ICS65.020.30

CCSB41

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T4173—2025

牛大腸桿菌性腹瀉診斷技術(shù)規(guī)范

TechnicalspecificationforthediagnosisofbovineEscherichiacoli

diarrhea

2025-08-29發(fā)布2025-09-29實施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T4173—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAM/TC19）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、鄂爾多斯市動物疫病預(yù)防控制中心、北京生泰爾科技股份有限

公司、北京華夏興洋生物科技有限公司、金宇保靈生物藥品有限公司、通遼市科爾沁區(qū)畜牧水產(chǎn)工作站、

內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院。

本文件主要起草人：徐曉靜、謝夢圓、張勇、王秀敏、趙卓、陳堅、韓四娥、張迪、達(dá)來寶力格。

I

DB15/T4173—2025

牛大腸桿菌性腹瀉診斷技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了牛大腸桿菌性腹瀉的臨床診斷和實驗室診斷技術(shù)。

本文件適用于牛大腸桿菌性腹瀉的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB4789.6食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗

GB19489實驗室生物安全通用要求

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

EAEC：腸黏附性大腸桿菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli)

DEC：致瀉大腸桿菌(DiarrheagenicEscherichiacoli)

EHEC：腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli)

EIEC：腸侵襲性大腸桿菌(EnteroinvasiveEscherichiacoli)

EPEC：腸致病性大腸桿菌(EnteropathogenicEscherichiacoli)

ETEC：腸產(chǎn)毒素性大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli)

EMB：伊紅美藍(lán)(Eosin-methyleneBlue)

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）

RNase：核糖核酸酶（Ribonuclease）

MAC：麥康凱瓊脂(MacConkeyAgar)

MLST：細(xì)菌多位點序列分型(Multilocussequencetyping)

STEC：產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli)

5臨床診斷

流行病學(xué)

1

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5.1.1易感性

不同品種牛均易感，多見于3周齡以內(nèi)的犢牛，7日齡內(nèi)犢牛最易感。

5.1.2流行性

一年四季均可發(fā)生，尤以氣候多變、寒冷季節(jié)和環(huán)境衛(wèi)生較差時多發(fā)，呈地方性流行或散發(fā)。

5.1.3傳染源及傳播途徑

病牛和帶菌牛是主要傳染源，通過糞便排出病菌，污染水、飼料、乳頭和皮膚等，當(dāng)犢牛吮乳、舐

舔或飲食時，經(jīng)消化道感染。此外，也可經(jīng)臍帶或產(chǎn)道感染。

臨床癥狀

多數(shù)是7日齡以內(nèi)犢牛發(fā)病，病初體溫升高至40℃以上，數(shù)小時后開始腹瀉，有的病牛體溫可降至

正常。初期腹瀉物呈黃色粥樣，后期呈灰白色水樣，有的混有未消化的凝乳塊、血液及泡沫，有酸臭氣

味。末期犢牛肛門失禁，常腹痛，用蹄踢腹部。有的病程長的犢牛表現(xiàn)發(fā)育遲滯和呼吸困難等癥狀。有

的犢牛出現(xiàn)腹瀉后急性死亡。

病理變化

皺胃黏膜和小腸黏膜充血、水腫，可能見出血斑點。腸系膜淋巴結(jié)腫大。膽囊嚴(yán)重擴張，充滿暗綠

色膽汁。心外膜和心內(nèi)膜散在或彌漫分布出血斑點。急性炎性脾腫，脾臟腫大和質(zhì)軟，部分病例脾臟表

面可見出血斑點，其它組織器官也可能見出血斑點。經(jīng)臍帶感染的病例可見出血性臍炎和出血性臍動脈

炎。病程長的病例可能伴有漿液纖維素性關(guān)節(jié)炎和出血性或漿液性出血性肺炎。

6實驗室診斷

主要儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（37℃±2℃）、漩渦振蕩器、倒置顯微鏡、PCR儀、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像

儀、微量可調(diào)移液器（規(guī)格100μL～1000μL、20μL～200μL、1μL～20μL）、高速臺式冷凍

離心機（4℃，離心速度12000r/min以上）、冰箱（2℃～8℃、-20℃和-70℃）、自動微生物生

化鑒定系統(tǒng)。

主要試劑

除特別說明以外，本文件所用試劑均為分析純，所有試劑均用無RNase污染的容器分裝。

生理鹽水、營養(yǎng)瓊脂平板、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管及指示劑、無霉水、PCR酶、DNAMarker（DL500、

DL2000）。

樣品采集與處理

6.3.1生物安全措施

樣品的采集按照NY/T541的規(guī)定進(jìn)行。

樣品處理的生物安全措施符合GB19489的規(guī)定。

6.3.2糞便樣品

2

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將無菌棉拭子伸入肛門內(nèi)刮取新鮮糞便，也可無菌采集剛排出的新鮮糞便。分別放入盛有滅菌生理

鹽水的采樣管中，編號并記錄相關(guān)信息。

6.3.3組織樣品

取病死牛腸組織及內(nèi)容物、臍帶、肝、脾等，置于采樣杯內(nèi)。

病原檢測

6.4.1細(xì)菌分離

無菌條件下，將樣品接種于MAC或EMB瓊脂平板，37℃±2℃培養(yǎng)16h～24h，觀察菌落特征。

在MAC瓊脂平板上，多數(shù)大腸桿菌呈桃紅色或粉紅色菌落，有的也呈無色菌落；在EMB瓊脂平板上，多數(shù)

大腸桿菌呈紫黑色帶金屬光澤的菌落，有的呈無色或琥珀色半透明菌落。

挑取單個疑似菌落接種于MAC或EMB瓊脂平板，37℃±2℃培養(yǎng)16h～24h進(jìn)行鑒定。

6.4.2革蘭染色鏡檢

挑取MAC或EMB瓊脂平板上的大腸桿菌特征性菌落，經(jīng)營養(yǎng)瓊脂平板純化后制備涂片，自然干燥，革

蘭染色，鏡檢可見兩端鈍圓的粉紅色革蘭陰性短桿菌，散在或成對存在。

6.4.3生化鑒定

根據(jù)《伯杰細(xì)菌手冊》對大腸桿菌進(jìn)行生化特性鑒定。

挑取符合大腸桿菌形態(tài)學(xué)特征的單個菌落接種細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，進(jìn)行甲基紅試驗、吲哚（靛基

質(zhì)）試驗、枸櫞酸鹽試驗、V-P試驗、硫化氫試驗、三糖鐵試驗、尿素酶試驗、糖類分解試驗（葡萄糖、

乳糖、甘露糖、蔗糖）等。

甲基紅試驗、吲哚試驗、葡萄糖和甘露糖發(fā)酵試驗結(jié)果呈陽性，枸櫞酸鹽試驗、V-P試驗、尿素酶

試驗結(jié)果呈陰性，三糖鐵瓊脂斜面呈黃色、底層產(chǎn)氣，幾乎不產(chǎn)生硫化氫，大多數(shù)菌株可迅速發(fā)酵乳糖，

僅極少數(shù)遲發(fā)酵或不發(fā)酵，約半數(shù)菌株不分解蔗糖，符合以上生化反應(yīng)說明符合大腸桿菌特性。也可用

自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

6.4.4PCR鑒定

6.4.4.1DNA提取

將采集的樣品進(jìn)行處理，按DNA提取試劑盒方法提取核酸。-20℃以下保存。

6.4.4.2DECPCR檢測

按照GB4789.6對DEC（ETEC、EHEC、EIEC、EPEC、EAEC、STEC）進(jìn)行PCR檢測。

6.4.5測序鑒定（選做）

細(xì)菌全基因組測序、16S測序、MLST等測序技術(shù)進(jìn)行鑒定。

6.4.6致病性鑒定（選做）

取健康狀態(tài)良好小白鼠，分成試驗組和對照組。將符合6.4.2和6.4.3或6.4.4或6.4.5結(jié)果的大腸桿

菌菌株，按照細(xì)菌生長曲線制備不同濃度的菌懸液，腹腔注射試驗組小鼠。注射后觀察5d～7d，若對

照組小鼠均正常，試驗組小鼠精神萎靡，食欲減退至廢絕，靜止抱團，腹瀉或死亡，無菌條件下取死亡

小鼠的組織樣品分離細(xì)菌，進(jìn)行革蘭染色鏡檢、生化鑒定或PCR鑒定。