1前言骨肉瘤（OS，osteosarcoma）是一種嚴(yán)重危害青少年、老齡人的原發(fā)性惡性腫瘤，癌癥逐漸取代了傳染病的地位，成為當(dāng)下危害生命健康的主要威脅。發(fā)展中的醫(yī)療技術(shù)正在逐步攻克這一難癥，如分子靶向治療、免疫治療、基因治療、新輔助化療，目前臨床上多采用手術(shù)切除為主，藥物化療相輔的綜合治療模式，并成功將患者5年生存率提升至60~70%，但發(fā)生了腫瘤轉(zhuǎn)移的患者，其5年生存率僅有20%[1]。目前新輔助化療處于一個(gè)難以提高患者生存率的瓶頸期，亟需尋找新的治療方案。臨床骨肉瘤治療常用化療藥物主要有阿霉素（ADM）、順鉑（DDP）、大劑量甲氨蝶呤（HD-MTX）和異環(huán)磷酰胺（IFO），然而從上世紀(jì)90年代起，骨肉瘤的化療一直受限于藥物品種少，方法單一、毒副作用大等問(wèn)題而停滯不前，鑒于此，改善細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，減輕化療藥物毒副作用，就顯得尤為重要。在治療人體骨肉瘤的各種方法中，局部根治性切除手術(shù)和輔助化學(xué)治療相配合的綜合治療是目前治療效果最為顯著的，化學(xué)治療是綜合治療的重要組成部分，更有效的治療效果和更小的副作用將會(huì)是骨肉瘤治療研究和探索的熱點(diǎn)[2]。本課題通過(guò)前期對(duì)大量化合物的篩選，篩選出有效抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的兩種化合物----Chaetocin和（+）-JQ1BromodomainInhibitor。查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知，Chaetocin是一種天然的真菌代謝物，在實(shí)體瘤中具有強(qiáng)大的增殖抑制活性[3]，有研究表明Chaetocin可通過(guò)誘導(dǎo)LC3-II、caspase-3表達(dá)的增加，進(jìn)而影響細(xì)胞自噬和凋亡進(jìn)程，影響人體肝癌細(xì)胞[4]，是一種理想的臨床治療藥物。近年來(lái)，BET抑制劑在白血病、癌癥、自身免疫性疾病的功效受到重視，（+）-JQ1是其中一種BET蛋白抑制劑，通過(guò)干擾BRD4功能，可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和凋亡的促進(jìn)，并對(duì)腫瘤細(xì)胞活性產(chǎn)生巨大影響[5]。PD-L1在癌癥治療中常作為一個(gè)重要的靶點(diǎn)[5]，有實(shí)驗(yàn)通過(guò)（+）-JQ1對(duì)前列腺癌、肝癌和肺癌細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，（+）-JQ1對(duì)PD-L1存在抑制效果，并有成為腫瘤治療藥物的潛力[6]。通過(guò)把前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)比后，我們認(rèn)為這兩種化合物有成為骨肉瘤治療藥物的潛力，下文中會(huì)對(duì)Chaetocin和（+）-JQ1在骨肉瘤細(xì)胞的治療效果進(jìn)行描述，并進(jìn)一步探討這兩個(gè)化合物在骨肉瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制，為骨肉瘤化療提供新方案與新機(jī)遇。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器和試劑2.1.1實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器對(duì)應(yīng)廠家二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱立新儀器有限公司超凈工作臺(tái)ThermoFormaPCR儀EppendorfReal-timePCR儀Eppendorf酶標(biāo)儀ThermoFisher普通倒置顯微鏡舜宇離心機(jī)Eppendorf2.1.2細(xì)胞株小鼠骨肉瘤細(xì)胞K7M2WT、人成骨肉瘤細(xì)胞MG63均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。2.1.3藥物Chaetocin和（+）-JQ1BromodomainInhibitor購(gòu)自Sigma公司，順鉑購(gòu)自R&D公司。2.1.4主要試劑2.1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)試劑DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司、胎牛血清（FBS）購(gòu)自浙江省杭州市四季青生物工程材料有限公司。2.1.4.2SRB相關(guān)試劑10%TCA、Tris堿、冰醋酸和SRB染料（以1%醋酸配置）購(gòu)自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司。2.1.4.3Realtime-PCR相關(guān)試劑RNA抽提試劑Trizol、核糖核苷酸混合（DNTP）、RNA酶抑制劑、隨機(jī)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBRGreen反應(yīng)試劑盒購(gòu)自杭州禹?yè)P(yáng)生物科技有限公司。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)小鼠骨肉瘤細(xì)胞K7M2、人成骨肉瘤細(xì)胞MG63培養(yǎng)采用10%FBS血清、90%高糖型DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞均置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.2.2有效化合物篩選1).細(xì)胞種板：把處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的K7M2、MG63細(xì)胞，采用常規(guī)消化傳代方法，制成細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔200μl、3000cells細(xì)胞。2).96孔板給藥：種板后24h對(duì)96孔板中細(xì)胞給予1μl藥物，藥物以250nM、125nM、62.5nM的濃度梯度稀釋?zhuān)瑱z測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞在不同濃度下的抑制率，各濃度均采用3孔為復(fù)孔，同時(shí)加2μM和1μM的CDDP（2μM為孔內(nèi)終濃度）作為藥物的藥效對(duì)照組。給藥完畢后將96孔板置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3).SRB法：藥物作用72h后，取出96孔板，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入100μl4℃預(yù)冷的10%TCA溶液固定細(xì)胞，靜置5min后放入4℃冰箱中固定1h，用純化水沖洗5遍，烘干后每孔加入4mg/mlSRB染料（以1%醋酸配制）50μl，染色20min后，以1%醋酸清洗5遍，烘干后每孔加入100μl10mM的Tris堿，輕輕振蕩至晶體完全溶解。4).吸光度檢測(cè)：使用酶標(biāo)儀在517nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔藥物作用后的吸光度。抑制率=（A517cotrol-A517treated）/A517control2.2.3單克隆形成1).細(xì)胞種板：把對(duì)指數(shù)生長(zhǎng)期的K7M2、MG63細(xì)胞，采用常規(guī)消化傳代方法，制成細(xì)胞懸液加入6孔板中，每孔2ml、5×104cell細(xì)胞。2).6孔板給藥：種板次日，6孔板設(shè)置為對(duì)照組、125nM藥物單用組、藥物聯(lián)用組聯(lián)用、1μMCDDP組進(jìn)行給藥，每孔加的藥物劑量為2μL，給藥完畢后將6孔板放于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3).換液、給藥：給藥后24h把孔內(nèi)的培養(yǎng)液吸出，再加入10%FBS+90%DMEM共2ml，并加入與上次相同的藥物濃度、劑量，處理完畢后將6孔板放于培養(yǎng)箱中。4).收板：種板后的第七日，棄去培養(yǎng)液，每孔加入XmL甲醛固定細(xì)胞，振蕩搖20min，固定細(xì)胞后用純化水洗凈，置于空氣或烘箱37℃徹底干燥；再加入1mL0.1%的結(jié)晶紫溶液對(duì)細(xì)胞染色，振搖30min，用PBS清洗，至多余的結(jié)晶紫溶液沖洗干凈，烘干。2.2.4Real-timePCR檢測(cè)1).Trizol提取總RNA：培養(yǎng)皿中加入1ml的Trizol試劑充分裂解細(xì)胞，用RNase-free的EP管收集，反復(fù)吹打至溶液透明。加入200μL氯仿，劇烈振蕩30s，并于冰上放置2~3min，12000rpm，4℃離心10min；吸取上清液，加入同比例的異丙醇，微微晃動(dòng)，冰上放10min，4℃，12000rpm離心10min；小心吸走上清液，底部沉淀加入1ml75%乙醇輕微渦旋洗滌，4℃7600rpm，離心5min，重復(fù)兩遍，棄去上清液，于室溫下?lián)]干，所得RNA沉淀加入適量0.1%DEPC水溶解。采用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的濃度，同時(shí)A260/A280比值確定總RNA純度，直接進(jìn)行后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)或保存至-80℃冰箱中備用。2).逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：根據(jù)RNA濃度，取定量RNA2μg（xμL）、DEPC（7-xμL），2×TSReactionMix10uL、gDNARemover1μL、總反應(yīng)體系為20μL，輕輕混勻并離心至排管底部以42℃孵育30min，85℃加熱5min失活程序逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。3).實(shí)時(shí)熒光定量PCR：將所得cDNA加至PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增目標(biāo)片段，PCR反映體系為20μL（10μM目標(biāo)上游引物和下游引物各0.6μL，0.1%DEPC水8.2μL，模板cDNA0.6μL，2×QuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix10μL）。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性15min后，94℃變性30s，X℃退火30s（X為退火溫度），72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。最后一次循環(huán)后做溶解曲線，并采用ACTIN做標(biāo)準(zhǔn)曲線作為參考值。查閱相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)的引物序列如下：Bcl2：Forward：GAGCAGGTGCCTACAAGAAA(Sense)Reverse：CTTTGTCCTCTGACTGGGTATG(AntiSense) Bax：Forward：GTGGTTGCCCTCTTCTACTTT(Sense)Reverse：CAGCCCATGATGGTTCTGAT(AntiSense)ABCC1：Forward：GGTACCTGTGCTGGTGAATAA(Sense)Reverse：TAGGCTTGCTGGGATCTTTG(AntiSense)ABCB1：Forward：TGCTGGTTGCTGCTTACA(Sense)Reverse：GCCTATCTCCTGTCGCATTATAG(AntiSense)ABCG2：Forward：GATGAACTCCAGAGCCGTTAG(Sense) Reverse：CGGACTAGAAACCCACTCTTTAC(AntiSense)2.2.6數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，數(shù)據(jù)表示為ˉx±SD，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)檢查數(shù)據(jù)出入。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1篩選得到可以協(xié)同CDDP抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的化合物（+）-JQ1與Chaetocin首先我們對(duì)化合物進(jìn)行藥效的篩選，采用SRB法，取適當(dāng)數(shù)量的K7M2細(xì)胞制成懸液，并將適宜密度的細(xì)胞接種于96孔板中，種板后24h給予梯度稀釋的化合物（濃度125nM、62.5nM）與CDPP（濃度1μM），并分空白對(duì)照組、CDDP單用組、化合物單用組、聯(lián)合用藥組，藥物作用72h后收板，使用SRB法檢測(cè)每孔的吸光度，并按照（A517cotrol-A517treated）/A517control計(jì)算化合物的抑制率。最終篩選出效果明顯的（+）-JQ1與Chaetocin，抑制率柱狀圖如圖1.A/B，從圖中可觀察到聯(lián)用組有顯著的抑制細(xì)胞增殖效果，初步證明了（+）-JQ1/Chaetocin協(xié)同CDDP治療骨肉瘤細(xì)胞的可行性。圖1.（+）-JQ1/Chaetocin協(xié)同順鉑抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖A.K7M2細(xì)胞給予1μMCDDP、62.5nM（+）-JQ1、125nM（+）-JQ1、1μMCDDP與62.5nM（+）-JQ1、1μMCDDP與125nM（+）-JQ1，并采用SRB法計(jì)算抑制率。B.K7M2細(xì)胞給予1μMCDDP、62.5nMCHAE、125nMCHAE、1μMCDDP與62.5nMCHAE、1μMCDDP與125nMCHAE，并采用SRB法計(jì)算抑制率。3.2體外實(shí)驗(yàn)顯示（+）-JQ1/Chaetocin可以協(xié)同CDDP抑制骨肉瘤細(xì)胞克隆形成在篩選出有療效的（+）-JQ1/Chaetocin后，通過(guò)把處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的K7M2細(xì)胞，采用常規(guī)消化傳代方法，制成細(xì)胞懸液加入6孔板中的培養(yǎng)，種板24h后給予CDDP（1μM）、化合物（125nM）進(jìn)行化合物體外抗腫瘤活性，在給藥后72h拍攝孔內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)，并更換培養(yǎng)液與上次相同劑量濃度的藥物，種板后的第7日收板并用結(jié)晶紫染色。結(jié)果顯示（圖2.A/B）在首次給藥后的第三天可觀察到藥物單用組、聯(lián)合用藥組的細(xì)胞密度少于對(duì)照組，在第7日收板并用結(jié)晶紫染色后，明顯觀察的到（+）-JQ1/Chaetocin、CDDP單用組的細(xì)胞密度相對(duì)較低，而聯(lián)用組則有明顯的細(xì)胞密度減少，上述結(jié)果表明（+）-JQ1/Chaetocin協(xié)同CDDP有著良好體外抗腫瘤活性，證明該聯(lián)用方案的可行性，并能進(jìn)行下一步聯(lián)用方案對(duì)骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)基因水平影響的探究。圖2.Chaetocin、（+）-JQ1的增殖抑制效果A.骨肉瘤K7M2細(xì)胞分組為對(duì)照組、1μMCDDP、125nM（+）-JQ1、1μMCDDP+125nM（+）-JQ1的增殖抑制效果（從左到右）。B.骨肉瘤K7M2細(xì)胞分組為對(duì)照組、1μMCDDP、125nMChaetocin、1μMCDDP+125nMChaetocin的增殖抑制效果。C.對(duì)照組、1μMCDDP、125nM（+）-JQ1、1μMCDDP+125nM（+）-JQ1結(jié)晶紫染色后的增殖抑制效果。D.對(duì)照組、1μMCDDP、125nMChaetocin、1μMCDDP+125nMChaetocin結(jié)晶紫染色后的增殖抑制效果。3.3Chaetocin、（+）-JQ1協(xié)同CDDP促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)程體外抗腫瘤活性檢測(cè)完成后，需要進(jìn)一步探究化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制，查閱文獻(xiàn)得知，通過(guò)抑制Blc2基因表達(dá)[7]與促進(jìn)BAX基因表達(dá)[8,9]，可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。我們采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)（+）-JQ1/Chaetocin與CDDP聯(lián)用后的細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄情況。將K7M2細(xì)胞傳代于6孔板中培養(yǎng)，在傳代后的24h后，更換培養(yǎng)基，并設(shè)置CDDP（1μM）組、CDDP+（+）-JQ1/Chaetocin組（CDDP1μM,（+）-JQ1/Chaetocin125nM），在給藥后的0、3、5、7天檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Blc2、BAX凋亡基因水平變化。結(jié)果顯示（圖3.A/B）聯(lián)合用藥組Bcl2基因轉(zhuǎn)錄情況與藥物作用時(shí)間呈反比，且聯(lián)合用藥組對(duì)Bcl2轉(zhuǎn)錄的抑制效果強(qiáng)于CDDP單用；聯(lián)合用藥組而B(niǎo)AX基因的增長(zhǎng)趨勢(shì)與CDDP單用相比更快。上述的結(jié)果表明了（+）-JQ1/Chaetocin協(xié)同CDDP可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。圖3.Chaetocin、（+）-JQ1對(duì)凋亡基因的影響A.骨肉瘤K7M2細(xì)胞加入1μMCDDP、1μMCDDP+125nMChaetocin后，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)耐藥基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的水平。B.骨肉瘤K7M2細(xì)胞加入1μMCDDP、1μMCDDP+125nM（+）-JQ1后，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)耐藥基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的水平。3.4Chaetocin、（+）-JQ1協(xié)同CDDP逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細(xì)胞耐藥進(jìn)程臨床治療中腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性會(huì)逐漸降低，為此需要逐步增加劑量，這樣的一個(gè)惡性循環(huán)不僅影響了治療效果，更會(huì)對(duì)患者的身體產(chǎn)生毒害。在檢驗(yàn)凋亡基因的同時(shí)，我們還對(duì)細(xì)胞內(nèi)耐藥基因（ABCB1、ABCC1、ABCG2）的轉(zhuǎn)錄水平做了檢測(cè)。結(jié)果顯示（圖3.A/B）CDDP的單用促進(jìn)了耐藥基因的轉(zhuǎn)錄，+）-JQ1/Chaetocin的單用對(duì)耐藥基因幾乎不產(chǎn)生影響，而當(dāng)（+）-JQ1/Chaetocin協(xié)同CDDP作用后，細(xì)胞內(nèi)耐藥基因轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生了逆轉(zhuǎn)。上述結(jié)果表明在（+）-JQ1/Chaetocin協(xié)同CDDP可以通過(guò)降低耐藥基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而減少骨肉瘤細(xì)胞耐藥的發(fā)生。圖4.Chaetocin、（+）-JQ1對(duì)耐藥基因的影響A.骨肉瘤K7M2細(xì)胞加入1μMCDDP、1μMCDDP+125nM（+）-JQ1后，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)耐藥基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的水平。B.骨肉瘤K7M2細(xì)胞加入1μMCDDP、1μMCDDP+125nMChaetocin后，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)耐藥基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的水平。4結(jié)論臨床上受限于諸多因素，如肺轉(zhuǎn)移[11]與治療藥物的耐藥或嚴(yán)重的毒副作用[12]，骨肉瘤進(jìn)展的控制變得尤為困難，患者往往被迫終止或改變治療方案，如何有效的改善腫瘤轉(zhuǎn)移與耐藥問(wèn)題，是進(jìn)一步提升患者生存率的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，證明了Chaetocin、（+）-JQ1協(xié)同CDDP對(duì)骨肉瘤細(xì)胞具有增殖抑制效果，其通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的凋亡基因Bcl2、BAX，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，并降低耐藥基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的轉(zhuǎn)錄水平，產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥進(jìn)程的效果，增加骨肉瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。在知網(wǎng)、萬(wàn)方、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后，發(fā)現(xiàn)這兩種化合物在其他癌癥的體外實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，揭示了Chaetocin、（+）-JQ1可能具有成為臨床治療藥物的潛力，但考慮到現(xiàn)階段Chaetocin、（+）-JQ1治療骨肉瘤的有效性和安全性，以及合適的化療方案和劑量，還需要更多的臨床試驗(yàn)與相關(guān)數(shù)