

加入適量的PBS重懸精子，并向其中加入4%多聚甲醛對精子進行固定，固定約30min。

C.2.3洗滌

向精液中加入PBS1mL，1500rpm離心5min洗滌2次以除去精漿、多聚甲醛等，洗滌后加入1mL

PBS重懸精子。

C.2.4涂片染色

取10μL精液均勻涂于多聚賴氨酸粘附性載玻片上，并將其放于烘片機上干燥；加10μLFITC-P

SA對精子進行避光染色15min；用超純水緩慢洗滌玻片并干燥；加5μLDAPI染色液避光染色5min。

C.2.5洗滌干燥

用超純水緩慢洗滌玻片，放烘片機上干燥，并用PBS與甘油的混合物封片。

C.2.6鏡檢

熒光顯微鏡下觀察，共計數(shù)至少200個精子來統(tǒng)計凍后精子頂體完整率，若精子頭部均染成明亮的

綠色熒光且均勻即頂體完整（AI）；已發(fā)生頂體反應（AR）的精子僅在赤道帶出現(xiàn)熒光染色，或者頭部

無綠色熒光。

C.2.7計算

所檢凍精的頂體完整率按下式計算：

C=C1/S×100%…………………（C.1）

式中：

C——頂體完整率（%）;

C1——頂體完整的精子數(shù)，單位為個;

S——觀察的總精子數(shù)，單位為個。

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