大蒜素對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞株影響及作用機(jī)制的研究一、引言胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，其5年生存率極低，嚴(yán)重威脅人類健康。人胰腺癌PANC-1細(xì)胞株是研究胰腺癌的常用模型。大蒜素作為大蒜中的主要生物活性成分，具有多種生物學(xué)功能，近年來其在抗癌領(lǐng)域的研究備受關(guān)注。本研究旨在探究大蒜素對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞株的影響及其作用機(jī)制，為胰腺癌的治療提供新的思路和理論依據(jù)。二、材料與方法（一）實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：人胰腺癌PANC-1細(xì)胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。試劑：大蒜素（純度≥98%）購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BDBiosciences公司；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自ThermoFisherScientific公司；Westernblot相關(guān)抗體購自CellSignalingTechnology公司。儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）、倒置顯微鏡（Olympus）、酶標(biāo)儀（BioTek）、流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）、蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）。（二）實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：將PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：將對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度（0、5、10、20、40、80μmol/L）的大蒜素，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入10μlCCK-8溶液，孵育2h，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：將PANC-1細(xì)胞接種于6孔板，每孔2×10?個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24h后，加入終濃度為20μmol/L的大蒜素處理48h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)：收集經(jīng)不同處理的PANC-1細(xì)胞，用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1h后，加入相應(yīng)的一抗（如Bcl-2、Bax、Caspase-3等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌3次，每次10min，用化學(xué)發(fā)光法顯影，ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（一）大蒜素對PANC-1細(xì)胞增殖的影響不同濃度大蒜素處理PANC-1細(xì)胞24、48、72h后，CCK-8檢測結(jié)果顯示，大蒜素對PANC-1細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈濃度和時(shí)間依賴性。隨著大蒜素濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高（圖1）。在作用72h時(shí)，80μmol/L大蒜素處理組的細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)70.56%。（二）大蒜素對PANC-1細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，與對照組相比，20μmol/L大蒜素處理48h后，PANC-1細(xì)胞凋亡率顯著增加（圖2）。對照組細(xì)胞凋亡率為5.23%，而大蒜素處理組細(xì)胞凋亡率升高至28.67%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（三）大蒜素對PANC-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Westernblot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，大蒜素處理組PANC-1細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，而促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)水平明顯升高（圖3）。Bcl-2/Bax比值下降，表明大蒜素可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白表達(dá)，激活Caspase-3信號(hào)通路，誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡。四、討論本研究結(jié)果表明，大蒜素對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞株具有顯著的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。在細(xì)胞增殖方面，大蒜素能夠濃度和時(shí)間依賴性地抑制PANC-1細(xì)胞的生長，這與以往研究報(bào)道一致。其抑制機(jī)制可能與大蒜素干擾細(xì)胞周期進(jìn)程、影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)。在細(xì)胞凋亡方面，大蒜素通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，改變Bcl-2/Bax比值，進(jìn)而激活Caspase-3信號(hào)通路，誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，Bax可促進(jìn)線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；而Bcl-2則通過阻止線粒體膜通透性改變，抑制細(xì)胞凋亡。本研究中大蒜素對Bcl-2家族蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，為其誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制提供了有力證據(jù)。此外，大蒜素作為一種天然產(chǎn)物，具有來源廣泛、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，有望成為一種潛在的胰腺癌治療藥物。然而，目前關(guān)于大蒜素在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)以及與其他抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用等方面的研究還相對較少，需要進(jìn)一步深入探究。五、結(jié)論本研究證實(shí)了大蒜素對人胰腺癌PANC