PAGEPAGE1ICS 65.020.20CCS B31團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/FPSHS021-2025番茄抗細(xì)菌性青枯病室內(nèi)鑒定技術(shù)規(guī)程Technicalcodeofpracticeforgreenhouseevaluationoftomatoresistancetobacterialwiltdisease2025-12-25發(fā)布 2025-12-26實(shí)施福建省園藝學(xué)會(huì) 發(fā)布目次前 言 3范圍 4規(guī)性用件 4術(shù)和義 4鑒程序 4接體備 5器備 5原分與定 5懸的備 6室抗鑒定 6定計(jì) 6定照料 6茄葉幼接種 6茄花幼接種 7病調(diào)查 7茄葉幼接病情查 7茄花幼接病情查 8定料處理 9性價(jià) 9附 錄 A 1附 錄 B 5附 錄 C 6前 言本文照GB/T1.1-2020標(biāo)化作則 第1分準(zhǔn)文的構(gòu)草規(guī)》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提出，由福建省園藝學(xué)會(huì)歸口。本文件起草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，廈門如意種苗高科技股份有限公司，淮陰工學(xué)院，平潭縣好收成農(nóng)民專業(yè)合作社。本文件主要起草人：王榮波，朱海生，劉裴清，張前榮，牛冬冬，李本金，王云鵬，余知雨，冀婷婷，池仁曼，劉守成。番茄抗細(xì)菌性青枯病室內(nèi)鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了番茄抗細(xì)菌性青枯病室內(nèi)鑒定技術(shù)程序。本文件適用于番茄野生種、地方種、商品種、品系及遺傳材料等對(duì)細(xì)菌性青枯病的室內(nèi)抗性鑒定及評(píng)價(jià)。下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T2118蔬菜育苗基質(zhì)3.1番茄細(xì)菌性青枯病bacterialwiltoftomato由茄科勞爾氏菌[Ralstoniasolancearum(Smith)Yabuuchietal.]侵染茄科植物而引起的一種土傳細(xì)菌病害。發(fā)病初期葉色正常，主莖和側(cè)枝部分葉片呈現(xiàn)暗綠色脫水狀；發(fā)病后期主莖頂葉向下逐漸萎蔫，根部腐爛發(fā)黑，剖開維管束為褐色，其莖部橫切后插入清水中，可見乳白色細(xì)菌液溢出。3.2病原物分離pathogenicisolate采用人工方法從植株發(fā)病部位或病株根際土壤中分離獲得病原物的純培養(yǎng)物。3.3序列變種sequevars基于內(nèi)源葡聚糖酶基因（endoglucanasegene，egl）的序列相似性來(lái)劃分的青枯菌類群。3.4番茄子葉期幼苗cotyledon-stagetomatoseedling指番茄種子萌發(fā)后到其子葉完全展開，但真葉尚未形成的番茄植株。鑒定程序見圖1。圖1番茄抗細(xì)菌性青枯病室內(nèi)鑒定程序示意圖PCR403~30~60s，用2倍3TTC3048。稱取10100mL30150rpm12min1mL9mL10-4~10-8TTC3048h。從TTCAU759-F/AU760-RFeganand進(jìn)行PCR表1青枯菌鑒定特異性物引物名稱引物序列（5’-3’）目的片段長(zhǎng)度/bp退火溫度AU759-FAU760-RGTCGCCGTCAACTCACTTTCCGTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG28158℃對(duì)用于抗性鑒定接種的病原分離物進(jìn)行遺傳多樣性分析，包括生理小種、演化型、生化型和序列變種的鑒定，鑒定方法見附錄A。選擇福建省當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)序列變種青枯菌菌株作為抗性鑒定接種菌株，以下接種體準(zhǔn)備試驗(yàn)需要在超凈工作臺(tái)或達(dá)到相當(dāng)無(wú)菌環(huán)境要求下開展。用無(wú)菌接種環(huán)蘸取保存在30%甘油中的青枯菌在TTC固體培養(yǎng)基平板上劃線，置于30℃48CPG30℃、150rpm24。600nmCFU/mL（OD600nm1.0）1鑒定材料隨機(jī)排列或順序排列，每份鑒定材料重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)15株苗。Ailsa55℃15min300mg/L10%531/2MS±200~300μmol/m2·s16h/夜8將待測(cè)番茄幼苗轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基平板上緩苗48h，于番茄幼苗根莖交界處接種10μL菌懸液（108CFU/mL），靜置24h后平板豎立培養(yǎng)。將處理后番茄幼苗移入光照培養(yǎng)箱，溫度：28±2℃，相對(duì)濕度（RH）>65%，光照：200~300μmol/m2·s，光周期：晝16h/夜8h。55℃15min300mg/L28℃NY/T2118（121℃，25min）5~91cm15mL（108CFU/mL）。將處理后番茄幼苗移入溫室，溫度：28±2℃，相對(duì)濕度（RH）>65%，光照強(qiáng)度：300~550μmol/m2·s，光周期：晝16h/夜8h，常規(guī)栽培管理。7病情調(diào)查接種病原菌5~7d后調(diào)查病情。表2 番子期苗病病級(jí)的分病情級(jí)別 癥狀描述3 3/45 1/2~3/41/4）7 1/21/2（）9 調(diào)查每份鑒定材料接種植株發(fā)病情況，根據(jù)病害癥狀描述，逐株調(diào)查病情級(jí)別，并統(tǒng)計(jì)出病情指數(shù)（DI）。病情指數(shù)計(jì)算公式（1）如下：∑（s×n）DI=———————×100 (1)N×S式中：∑——各病情級(jí)別數(shù)值與各病情級(jí)別植株數(shù)乘積的總和；s——各病情級(jí)別數(shù)值；n——各病情級(jí)別病株數(shù)；N——調(diào)查總株數(shù)；S——最高病情級(jí)別數(shù)值。依據(jù)鑒定材料3次重復(fù)的病情指數(shù)（DI）平均值確定其抗性水平，劃分標(biāo)準(zhǔn)見表3。表3番茄子葉期幼苗對(duì)青枯病抗性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)病情數(shù)（DI） 抗性價(jià)DI0 0<DI20 高抗（HR）20<DI40 抗病（R）40<DI60 中抗（MR）60<DI80 感?。⊿）DI80 高感（HS）當(dāng)感病對(duì)照材料的病情指數(shù)大于等于60（DI≥60）時(shí)，該批次抗性鑒定判定為有效。如果抗性鑒定三次重復(fù)出現(xiàn)差異，以較高發(fā)病級(jí)別指標(biāo)優(yōu)先確定；如果評(píng)價(jià)級(jí)別相差兩級(jí)以上（含兩個(gè)級(jí)別）則需要對(duì)該品種做重復(fù)抗性鑒定。接種病原菌后10~14d調(diào)查發(fā)病情況。病情級(jí)別及其相對(duì)應(yīng)的癥狀描述（見表4）。表4番茄初花期幼苗接種病情級(jí)別的劃分病情級(jí)別癥狀描述0整株無(wú)癥狀1植株25%以下葉片萎蔫2植株25%~50%片葉萎蔫3植株50%~75%葉片萎蔫4整株75%以上葉片萎蔫或植株枯死7.2.3逐株調(diào)查枯萎葉片數(shù)量占全部可統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)量的比例，根據(jù)枯萎葉片比例確定病情級(jí)別（表4），并計(jì)算病情指數(shù)（DI），病情級(jí)別的劃分以及計(jì)算公式如下。病情指數(shù)（DI）按下列公式（1）計(jì)算：∑（s×n）DI=———————×100 (1)N×S式中：∑——各病情級(jí)別數(shù)值與各病情級(jí)別植株數(shù)乘積的總和；s——各病情級(jí)別數(shù)值；n——各病情級(jí)別病株數(shù)；N——調(diào)查總株數(shù)；S——最高病情級(jí)別數(shù)值。依據(jù)鑒定材料3次重復(fù)的病情指數(shù)（DI）平均值確定其抗性水平，抗性標(biāo)準(zhǔn)劃分見表5。表5番茄初花期幼苗抗青枯病鑒定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)病情數(shù)（DI） 抗性價(jià)DI0 0<DI12.5 高抗（HR）12.5<DI25 抗?。≧）25<DI50 中抗（MR）50<DI75 感病（S）DI75 高感（HS）當(dāng)感病對(duì)照材料的病情指數(shù)大于等于50（DI≥50）時(shí)，該批次抗性鑒定判定為有效。如果抗性鑒定三次重復(fù)出現(xiàn)差異，以較高發(fā)病級(jí)別指標(biāo)優(yōu)先確定；如果評(píng)價(jià)級(jí)別相差兩級(jí)以上（含兩個(gè)級(jí)別）則需要對(duì)該品種做重復(fù)抗性鑒定。鑒定完畢后將番茄植株、殘?bào)w及栽培基質(zhì)集中進(jìn)行無(wú)害化處理。1包括）番茄子葉期幼苗接種按照附錄B填寫鑒定表格；番茄初花期幼苗接種按照附錄C11參考文獻(xiàn)Buddenhagen,I.1962.DesignationofracesinPseudomonassolanacearum.Phytopathology52:726.Fegan,M.,andPrior,P.2005.HowcomplexistheRalstoniasolanacearumspeciescomplex.BacterialwiltdiseaseandtheRalstoniasolanacearumspeciescomplex1:449-461.Hayward,A.1964.CharacteristicsofPseudomonassolanacearum.JournalofAppliedBacteriology27:265-277.王榮波,,等.[J].園,2024,51(11):2540-2554.附 錄 A（規(guī)范性）番茄青枯病病原菌基本信息及其遺傳多樣性A.1病原菌基本信息A.1.1學(xué)名茄科勞爾氏菌[Ralstoniasolancearum(Smith)Yabuuchietal.]A.1.2分類地位該菌屬于變形菌門（Proteobacteria）、伯克氏菌科（Burrkholderiaceae）、勞爾氏菌屬（Ralstonia）。A.1.3形態(tài)特征茄科勞爾氏菌是一種好氧性革蘭氏陰性菌，為變形菌。菌體呈短桿狀，長(zhǎng)度一般為0.5~1.51~3pH6.6pH4~830~35TTC圖A.1茄科勞爾氏菌的形態(tài)特征A.2青枯菌遺傳多樣性分析A.2.1培養(yǎng)基的制備CPG5.0g1.0g10.0g1000LH7100L250L2%121（±1）℃20minTTC培養(yǎng)基：2,3,5–氯化三苯基四氮唑（TTC）溶于無(wú)菌水中，使其終濃度為0.5%，用0.22μm4NA50℃左100mL1mL0.5%TTCTTC1/2MS2.215gMS30g1MKOHPAGEPAGE2調(diào)節(jié)H至5.70001.75g1215。A.2.2DNA提取CPGCPG液30℃、150rpm24h1mL菌液采用細(xì)菌基因組DNADNADNA-20A.2.3青枯菌生理小種鑒定A.2.3.1采用的鑒別寄主用于鑒別菌株生理小種的寄主有：煙草、茄子、番茄、花生、香蕉、馬鈴薯。A.2.3.2生理小種鑒定10cm100μL（10820mL（108CFU/mL），20mL28±80%15（見表A.1）。茄子馬鈴薯茄子馬鈴薯番茄花生香蕉1＋＋＋＋－2－－－－＋3－＋＋－－

表A.1青枯菌生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn)寄主植物注1：“＋”代表能侵染，“－”代表不能侵染。注2：生理小種按Buddenhagen等（1962）的分類法劃分。A.2.4青枯菌生化型鑒定3（）3（）（見表A.2）。表A.2青枯菌生化變種的劃分標(biāo)準(zhǔn)生化變種乳糖麥芽糖纖維二糖甘露醇山梨醇甜醇Ⅰ－－－－－－Ⅱ＋＋＋－－－Ⅲ＋＋＋＋＋＋Ⅲ-1＋＋＋＋＋－Ⅲ-2＋－＋＋＋－Ⅳ－－－＋＋＋Ⅴ＋＋＋＋－－注1：“＋”代表能利用，“－”代表不能利用。注2：生化型按Hayward等（1964）的分類法劃分。A.2.5青枯菌演化型鑒定PCR25μL：2×MasterMix12.5AU759-F/AU760-R1Nmult21:1FNmult21:2FNmult和Nmult22:InF0.251μLPCR95℃53090s，72℃30s，3072℃10minGMI1000（Ⅰ）Po41（Ⅱ）DNAPCR1.2%（A.3）。表A.3青枯菌演化型鑒定特異性引物演化型Phylotype引物名稱引物序列（5’-3’）片段大小/bp演化型ⅠNmult21:1FCGTTGATGAGGCGCGCAATTT144演化型ⅡNmult21:2FAAGTTATGGACGGTGGAAGTC372演化型ⅢNmult23:AFATTACAGAGCAATCGAAAGATT91演化型ⅣNmult22:InFATTGCCAAGACGAGAGAAGTA213Nmult22:RRTCGCTTGACCCTATAACGAGTAA.2.6青枯菌序列變種鑒定EnGTCTTCC）PCR25μL，2×MasterMix12.5μL1μL，1μLDNAddH2OPCR95℃3min；95℃15s，60℃60s，72℃48s，3072℃5minGenBank4A.4表A.4基于egl序列的系統(tǒng)發(fā)育分析中使用的部分青枯菌參考菌株參考菌株寄主來(lái)源演化型序列變種GenBank登錄號(hào)R288桑樹中國(guó)Ⅰ12GQ907153JT523馬鈴薯留尼汪島Ⅰ13AF295252PSS81番茄中國(guó)Ⅰ14FJ561066PSS358番茄中國(guó)Ⅰ15EU407298UW151姜澳大利亞Ⅰ16AF295254P11花生中國(guó)Ⅰ17FJ561068GMI1000番茄法國(guó)Ⅰ18AF295251JT519天竺葵留尼汪島Ⅰ31GU295032PSS219番茄中國(guó)Ⅰ34FJ561167O3橄欖樹中國(guó)Ⅰ44FJ561069Tb28煙草中國(guó)Ⅰ44FJ561127Tb43煙草中國(guó)Ⅰ44FJ561129Bd11木槿中國(guó)Ⅰ44FJ561098CIP365馬鈴薯菲律賓Ⅰ45GQ907151MAD17辣椒馬達(dá)加斯加Ⅰ46GU295040GMI8254番茄印度尼西亞Ⅰ47GU295014M2桑樹中國(guó)Ⅰ48FJ561067CMR87番茄喀麥隆Ⅱ35EF439727CMR121番茄喀麥?、?2EF43972