醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)操作技巧指南醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)是科研探索與臨床轉(zhuǎn)化的核心基石，實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范性、精準(zhǔn)性直接決定結(jié)果的可靠性與可重復(fù)性。本文結(jié)合一線實(shí)驗(yàn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，從無菌操作、移液器使用、細(xì)胞培養(yǎng)、顯微鏡觀察、溶液配制、動物實(shí)驗(yàn)、病理切片七大核心模塊，梳理實(shí)用操作技巧，助力實(shí)驗(yàn)人員突破技術(shù)瓶頸，提升實(shí)驗(yàn)效率。一、無菌操作技術(shù)：實(shí)驗(yàn)安全與結(jié)果可靠的第一道防線無菌操作是細(xì)胞培養(yǎng)、微生物實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的“生命線”，需貫穿實(shí)驗(yàn)全流程。（一）實(shí)驗(yàn)前：環(huán)境與個(gè)人的雙重防護(hù)臺面消毒：用75%乙醇或?qū)Ｓ孟驹噭础皬膬?nèi)到外、從上到下”順序擦拭實(shí)驗(yàn)臺，清除碎屑?xì)埩簦ū苊馕廴緮U(kuò)散）。個(gè)人防護(hù)：穿戴實(shí)驗(yàn)服、丁腈/乳膠手套（依實(shí)驗(yàn)類型選擇，過敏者優(yōu)先丁腈），長發(fā)束起，摘除首飾（減少污染風(fēng)險(xiǎn)與器械剮蹭）。（二）操作中：動態(tài)無菌區(qū)的建立與維護(hù)火焰無菌區(qū)：酒精燈火焰周圍10~15cm為相對無菌區(qū)，接種環(huán)、鑷子等器械需灼燒滅菌（火焰外焰灼燒至紅熱，冷卻后可接觸無菌培養(yǎng)基驗(yàn)證溫度，避免燙傷細(xì)胞/菌種）。試劑取用：瓶口、管蓋開啟后倒扣于無菌區(qū)，移液槍頭避免觸碰非無菌區(qū)域（如臺面、瓶壁）；不同樣本操作需更換手套或消毒（防止交叉污染）。（三）操作后：污染的“閉環(huán)處理”廢棄物分類：生物廢液（如細(xì)胞培養(yǎng)液）經(jīng)高壓滅菌后處理，銳器（針頭、刀片）入專用利器盒；污染樣本（如真菌污染的培養(yǎng)基）需單獨(dú)滅菌，避免擴(kuò)散。臺面與儀器消毒：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后再次用75%乙醇擦拭臺面、生物安全柜內(nèi)壁及離心機(jī)等儀器表面，降低殘留污染風(fēng)險(xiǎn)。二、移液器精準(zhǔn)操作：微量液體處理的核心技巧移液器是分子實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的“精準(zhǔn)武器”，操作誤差會直接放大實(shí)驗(yàn)偏差。（一）量程匹配與槍頭適配量程選擇：避免超量程使用（如20~200μL移液器，移液體積應(yīng)在30~200μL區(qū)間，保證精度）；多量程操作時(shí)，優(yōu)先選擇接近目標(biāo)體積的移液器（如移液15μL，選20μL量程優(yōu)于200μL量程）。槍頭適配：不同品牌移液器槍頭可能不通用，需匹配原廠或兼容槍頭（漏液會導(dǎo)致移液量不足，可通過“懸滴法”驗(yàn)證：吸液后槍頭懸掛液滴應(yīng)均勻，無滴液/漏液）。（二）吸液與排液的“慢哲學(xué)”吸液：槍頭垂直浸入液面下2~3mm（過深易掛壁，過淺易吸空氣），緩慢按壓活塞至第一停點(diǎn)，停留1~2秒后緩慢釋放（避免液體飛濺或氣泡產(chǎn)生）。排液：槍頭貼壁，按壓活塞至第一停點(diǎn)后停留1秒，再按壓至第二停點(diǎn)（確保液體完全排出，減少殘留）；若吸液產(chǎn)生氣泡，需重新吸液（氣泡會導(dǎo)致體積誤差，尤其微量移液時(shí)）。（三）校準(zhǔn)與維護(hù)：精度的“保鮮劑”定期校準(zhǔn)：每3個(gè)月用“稱重法”校準(zhǔn)（吸取去離子水，稱重后計(jì)算體積，與設(shè)定值比對）；關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)前（如qPCR、ELISA）需臨時(shí)校準(zhǔn)。清潔與潤滑：液體倒吸后，立即拆開移液器清潔（避免腐蝕內(nèi)部結(jié)構(gòu)）；活塞、O型圈等關(guān)鍵部位每半年涂抹專用潤滑劑，防止卡頓。三、細(xì)胞培養(yǎng)：活細(xì)胞操作的關(guān)鍵細(xì)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的“活材料庫”，操作細(xì)節(jié)決定細(xì)胞活力與實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。（一）細(xì)胞復(fù)蘇：從凍存到復(fù)蘇的“安全過渡”凍存管處理：液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水浴快速晃動（避免局部過熱損傷細(xì)胞），待凍存液完全融化（約1~2分鐘）后，用75%乙醇擦拭管外，轉(zhuǎn)入超凈臺。離心與重懸：1000rpm離心5分鐘，棄去含DMSO的凍存液（DMSO對細(xì)胞有毒性，需徹底去除）；用預(yù)熱的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種密度控制在1×10?~5×10?cells/mL（密度過低生長緩慢，過高易缺氧）。（二）傳代操作：維持細(xì)胞活力的“平衡術(shù)”消化時(shí)間控制：胰酶消化貼壁細(xì)胞時(shí)，鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)（間隙增大、細(xì)胞變圓時(shí)）立即加含血清培養(yǎng)基終止消化（消化過度會損傷細(xì)胞膜，不足則細(xì)胞無法脫落）。吹打技巧：用移液管/槍頭輕柔吹打（避免氣泡損傷細(xì)胞），吹打次數(shù)以細(xì)胞完全分散為度（通常5~10次，過度吹打會導(dǎo)致細(xì)胞破碎）。密度調(diào)整：依細(xì)胞生長速度調(diào)整傳代比例（如HeLa細(xì)胞1:3~1:5傳代，成纖維細(xì)胞1:2~1:3），避免密度過高（營養(yǎng)不足）或過低（生長停滯）。（三）污染防控：識別與處理的“實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)”污染識別：細(xì)菌污染（培養(yǎng)基渾濁，鏡下見短桿/球狀細(xì)菌）；真菌污染（培養(yǎng)基出現(xiàn)菌絲/斑點(diǎn)）；支原體污染（鏡下無明顯微生物，但細(xì)胞生長緩慢、形態(tài)異常）。處理措施：污染細(xì)胞立即隔離，丟棄污染試劑；重要細(xì)胞可嘗試抗生素處理（細(xì)菌用青霉素-鏈霉素，支原體用清除試劑），但效果有限，優(yōu)先復(fù)蘇凍存細(xì)胞。四、顯微鏡操作：微觀世界的清晰呈現(xiàn)顯微鏡是觀察細(xì)胞、組織形態(tài)的“眼睛”，操作技巧決定圖像質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)結(jié)論。（一）光鏡：調(diào)焦與成像的“優(yōu)化邏輯”物鏡選擇：先低倍鏡（4×/10×）找樣本，再轉(zhuǎn)高倍鏡（40×/100×油鏡），避免直接高倍鏡壓片（損傷樣本與物鏡）。調(diào)焦技巧：粗準(zhǔn)焦螺旋找模糊像后，換細(xì)準(zhǔn)焦螺旋微調(diào)；油鏡使用時(shí)滴香柏油，用完立即用擦鏡紙蘸二甲苯擦拭（殘留油會腐蝕物鏡）。光源調(diào)節(jié)：依樣本厚度、染色情況調(diào)整亮度與光圈（過亮丟失細(xì)節(jié)，過暗影響觀察），可通過“漸變法”調(diào)節(jié)（從暗到亮，找到最佳對比度）。（二）熒光顯微鏡：避光與成像的“特殊要求”樣本避光：熒光染料易淬滅，需暗環(huán)境操作，觀察時(shí)縮短光照時(shí)間（可多次拍攝選最佳圖像），用抗淬滅封片劑延長熒光壽命。濾光片匹配：不同熒光染料對應(yīng)特定激發(fā)/發(fā)射波長（如GFP用488nm激發(fā)、520nm發(fā)射濾光片），需正確匹配（錯用會導(dǎo)致信號丟失或背景過高）。圖像采集：設(shè)置合適曝光時(shí)間與增益（過曝使信號飽和，欠曝增加背景噪聲），可通過“梯度曝光法”確定最佳參數(shù)（如從100ms到1000ms依次拍攝，選細(xì)節(jié)清晰、背景低的圖像）。五、溶液配制與濃度計(jì)算：實(shí)驗(yàn)的化學(xué)基礎(chǔ)溶液是實(shí)驗(yàn)的“化學(xué)語言”，濃度誤差會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)邏輯鏈斷裂。（一）母液配制：精準(zhǔn)與穩(wěn)定的“雙重保障”溶質(zhì)稱量：分析天平（精度0.1mg/0.01mg）稱量，易潮解試劑（如NaOH）用稱量瓶快速操作，密封保存（潮解會導(dǎo)致稱量誤差）。溶解技巧：難溶物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多糖）可加熱（≤60℃，依穩(wěn)定性調(diào)整）或超聲溶解，溶解后冷卻至室溫再定容（溫度變化會影響體積）。pH調(diào)節(jié)：pH計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測，滴加酸堿時(shí)緩慢攪拌（避免局部過酸/過堿），調(diào)節(jié)后再次核對pH（攪拌后pH會輕微變化）。（二）工作液稀釋：倍數(shù)與精度的“平衡術(shù)”稀釋計(jì)算：用C?V?=C?V?公式（體積單位一致，如μL、mL），高倍稀釋分多次（如1:1000稀釋，先1:100再1:10），減少誤差。移液驗(yàn)證：關(guān)鍵溶液（如酶反應(yīng)液）用紫外分光光度法/滴定法驗(yàn)證濃度，確保與理論值偏差≤5%。（三）緩沖液保存：穩(wěn)定與無菌的“雙要求”無菌過濾：細(xì)胞培養(yǎng)用緩沖液（如PBS）經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，分裝后4℃保存（避免反復(fù)凍融導(dǎo)致成分降解）。成分穩(wěn)定：含酶/抗體的溶液加穩(wěn)定劑（如BSA、甘油），-20℃/-80℃保存，使用前緩慢復(fù)溫（劇烈振蕩會導(dǎo)致蛋白變性）。六、動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)：倫理與操作的平衡動物實(shí)驗(yàn)是醫(yī)學(xué)研究的“活體模型”，需兼顧操作規(guī)范與動物倫理。（一）動物抓取與保定：安全與溫和的“平衡”小鼠抓?。河沂痔崾笪?，放于粗糙平面（如鼠籠蓋），待小鼠爬行時(shí)，左手拇指、食指捏頸部皮膚，無名指、小指夾尾部，使腹部朝上（避免用力過大窒息）。大鼠保定：戴厚手套，抓尾巴后，另一只手從背部向前抓頸部皮膚，固定四肢（大鼠力氣大，需避免被咬傷）。（二）注射操作：精準(zhǔn)與無痛的“技巧”腹腔注射：小鼠腹部朝上，下腹中線偏左/右（避開膀胱），針頭45°刺入，回抽無血后注射（避免刺入腸道/肝臟）。皮下注射：提起背部皮膚形成褶皺，針頭水平刺入褶皺下，緩慢推注（如免疫接種，每只小鼠≤0.2mL，避免局部腫脹）。尾靜脈注射：小鼠固定于注射架，75%乙醇擦尾部（擴(kuò)張血管），從尾尖向根部，選最粗靜脈（兩側(cè)），針頭15°刺入，推注無阻力即成功（失敗會導(dǎo)致尾部腫脹，需換部位）。（三）采血與安樂死：合規(guī)與人性的“底線”眼眶采血：毛細(xì)玻璃管從內(nèi)眥刺入眼眶后靜脈叢，采血后棉球壓迫止血，每只小鼠≤總血量10%（約0.15mL，避免休克）。安樂死：符合動物倫理（如小鼠頸椎脫臼、大鼠CO?窒息、過量麻醉劑注射），操作快速無痛苦（避免動物掙扎，減少實(shí)驗(yàn)誤差）。七、病理切片制作與染色：組織形態(tài)的精準(zhǔn)呈現(xiàn)病理切片是疾病機(jī)制研究的“形態(tài)學(xué)證據(jù)”，操作細(xì)節(jié)決定診斷價(jià)值。（一）組織固定與脫水：形態(tài)與結(jié)構(gòu)的“保鮮”固定液選擇：甲醛（4%多聚甲醛）用于形態(tài)學(xué)，戊二醛用于電鏡；組織厚度≤5mm，固定24~48小時(shí)（過厚固定不均，過久組織硬化）。脫水梯度：70%→80%→90%→95%→100%乙醇，每級1~2小時(shí)（避免組織收縮/硬化，影響切片質(zhì)量）。（二）包埋與切片：方位與厚度的“控制”石蠟包埋：脫水后組織浸入56~58℃石蠟，包埋時(shí)確保組織方位正確（如皮膚組織表皮朝上），蠟塊冷卻后修塊（去除多余石蠟，便于切片）。切片技巧：切片機(jī)設(shè)厚度3~5μm，蠟塊與刀片平行，毛筆輕挑切片入40℃水浴展平（避免褶皺），貼于載玻片（防脫片處理的玻片更牢固）。（三）HE染色：對比與清晰的“藝術(shù)”脫蠟水化：二甲苯脫蠟（2次×10分鐘），100%→95%→90%→80%→70%乙醇水化，最后入蒸餾水（脫蠟不全會導(dǎo)致染色不均）。染色時(shí)間：蘇木精5~10分鐘（依組織調(diào)整），流水沖洗分化；伊紅1~2分鐘，脫水透明（二甲苯），中性樹膠封片（封片時(shí)避免氣泡）。分化技巧：蘇木精后用1%鹽酸乙醇分化（