第2節(jié)基因工程的基本操作程序【知識(shí)準(zhǔn)備】

基因的結(jié)構(gòu)原核基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)(不編碼蛋白質(zhì)合成)(調(diào)控基因的表達(dá))編碼區(qū)(編碼蛋白質(zhì)的合成)DNA片段基因B基因D基因h1.原核基因的結(jié)構(gòu)真核基因啟動(dòng)子RNA聚合酶識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子(終止轉(zhuǎn)錄)外顯子(編碼蛋白質(zhì))內(nèi)含子(不編碼蛋白質(zhì))★外顯子、內(nèi)含子交替排列外顯子數(shù)=內(nèi)含子數(shù)+12.真核基因的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄AUG起始密碼子終止密碼子AUAmRNA啟動(dòng)子：基因上游的非編碼區(qū)、DNA片段、RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)終止子：基因下游的非編碼區(qū)、DNA片段、終止轉(zhuǎn)錄起始密碼子：mRNA上3個(gè)相鄰堿基、翻譯開(kāi)始并編碼氨基酸終止密碼子：mRNA上3個(gè)相鄰堿基、終止翻譯概念辨析轉(zhuǎn)錄AUG起始密碼子終止密碼子AUAmRNA真核基因啟動(dòng)子終止子3.原核基因的表達(dá)非編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)5‘3‘3‘5‘啟動(dòng)子終止子5‘3‘mRNA肽鏈H2NCOOH終止密碼子轉(zhuǎn)錄翻譯邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯

(無(wú)核膜阻隔、無(wú)mRNA加工)外顯子內(nèi)含子先轉(zhuǎn)錄后翻譯

(有核膜阻隔、有mRNA加工)4.真核基因的表達(dá)思考：僅考慮運(yùn)載體，為插入目的基因，最好用何種限制酶切割質(zhì)粒？啟動(dòng)子終止子標(biāo)記基因1EcoRⅠ復(fù)制原點(diǎn)標(biāo)記基因2BamHⅠSpeⅠXhoⅠSmaⅠ質(zhì)?！緩纳鐣?huì)中來(lái)】轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)的機(jī)制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉一般需要哪些步驟？轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉(害蟲(chóng)死亡)非轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉(害蟲(chóng)不死亡)第2節(jié)基因工程的基本操作程序培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉主要需要四個(gè)步驟質(zhì)粒重組質(zhì)粒①目的基因的篩選與獲取②基因表達(dá)載體的構(gòu)建③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞④目的基因的檢測(cè)與鑒定第一步目的基因的篩選與獲取在基因工程中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，如與生物抗逆性、生產(chǎn)藥物、毒物降解、工業(yè)用酶等相關(guān)的基因?？瓜x(chóng)棉的抗蟲(chóng)大腸桿菌產(chǎn)人胰島素調(diào)節(jié)因子蘇云金桿菌Bt基因重組質(zhì)粒受體細(xì)胞植物組織培養(yǎng)Bt抗蟲(chóng)蛋白害蟲(chóng)死亡①②③④蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白(Bt抗蟲(chóng)蛋白)，破壞鱗翅目昆蟲(chóng)的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲(chóng)。將該細(xì)菌的“殺蟲(chóng)基因”轉(zhuǎn)到棉花里，讓棉花也能產(chǎn)生Bt抗蟲(chóng)蛋白抵抗蟲(chóng)害。這個(gè)“殺蟲(chóng)基因”就是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉用到的目的基因----Bt抗蟲(chóng)蛋白基因，簡(jiǎn)稱Bt基因

(生物防治)★目的基因需在體外“改造”----促進(jìn)其在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)胰島素基因含內(nèi)含子，在大腸桿菌中，轉(zhuǎn)錄出的mRNA中與內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列不能被切除，無(wú)法表達(dá)出胰島素?！舅伎?】從基因組文庫(kù)中獲得的胰島素基因(含內(nèi)含子)，若以大腸桿菌作為受體細(xì)胞卻未得到對(duì)應(yīng)的胰島素，其原因可能是_________________________________________________P77【相關(guān)信息】

①當(dāng)Bt抗蟲(chóng)蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲(chóng)腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲(chóng)死亡。抗蟲(chóng)棉Bt抗蟲(chóng)蛋白Bt抗蟲(chóng)蛋白分解為多肽多肽與腸上皮細(xì)胞受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞穿孔②Bt抗蟲(chóng)蛋白只有在某類昆蟲(chóng)腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性。③人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒(méi)有特異性受體。Bt抗蟲(chóng)蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生上述影響篩選合適的目的基因①?gòu)南嚓P(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。②利用測(cè)序技術(shù)、序列數(shù)據(jù)庫(kù)(如GenBank)、序列對(duì)比工具(如BLAST)等，找到合適的目的基因測(cè)序技術(shù)(測(cè)定核酸序列)DNA測(cè)序儀序列數(shù)據(jù)庫(kù)(以堿基順序或氨基酸殘基順序?yàn)榛緝?nèi)容的分子生物信息數(shù)據(jù)庫(kù))序列比對(duì)工具把感興趣的序列跟已經(jīng)存在的序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較的工具獲取目的基因的方法1.人工合成目的基因2.通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因基因組DNA限制酶DNA自體插入載體重組載體感染宿主菌基因組文庫(kù)推測(cè)推測(cè)化學(xué)合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因★逆轉(zhuǎn)錄法密碼子有兼并性，基因不唯一3.用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因【基礎(chǔ)知識(shí)回顧】DNA的復(fù)制①時(shí)期：②復(fù)制方向：③酶：④特點(diǎn)：沿母鏈3‘5’解旋酶、DNA連接酶、DNA連接酶有間、減Ⅰ前的間邊解旋邊復(fù)制、半保留復(fù)制、堿基互補(bǔ)配對(duì)①PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫(xiě)它是一項(xiàng)根據(jù)②DNA半保留復(fù)制的原理③在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件④對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶(體外用高溫代替)打開(kāi)DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物(2種)使DNA聚合酶能夠從引物的3‘端開(kāi)始連接脫氧核苷酸2.DNA復(fù)制所需要的基本條件1.概念參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶(體外用高溫代替)打開(kāi)DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物(2種)使DNA聚合酶能夠從引物的3‘端開(kāi)始連接脫氧核苷酸dATP、dGTP、dTTP、dCTP①斷裂2個(gè)高能磷酸鍵②作為合成DNA子鏈的原料③為合成DNA提供能量【相關(guān)信息】①真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。

②PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2+。③體外、耐高溫ATP與dATP的區(qū)別AAOHH腺苷腺嘌呤核糖核苷酸ADPATP腺苷腺嘌呤脫氧核苷酸dADPdATPOHOH①引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸②用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20?30個(gè)核苷酸③細(xì)胞外(PCR)一般以DNA單鏈為引物細(xì)胞內(nèi)通常以RNA單鏈為引物什么是引物？引物的作用：DNA聚合酶結(jié)合引物，才啟動(dòng)復(fù)制引物的位置：DNA模板鏈的3'端DNA聚合酶

不同點(diǎn)場(chǎng)所解旋方式酶引物溫度能量子鏈合成結(jié)果相同點(diǎn)原則、方式條件子鏈延伸方向體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)DNA在高溫下解旋解旋酶催化PCR技術(shù)DNA復(fù)制耐高溫的DNA聚合酶DNA聚合酶、解旋酶一般為單鏈DNA片段一小段RNA需控制溫度，在較高溫度下進(jìn)行體內(nèi)溫和條件dNTP提供能量ATP提供能量?jī)蓷l子鏈都是連續(xù)合成一條子鏈連續(xù)合成，另一條不連續(xù)合成大量的DNA片段或基因形成整個(gè)DNA分子堿基互補(bǔ)配對(duì)、半保留復(fù)制模板、酶、能量、原料等5’3’(母鏈3’5’)待擴(kuò)增的DNA片段5’5’3’3’PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，需提供DNA模板，分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物，4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶；同時(shí)通過(guò)控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行DNA模板4種脫氧核苷酸AGCTA引物耐高溫的DNA聚合酶變性當(dāng)溫度超過(guò)90℃時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈5’5’3’3’變性①_______(需要/不需要)解旋酶②當(dāng)溫度上升到_______以上時(shí)，______斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條___________。③當(dāng)DNA片段中G、C比例越高，變性(解旋)時(shí)所需的溫度越_____。不需要90℃氫鍵DNA單鏈高復(fù)性當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合5’5’3’3’5’3’5’3’延伸當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。5’5’3’3’3’3’5’5’思考：1.為什么溫度要上升至72℃？

2.Taq酶結(jié)合在引物的3’還是5’端？72℃是耐高溫的DNA聚合酶的最適溫度3’端5’5’3’3’5’5’3’3’3’3’5’5’第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物。第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)的產(chǎn)物。由于延伸后得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成指數(shù)形式擴(kuò)增(約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù))。每次循環(huán)一般可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。擴(kuò)增的過(guò)程目的基因DNA受熱變性后解為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合然后以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸，即將4種脫氧核苷酸加到引物的3‘端如此重復(fù)循環(huán)多次

(一般25～30次)

PCR儀變性復(fù)性延伸P79【

旁欄思考】

用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？根據(jù)上圖回答問(wèn)題：(1)酶1是___________酶，它以____________為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的___________，兩條鏈間的堿基是________的，兩條鏈形成____________________鏈；(2)核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的________鏈，使之變成單鏈DNA；(3)酶2是_____________________酶，它以_______________為模板，合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。mRNA不能直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成DNA再進(jìn)行擴(kuò)增酶1酶2逆轉(zhuǎn)錄單鏈RNA單鏈DNA互補(bǔ)RNA-DNA雜交分子RNA耐高溫的DNA聚合單鏈DNAPCR完成以后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定PCR的產(chǎn)物。PCR儀下圖2是PCR擴(kuò)增技術(shù)相關(guān)過(guò)程，回答問(wèn)題：5’5’3’3’5’5’3’3’3’5’5’①③3’②5’5’3’④5’5’3’3’3’3’5’5’3’②5’5’3’④3’5’①③5’3’3’5’5’3’5’5’3’5’5’3’3’3’3’5’5’3’3’3’5’5’⑤③5’5’3’3’④⑤1.PCR擴(kuò)增的是完整的模板DNA分子嗎？并說(shuō)明理由。只復(fù)制兩種引物之間的DNA片段2.在第____輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條鏈等長(zhǎng)的DNA片段，比例是______三1/43’3’①②5’5’3.PCR中，引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。①引物自身不能環(huán)化②兩種引物間不能配對(duì)③目的基因在兩引物之間3’5’5’①③3’②5’5’3’④5’5’3’3’5’5’3’3’3’3’①②5’5’5’5’3’3’3’3’5’5’3’②5’5’3’④3’5’①③5’3’3’5’5’3’5’5’3’5’5’3’3’3’3’5’5’3’3’3’5’5’⑤③5’5’3’3’④⑤3.PCR中，引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。④要在兩種引物的5′端分別加上限制酶的識(shí)別序列3’3’5’5’5’5’3’3’引物1引物2限制酶識(shí)別序列限制酶識(shí)別序列目的基因4.PCR中的數(shù)量關(guān)系(復(fù)制N次)DNA分子數(shù)=__________含引物的DNA分子數(shù)=__________含引物1的DNA分子數(shù)=__________含兩種引物的DNA分子數(shù)=__________共消耗引物的對(duì)數(shù)=__________等長(zhǎng)DNA分子數(shù)=__________5’5’3’3’5’5’3’3’3’5’5’①③3’②5’5’3’④3’3’①②5’5’5’5’3’3’3’3’5’5’3’②5’5’3’④3’5’①③5’3’3’5’5’3’5’5’3’5’5’3’3’3’3’5’5’3’3’3’5’5’⑤③5’5’3’3’④⑤2N2N2N-12N-22N-12N–2NA.耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到子鏈的3′端B.在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段C.引物之間或引物自身發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，則不能有效擴(kuò)增目的基因D.從理論上推測(cè)，第三輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段占3/42.如圖表示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的部分過(guò)程，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是問(wèn)題：獲得了足量的Bt基因后，是否能直接將它導(dǎo)入棉花細(xì)胞呢？第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心環(huán)節(jié))獲取Bt基因后不能直接將它導(dǎo)入受體細(xì)胞，是因?yàn)橛坞x的DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)________________；即使可以轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無(wú)法隨著____________而進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中_________________。因此，獲取Bt基因后，還需要________________________________，才能使棉花植株獲得抗蟲(chóng)特性。直接被分解細(xì)胞分裂不含目的基因借助載體將其導(dǎo)入棉花細(xì)胞獲取了足夠量的Bt基因后①下一步就是要讓基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代

②使Bt基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用，這就需要構(gòu)建基因表達(dá)載體①基因表達(dá)載體是載體的一種，除目的基因、標(biāo)記基因外，它還必須有啟動(dòng)子、終止子等質(zhì)粒限制酶切割位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)③有時(shí)為了滿足應(yīng)用需要，會(huì)在載體中人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。②啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNARNA聚合酶RNA聚合酶誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物激活表達(dá)誘導(dǎo)物抑制表達(dá)啟動(dòng)子終止子標(biāo)記基因1EcoRⅠ復(fù)制原點(diǎn)標(biāo)記基因2BamHⅠSpeⅠXhoⅠSmaⅠ終止子使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)它位于基因的下游

一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段★目的基因應(yīng)插入______________________________且不能_______。啟動(dòng)子下游和終止子上游之間反向質(zhì)粒限制酶切割位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)限制酶①用一定的限制酶切割載體，使其出現(xiàn)一個(gè)切口。目的基因限制酶切割位點(diǎn)限制酶獲得目的基因②在構(gòu)建抗蟲(chóng)棉的基因表達(dá)載體時(shí)，首先會(huì)用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口DNA連接酶重組DNA分子③利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，形成了一個(gè)重組DNA分子啟動(dòng)子HindⅢ氯霉素抗性基因四環(huán)素素抗性基因PstⅠSmaⅠAluⅠSmaⅠ甲乙目的基因RNA聚合酶移動(dòng)方向外源DNAPstⅠSmaⅠHindⅢAluⅠ例1：某科研小組利用質(zhì)粒(圖甲)和目的基因(圖乙)構(gòu)建重組DNA。下列不正確的是A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割質(zhì)粒，可得到2條DNA片段B.不能用AluⅠ酶切割質(zhì)粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶會(huì)破壞目的基因C.構(gòu)建重組DNA時(shí)，需選擇SmaⅠ酶和PstⅠ酶同時(shí)切割質(zhì)粒和外源DNAD.導(dǎo)入了重組DNA的細(xì)菌能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而不能在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)例2：多溴聯(lián)苯醚（分子式C12H5Br4O，簡(jiǎn)稱BDE-47）是一種電子垃圾分解后產(chǎn)生的環(huán)境污染物，進(jìn)入人體會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等產(chǎn)生毒害。為了提高好氧細(xì)菌的降解效率，將GB-2細(xì)菌內(nèi)獲取的BDE-47降解基因?qū)隬T-G受體菌，構(gòu)建成基因工程菌1、2、3，如圖是對(duì)三種菌相關(guān)基因的電泳結(jié)果。下列敘述錯(cuò)誤的是A.由圖可知，工程菌2必為為降解BDE-47能力強(qiáng)的目的菌株B.從GB-2細(xì)菌內(nèi)獲取的BDE-47降解基因可通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增C.將含有BDE-47降解基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入WT-G受體菌時(shí)，用Ca2+處理會(huì)增大導(dǎo)入率D.若要增加篩選GB-2細(xì)菌的可能性，應(yīng)從多溴聯(lián)苯醚污染區(qū)取樣并進(jìn)行菌體培養(yǎng)例3：某雙子葉植物種子胚的顏色受兩對(duì)等位基因（A/a，B/b）控制，表型有橙、黃、紅三種。橙色植株甲與黃色植株乙雜交，F(xiàn)1均為紅色，F(xiàn)1自交，F(xiàn)2中紅：橙：黃的比例為9：4：3。用A、B、a、b四種基因的特異性引物對(duì)甲、乙細(xì)胞的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用A基因特異性引物對(duì)F2中紅色丙、用B基因特異性引物對(duì)F2中紅色丁的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增作為標(biāo)準(zhǔn)參照。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖所示。在不考慮變異的情況下，下列敘述錯(cuò)誤的是A.條帶1、2、3、4對(duì)應(yīng)的基因分別為A、a、B、bB.甲的基因型為AAbb、乙的基因型為aaBBC.F1的基因型為AaBb，丙基因型不可能是AAbbD.F2的橙色個(gè)體之間隨機(jī)傳粉，子代的表型均為橙色例4：纖維素酶是一種復(fù)合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶能使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖?？蒲腥藛T從某菌株中獲得了C1酶基因，將其與HT質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建基因表達(dá)載體生產(chǎn)高效C1酶。過(guò)程如圖所示，已知C1酶基因以B鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是A.在含有纖維素的固體培養(yǎng)基中加入剛果紅，能形成紅色復(fù)合物，滴加適量C1酶和Cx酶后周圍會(huì)出現(xiàn)透明圈

B.酶切位點(diǎn)1加上SmaI的識(shí)別序列，酶切位點(diǎn)2加上BamHⅠ的識(shí)別序列

C.啟動(dòng)子是一段有特殊序列的DNA片段，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)

D.基因工程的載體除了質(zhì)粒外，還可以是噬菌體或動(dòng)植物病毒啟動(dòng)子BamHⅠSamⅠHT質(zhì)粒酶切連接A鏈B鏈5’3’5’3’酶切位點(diǎn)1酶切位點(diǎn)2C1酶基因例5：

(1)PvuⅠ和EcoRⅠ是兩種限制酶，在4my3基因和質(zhì)粒上均有它們的酶切位點(diǎn)，據(jù)圖分析，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)適合選用的限制酶是________。

(2)質(zhì)粒是基因工程中常用的運(yùn)載體，選擇質(zhì)粒作為運(yùn)載體的意義是____________________________________________________________________________________________________。

質(zhì)粒A、C不能作為載體的原因是________________________________________________。(Ampr為氨芐青霉素抗性基因，Tetr為四環(huán)素抗性基因，lacZ為藍(lán)色顯色基因)

(3)將由4my3基因和質(zhì)粒B構(gòu)建的重組質(zhì)粒用EcoRⅠ進(jìn)行完全酶切并電泳，會(huì)出現(xiàn)____種長(zhǎng)度的電泳帶。構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，在載體中會(huì)人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其目的是___________________________________________________________________。用選擇培養(yǎng)基篩選時(shí)，_____________________________的菌落為導(dǎo)入重組質(zhì)粒成功的大腸桿菌形成的菌落。PvuⅠ質(zhì)粒分子上有一至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；攜帶外源DNA的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞隨受體DNA同步復(fù)制A質(zhì)粒無(wú)標(biāo)記基因、質(zhì)粒C用PvuⅠ切割時(shí)會(huì)破壞復(fù)制原點(diǎn)2當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)抗氨芐青霉素，不顯藍(lán)色第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

1、花粉管通道法花粉花粉管精子卵細(xì)胞①可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因卵細(xì)胞精子花粉管②可以在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。目的基因外源DNA進(jìn)入受精卵植物組織培養(yǎng)植物細(xì)胞常用的方法還有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。資料卡農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化是指將目的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力。農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤實(shí)質(zhì)：將目的基因整合到受體細(xì)胞基因組中Ti質(zhì)粒擬核農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNAtratraRepVir農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有________，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的_________(___________________)轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其___________________________上Ti質(zhì)粒T-DNATi質(zhì)粒T-DNA可轉(zhuǎn)移的DNA整合到該細(xì)胞的染色體DNA目的基因農(nóng)桿菌將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞。表現(xiàn)出新性狀的植株植物組織培養(yǎng)含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌根據(jù)受體植物的不同，所用的具體轉(zhuǎn)化方法有所區(qū)別：可將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株可以將花序直接浸沒(méi)在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再篩選目的基因T-DNA目的基因含目的基因的重組Ti質(zhì)粒T-DNATi質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌入侵植物細(xì)胞目的基因第1次拼接第2次拼接第1次導(dǎo)入第2次導(dǎo)入導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞：顯微注射法(受精卵)構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動(dòng)物的受精卵中體外胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動(dòng)物桑葚胚、囊胚T-DNA+目的基因含目的基因的T-DNA重組的腺病毒DNA腺病毒蛋白質(zhì)導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞：病毒轉(zhuǎn)入法導(dǎo)大腸桿菌等：

Ca2+法(處于能吸收DNA狀態(tài))Ca2+真核基因?qū)朐思?xì)胞，難表達(dá)出原蛋白：①原核細(xì)胞無(wú)去除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的mRNA的酶②原核細(xì)胞無(wú)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)種類項(xiàng)目

植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法

受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法體細(xì)胞、受精卵目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞DNA中表達(dá)目的基因表達(dá)載體提純?nèi)∈芫扬@微注射受精卵發(fā)育獲得具有新性狀的動(dòng)物顯微注射法受精卵Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸DNA分子Ca2＋處理法原核細(xì)胞例：如圖為科學(xué)家通過(guò)基因工程培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，從蘇云金桿菌中提取抗蟲(chóng)基因“放入”棉花細(xì)胞中，與棉花的DNA分子“結(jié)合起來(lái)”而發(fā)揮作用的過(guò)程示意圖。下列相關(guān)說(shuō)法不正確的是A.圖中Ⅰ最好是Ti質(zhì)粒，步驟①需要用到限制酶和DNA連接酶B.圖中Ⅱ是含目的基因的重組質(zhì)粒，步驟②的方法可以花粉管道法或農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法C.圖中Ⅲ是農(nóng)桿菌，通過(guò)步驟③將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞再進(jìn)行植物組織培養(yǎng)D.剔除培育成功的抗蟲(chóng)棉體內(nèi)的四環(huán)素抗性基因不會(huì)影響抗蟲(chóng)基因的表達(dá)第四步：目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，要穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。不同長(zhǎng)度的DNA非轉(zhuǎn)基因生物目的基因被轉(zhuǎn)基因操作過(guò)的個(gè)體電泳轉(zhuǎn)基因生物PCR是否擴(kuò)增出目的基因？提取所有DNA一、分子水平檢測(cè)

(1)受體有無(wú)目的基因①提取DNAPCR電泳②DNA分子雜交技術(shù)待測(cè)DNA目的基因探針熒光(放射性)標(biāo)記DNA雜交分子待測(cè)DNA目的基因探針熒光標(biāo)記DNA雜交分子待測(cè)DNADNA單鏈有無(wú)DNA雜交分子熒光標(biāo)記目的基因探針一、分子水平檢測(cè)

(2)目的基因是否轉(zhuǎn)錄

①轉(zhuǎn)基因生物的mRNA與目的基因探針雜交目的基因目的基因探針轉(zhuǎn)基因的所有mRNADNA-mRNA雜交分子目的基因探針+逆轉(zhuǎn)錄DNA片斷②提取mRNA逆轉(zhuǎn)錄成DNADNA分子雜交(或電泳)一、分子水平檢測(cè)

(3)目的基因是否翻譯蘇云菌桿菌提取Bt毒蛋白抗原提取抗體抗原-抗體反應(yīng)熒光標(biāo)記提取蛋白質(zhì)+

抗體是否抗原-抗體反應(yīng)二、個(gè)體生物學(xué)水平鑒定----相應(yīng)性狀轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法抗蟲(chóng)植物抗病毒(菌)植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲(chóng)接種病毒(菌)鹽水澆灌噴灑除草劑提取細(xì)胞產(chǎn)物培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的四個(gè)步驟，其實(shí)就反映了基因工程的基本操作程序在獲得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的過(guò)程中，還可以通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因某種生物的基因組切割成許多基因構(gòu)建重組載體導(dǎo)入受體菌群體形成基因文庫(kù)將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫(kù)導(dǎo)入受體菌群體、形成基因文庫(kù)基因組文庫(kù)----含某種生物所有基因部分基因文庫(kù)----只含某種生物部分基因如cDNA文庫(kù)某基因的mRNAmRNA加工、拼接cDNA文庫(kù)不同轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品所需要的目的基因不同，受體細(xì)胞又有植物、動(dòng)物、微生物之分我能產(chǎn)人乳大腸桿菌人胰島素基因超級(jí)鼠轉(zhuǎn)基因大豆將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法也不是完全相同的花粉花粉管精子卵細(xì)胞植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌將目的基因?qū)雱?dòng)物受精卵最常用的一種方法是利用顯微注射將目的基因注入動(dòng)物的受精卵中，這個(gè)受精卵將發(fā)育成為具有新性狀的動(dòng)物。病毒入侵在基因工程操作中，常用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌應(yīng)用最為廣泛。先用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。單細(xì)胞、繁殖快、遺傳物質(zhì)少、質(zhì)粒人胰島素、生長(zhǎng)素1.研究人員將一種海魚(yú)的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上，然后用它侵染番茄細(xì)胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關(guān)表述是否正確。

(1)afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。()

(2)構(gòu)建含有afp基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶。()

(3)只要檢測(cè)出番茄細(xì)胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功。()研究人員在研究轉(zhuǎn)基因煙草中外源卡那霉素抗性基因的遺傳穩(wěn)定性時(shí)，發(fā)現(xiàn)44株轉(zhuǎn)基因煙草中有4株該基因的遺傳不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，在它們的自交后代中出現(xiàn)了較多的沒(méi)有卡那霉素抗性的植株。嘗試對(duì)這個(gè)問(wèn)題作出解釋。2.利用PCR既可以快速擴(kuò)增特定基因，也可以檢測(cè)基因的表達(dá)。下列有關(guān)PCR的敘述錯(cuò)誤的是A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶B.變性過(guò)程中雙鏈DNA的解開(kāi)不需要解旋酶C.復(fù)性過(guò)程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則D.延伸過(guò)程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸外源基因插入基因組中可能為單位點(diǎn)插入，或者同一染色體多位點(diǎn)插入，或者不同染色體多位點(diǎn)插入。大多數(shù)情況下，插入的位點(diǎn)難以做到定點(diǎn)插入；插入的拷貝數(shù)也是隨機(jī)的。因此，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳是很復(fù)雜的。例如，科研人員在對(duì)轉(zhuǎn)GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的煙草進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株的染色體DNA中整合了多個(gè)拷貝的基因，從而導(dǎo)致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩(wěn)定性?！緦?shí)踐·實(shí)踐】DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定利用PCR可以在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增。PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。一般使用的電泳緩沖液pH=8，DNA分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中DNA便向正極泳動(dòng)。PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。目的要求

1.了解PCR和電泳鑒定的基本原理。2.嘗試進(jìn)行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物。材料用具4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液瓊脂糖、核酸染料PCR儀微量離心管一次性吸液槍頭瓊脂糖凝膠電泳裝置方法步驟1.用微量移液器按照右欄中的配方或PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)，在微量離心管中依次加入各組分10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28?33μL1?5U/μL的TaqDNA聚合酶1?2U模板DNA1pg?1μg總體積50μL2.待所有的組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在管的底部。3.參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)4.根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%?1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。5.