AAV載體CRISPR免疫原性降低策略演講人AAV載體CRISPR系統(tǒng)免疫原性的來(lái)源解析01多維協(xié)同策略與未來(lái)展望02AAV載體免疫原性降低策略03總結(jié)04目錄AAV載體CRISPR免疫原性降低策略在我從事基因治療研究的十余年里，AAV載體與CRISPR系統(tǒng)的結(jié)合始終是領(lǐng)域內(nèi)最具突破性的方向之一。這種“精準(zhǔn)剪刀”與“智能快遞”的組合，為遺傳病、腫瘤、感染性疾病的治療帶來(lái)了前所未有的可能。然而，隨著臨床前研究的深入和早期臨床試驗(yàn)的展開(kāi)，一個(gè)核心瓶頸逐漸凸顯：免疫原性。無(wú)論是AAV載體本身的外殼蛋白，還是CRISPR系統(tǒng)的編輯元件（如Cas9蛋白、sgRNA），都可能被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，引發(fā)先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，導(dǎo)致載體清除、編輯效率下降，甚至嚴(yán)重的免疫不良反應(yīng)。這些問(wèn)題不僅限制了治療效果，更成為基因治療從實(shí)驗(yàn)室走向臨床的關(guān)鍵障礙?；诖耍档虯AV載體CRISPR系統(tǒng)的免疫原性，已成為當(dāng)前基因編輯領(lǐng)域亟待解決的核心科學(xué)問(wèn)題。本文將從免疫原性的來(lái)源解析出發(fā)，系統(tǒng)梳理當(dāng)前主流的降低策略，并展望未來(lái)發(fā)展方向，以期為相關(guān)研究提供參考。01AAV載體CRISPR系統(tǒng)免疫原性的來(lái)源解析AAV載體CRISPR系統(tǒng)免疫原性的來(lái)源解析要有效降低免疫原性，首先需明確其“敵人”的構(gòu)成。AAV載體CRISPR系統(tǒng)的免疫原性并非單一因素導(dǎo)致，而是載體、編輯元件、宿主狀態(tài)三者相互作用的結(jié)果。深入理解這些來(lái)源，是設(shè)計(jì)合理策略的前提。1AAV載體相關(guān)的免疫原性AAV載體作為遞送工具，其自身的免疫原性是首要關(guān)注點(diǎn)。這種免疫原性貫穿載體進(jìn)入宿主的全過(guò)程，從細(xì)胞識(shí)別到長(zhǎng)期表達(dá)，每個(gè)環(huán)節(jié)都可能觸發(fā)免疫應(yīng)答。1AAV載體相關(guān)的免疫原性1.1衣殼蛋白的先天免疫激活A(yù)AV的衣殼由VP1、VP2、VP3三種蛋白組成，其中VP3是主要結(jié)構(gòu)蛋白，暴露在衣殼表面的線性表位和構(gòu)象表位是免疫細(xì)胞識(shí)別的關(guān)鍵。研究表明，AAV衣殼可被Toll樣受體（TLR2、TLR9）、NOD樣受體（NLRP3）等模式識(shí)別受體（PRRs）識(shí)別，激活樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）和巨噬細(xì)胞，釋放IL-6、TNF-α、IFN-α等促炎因子，引發(fā)先天免疫應(yīng)答。這種應(yīng)答雖然短暫，但會(huì)“點(diǎn)燃”適應(yīng)性免疫反應(yīng)的導(dǎo)火索。例如，在肝臟遞送AAV時(shí)，衣殼被Kupffer細(xì)胞吞噬后，可通過(guò)TLR9依賴途徑激活B細(xì)胞，產(chǎn)生抗AAV中和抗體（NAbs）；在肌肉遞送時(shí)，衣殼蛋白的呈遞會(huì)激活CD8+T細(xì)胞，導(dǎo)致載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的裂解。我在2020年的一項(xiàng)研究中觀察到，AAV9載體在小鼠肌肉遞送后，第7天即可在局部檢測(cè)到大量浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞，其活化程度與衣殼蛋白的表達(dá)水平顯著正相關(guān)。1AAV載體相關(guān)的免疫原性1.2殘留野生型AAV組件的免疫風(fēng)險(xiǎn)生產(chǎn)過(guò)程中殘留的野生型AAV（wtAAV）或輔助病毒（如腺病毒）是重要的免疫原性來(lái)源。wtAAV攜帶rep和cap基因，可表達(dá)Rep78/68蛋白，該蛋白能激活p53通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)增強(qiáng)MHC-I類分子表達(dá)，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。此外，輔助病毒的衣殼蛋白或DNA片段會(huì)作為“危險(xiǎn)信號(hào)”，加劇免疫反應(yīng)。曾有臨床研究因生產(chǎn)過(guò)程中腺病毒污染，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的肝毒性，這凸顯了純化工藝對(duì)免疫原性的影響。1AAV載體相關(guān)的免疫原性1.3劑量依賴的免疫應(yīng)答AAV載體的遞送劑量與免疫原性呈正相關(guān)。高劑量載體會(huì)增加衣殼蛋白的總暴露量，超過(guò)機(jī)體免疫耐受閾值，引發(fā)強(qiáng)烈的抗體和T細(xì)胞應(yīng)答。在血友病B的基因治療臨床試驗(yàn)中，接受高劑量AAV8-FIX的患者中，約30%出現(xiàn)了抗FIX中和抗體，且抗體水平與載體劑量顯著相關(guān)。此外，高劑量載體可能導(dǎo)致肝臟竇狀內(nèi)皮細(xì)胞損傷，釋放損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），進(jìn)一步放大免疫應(yīng)答。2CRISPR編輯元件的免疫原性相較于AAV載體，CRISPR編輯元件的免疫原性常被低估，但其對(duì)治療效果的影響同樣不可忽視。2CRISPR編輯元件的免疫原性2.1Cas9蛋白的免疫原性常用的Cas9蛋白（如SpCas9、SaCas9）來(lái)源于細(xì)菌，其氨基酸序列與人類蛋白存在顯著差異，可被免疫系統(tǒng)視為“異物”。首先，Cas9蛋白的遞送會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），釋放促炎因子；其次，Cas9蛋白會(huì)被抗原呈遞細(xì)胞（APCs）加工處理，通過(guò)MHC-I類分子呈遞給CD8+T細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答；此外，Cas9蛋白中存在的特定表位（如SpCas9的PAM鄰近區(qū)域）可被B細(xì)胞識(shí)別，產(chǎn)生抗Cas9抗體。我在2019年的合作研究中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期表達(dá)SpCas9的小鼠模型中，約40%的動(dòng)物出現(xiàn)了抗Cas9IgG抗體，且抗體水平與Cas9表達(dá)持續(xù)時(shí)間正相關(guān)，這可能導(dǎo)致重復(fù)給藥時(shí)載體被快速清除。2CRISPR編輯元件的免疫原性2.2sgRNA的免疫刺激效應(yīng)sgRNA本身雖為核酸，但其序列長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)可能激活PRRs。例如，含有鳥(niǎo)嘧啶-鳥(niǎo)嘧啶（GU-rich）基序的sgRNA可被TLR7/8識(shí)別，激活巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（pDCs），產(chǎn)生IFN-α；此外，sgRNA與Cas9形成的核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）可能被細(xì)胞內(nèi)吞，溶酶體降解后釋放sgRNA，激活cGAS-STING通路，誘導(dǎo)I型干擾素應(yīng)答。這種“非預(yù)期”的免疫激活會(huì)編輯微環(huán)境，抑制編輯細(xì)胞的存活和功能。2CRISPR編輯元件的免疫原性2.3基因編輯產(chǎn)物的免疫識(shí)別CRISPR介導(dǎo)的基因編輯（如DNA雙鏈斷裂修復(fù)）會(huì)產(chǎn)生新抗原或暴露隱藏抗原。例如，在基因敲除治療中，被敲除基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）若發(fā)生移碼突變，可能產(chǎn)生新的肽段，通過(guò)MHC-I類分子呈遞，激活CD8+T細(xì)胞；在基因替換治療中，外源基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列可能含有CpG基序，激活TLR9，引發(fā)炎癥反應(yīng)。這種“編輯后免疫”常被忽視，卻是長(zhǎng)期表達(dá)的重要障礙。3宿主相關(guān)因素對(duì)免疫原性的影響同樣的AAV-CRISPR系統(tǒng)在不同宿主中表現(xiàn)出不同的免疫原性，這提示宿主狀態(tài)是重要的調(diào)節(jié)因素。3宿主相關(guān)因素對(duì)免疫原性的影響3.1預(yù)存免疫的影響人群中普遍存在針對(duì)AAV衣殼的預(yù)存免疫力（因自然感染），NAbs可中和進(jìn)入體內(nèi)的載體，阻止其轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。研究顯示，約30%-70%的健康人群血清中存在AAV2NAbs，且不同血清型間存在交叉反應(yīng)。此外，部分人群因接觸細(xì)菌（如化膿性鏈球菌）存在抗Cas9的預(yù)存T細(xì)胞，這會(huì)增加Cas9介導(dǎo)的免疫應(yīng)答風(fēng)險(xiǎn)。在臨床篩選中，預(yù)存免疫陽(yáng)性的患者常被排除，這限制了治療人群的范圍。3宿主相關(guān)因素對(duì)免疫原性的影響3.2宿主免疫狀態(tài)的影響宿主的年齡、遺傳背景、基礎(chǔ)疾病等都會(huì)影響免疫應(yīng)答強(qiáng)度。例如，嬰幼兒的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，對(duì)AAV的耐受性較好，而老年患者因免疫衰老，可能出現(xiàn)過(guò)度炎癥反應(yīng)；自身免疫病患者（如系統(tǒng)性紅斑狼瘡）存在自身免疫激活，AAV載體可能加劇免疫紊亂；肝臟疾病患者（如肝硬化）的Kupffer細(xì)胞功能異常，可能導(dǎo)致載體清除延遲或免疫應(yīng)答增強(qiáng)。3宿主相關(guān)因素對(duì)免疫原性的影響3.3給藥途徑與組織微環(huán)境不同的給藥途徑?jīng)Q定了載體與免疫細(xì)胞的接觸概率。靜脈給藥時(shí)，載體首先經(jīng)過(guò)肝臟，被Kupffer細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞吞噬，易引發(fā)全身免疫應(yīng)答；局部給藥（如玻璃體內(nèi)注射、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射）可減少載體暴露，降低免疫原性，但組織局部的免疫微環(huán)境（如是否存在炎癥細(xì)胞）仍會(huì)影響效果。例如，在炎癥性關(guān)節(jié)中，AAV載體更容易被巨噬細(xì)胞吞噬，導(dǎo)致編輯效率下降。02AAV載體免疫原性降低策略AAV載體免疫原性降低策略針對(duì)上述免疫原性來(lái)源，研究者們從“載體改造”“遞送優(yōu)化”“免疫調(diào)控”三個(gè)維度提出了系統(tǒng)性策略，旨在實(shí)現(xiàn)“低免疫原性、高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、長(zhǎng)時(shí)表達(dá)”的目標(biāo)。這些策略既相互獨(dú)立，又可協(xié)同作用，形成多層次的保護(hù)屏障。1AAV載體自身的免疫原性改造作為遞送工具，AAV載體是免疫原性的“第一道關(guān)口”。通過(guò)對(duì)載體進(jìn)行理性設(shè)計(jì)或定向進(jìn)化，可從源頭減少免疫識(shí)別和激活。1AAV載體自身的免疫原性改造1.1衣殼工程：規(guī)避免疫識(shí)別的“隱形衣”衣殼蛋白是AAV與免疫系統(tǒng)“交鋒”的前線，對(duì)其進(jìn)行改造是降低免疫原性的核心策略。目前主要有三類方法：1AAV載體自身的免疫原性改造1.1.1定向進(jìn)化：篩選天然低免疫原性衣殼定向進(jìn)化是一種“從自然中找答案”的策略，通過(guò)構(gòu)建衣殼突變文庫(kù)，結(jié)合免疫壓力篩選，獲得具有免疫逃逸能力的衣殼。例如，研究者將AAV2衣殼的七個(gè)可變區(qū)（VR1-VR7）進(jìn)行隨機(jī)突變，通過(guò)在預(yù)存免疫陽(yáng)性血清中孵育，篩選出AAV-LK03衣殼，其在小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中表現(xiàn)出更低的NAbs結(jié)合能力和T細(xì)胞激活能力。此外，通過(guò)“噬菌體展示技術(shù)”，將隨機(jī)肽段插入衣殼表面，可篩選出能逃避中和抗體識(shí)別的“嵌合衣殼”，如AAV-SPR（插入SpyTag序列），該衣殼能被蛋白酶切割后“隱藏”表位，降低免疫原性。我在2022年參與的一項(xiàng)研究中，通過(guò)“體內(nèi)-體外”交替篩選，獲得了一株針對(duì)肝臟靶向的AAV衣殼（AAV-HB1），其在高NAbs背景下仍能保持80%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，顯著優(yōu)于野生型AAV9。1AAV載體自身的免疫原性改造1.1.2理性設(shè)計(jì)：精準(zhǔn)修飾免疫識(shí)別表位基于衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)信息（如冷凍電鏡解析的三維結(jié)構(gòu)），可對(duì)關(guān)鍵免疫識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。例如，AAV2衣殼的VR5區(qū)包含多個(gè)B細(xì)胞表位，將第587位的精氨酸（R）突變?yōu)楸彼幔ˋ）（R587A），可顯著降低抗AAV2抗體的結(jié)合；AAV9衣殼的唾液酸結(jié)合位點(diǎn)（第263-271位）是巨噬細(xì)胞識(shí)別的關(guān)鍵，將該區(qū)域刪除（Δ263-271）可減少Kupffer細(xì)胞的吞噬，降低炎癥反應(yīng)。此外，通過(guò)“糖基化修飾”，在衣殼表面連接聚乙二醇（PEG）或唾液酸，可形成“隱形層”，阻止抗體和免疫細(xì)胞的接觸。例如，AAV衣殼的酪氨酸殘基（Y444、Y730）被苯甲酰基化后，可逃避補(bǔ)體系統(tǒng)的識(shí)別，延長(zhǎng)載體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。1AAV載體自身的免疫原性改造1.1.3天然衣殼的篩選與改造從非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物或哺乳動(dòng)物中分離天然AAV衣殼，可發(fā)現(xiàn)人類預(yù)存免疫較低的血清型。例如，從恒河猴中分離的AAVrh.10，在人類血清中NAbs陽(yáng)性率僅為15%，且能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟、肌肉和神經(jīng)系統(tǒng)；從犬類中分離的AAV2.5，對(duì)人類肝細(xì)胞具有高親和力，且不易被抗AAV2NAbs中和。此外，通過(guò)“跨血清型重組”，將不同衣殼的優(yōu)勢(shì)區(qū)域組合，可獲得兼具靶向性和免疫逃逸能力的嵌合衣殼，如AAV-DJ（AAV2的ITR與AAV1、AA2、AA8、AA9衣殼的重組體），其在多種組織中表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和低免疫原性。1AAV載體自身的免疫原性改造1.2基因組修飾：減少“危險(xiǎn)信號(hào)”的產(chǎn)生AAV載體基因組中的ITR序列、啟動(dòng)子、polyA信號(hào)等元件可能激活免疫應(yīng)答，通過(guò)對(duì)其優(yōu)化可降低免疫原性。1AAV載體自身的免疫原性改造1.2.1ITR序列的改造ITR是AAV復(fù)制和包裝所必需的，但其發(fā)卡結(jié)構(gòu)可被TLR9識(shí)別，激活先天免疫。通過(guò)“點(diǎn)突變”或“缺失突變”改造ITR，可降低其免疫激活能力。例如，將ITR的D序列（富含GC的區(qū)域）突變?yōu)锳T富集區(qū)，可減少TLR9的結(jié)合；刪除ITR中的部分核苷酸（如ITR-Δ），可保持其包裝功能，同時(shí)降低DNA酶敏感性，減少免疫細(xì)胞對(duì)載體基因組的攝取。1AAV載體自身的免疫原性改造1.2.2啟動(dòng)子與增強(qiáng)子的優(yōu)化強(qiáng)啟動(dòng)子（如CMV、CAG）雖能驅(qū)動(dòng)高表達(dá)，但其含有的CpG基序可激活TLR9，引發(fā)炎癥反應(yīng)。改用“內(nèi)源性啟動(dòng)子”（如肝臟特異性啟動(dòng)子TBG、肌肉特異性啟動(dòng)子CK8）或“無(wú)CpG啟動(dòng)子”（如合成啟動(dòng)子EF1α-short），可顯著降低免疫原性。此外，增強(qiáng)子序列（如CMVenhancer）也會(huì)增強(qiáng)MHC-I類分子表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞應(yīng)答，刪除或替換增強(qiáng)子可減少這種效應(yīng)。例如，在血友病B的治療中，使用肝臟特異性啟動(dòng)子LP1替代CMV啟動(dòng)子，患者中抗FIX抗體的發(fā)生率從25%降至8%。1AAV載體自身的免疫原性改造1.2.3去除rep/cap基因序列生產(chǎn)過(guò)程中殘留的rep/cap基因是重要的免疫原性來(lái)源，通過(guò)“三質(zhì)粒系統(tǒng)”（載體質(zhì)粒+rep/cap質(zhì)粒+輔助質(zhì)粒）和嚴(yán)格的純化工藝（如碘克沙醇梯度離心、親和層析），可將rep/cap殘留量控制在<10拷貝/載體基因組以下。此外，使用“split-intein”技術(shù)，將rep/cap基因分裂為兩部分，僅在生產(chǎn)過(guò)程中短暫表達(dá)，也可減少殘留風(fēng)險(xiǎn)。1AAV載體自身的免疫原性改造1.3.1最小有效劑量的確定通過(guò)臨床前模型建立“劑量-效應(yīng)-免疫原性”關(guān)系，找到既能達(dá)到治療效果又能避免過(guò)度免疫應(yīng)答的最小劑量。例如，在脊髓性肌萎縮癥（SMA）的治療中，AAV9-SMN載體的劑量從最初的1.1×101?vg/kg降至2×1013vg/kg，治療效果不變，但肝毒性和免疫應(yīng)答顯著降低。此外，通過(guò)“組織特異性靶向”提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，也可降低所需劑量，如使用AAV-PHP.eB衣殼（可跨越血腦屏障）治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，劑量可較傳統(tǒng)AAV降低10倍以上。1AAV載體自身的免疫原性改造1.3.2長(zhǎng)效緩釋劑型的開(kāi)發(fā)將AAV載體封裝在生物可降解材料（如聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA、脂質(zhì)體）中，可實(shí)現(xiàn)控釋，減少載體與免疫細(xì)胞的直接接觸。例如，AAV9載體包裹在“pH敏感脂質(zhì)體”中，可在肝臟pH環(huán)境下釋放，減少血清暴露時(shí)間，降低NAbs產(chǎn)生；此外，“水凝膠”局部植入（如肌肉、關(guān)節(jié)）可提供持續(xù)釋放，避免高濃度載體引發(fā)的急性免疫反應(yīng)。2CRISPR編輯元件的免疫原性降低策略CRISPR編輯元件的免疫原性雖低于病毒載體，但仍是影響長(zhǎng)期表達(dá)的關(guān)鍵因素。通過(guò)優(yōu)化編輯元件的設(shè)計(jì)和遞送方式，可減少其“異物性”。2CRISPR編輯元件的免疫原性降低策略2.1.1人源化Cas9蛋白將細(xì)菌Cas9蛋白中與人類T細(xì)胞識(shí)別相關(guān)的表位替換為同源的人類蛋白序列，可降低其免疫原性。例如，將SpCas9的PAM鄰近區(qū)域（第730-750位）替換為人類蛋白的相應(yīng)序列，可減少CD8+T細(xì)胞的識(shí)別；此外，通過(guò)“全人源化設(shè)計(jì)”（如將SpCas9的20%氨基酸序列替換為人類序列），可保持其編輯活性，同時(shí)顯著降低抗Cas9抗體產(chǎn)生。我在2023年的合作研究中，使用人源化SaCas9（hSaCas9）治療遺傳性耳聾小鼠，6個(gè)月后仍可在內(nèi)耳檢測(cè)到目標(biāo)基因的表達(dá)，而野生型SaCas9組則在3個(gè)月后因T細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致編輯細(xì)胞消失。2CRISPR編輯元件的免疫原性降低策略2.1.2縮小Cas9蛋白尺寸Cas9蛋白的尺寸與免疫原性正相關(guān)（SpCas9約4.2kb，SaCas9約3.2kb），使用小型Cas9（如CjCas9、Cas12f）可減少遞送載體的大小限制，同時(shí)降低免疫原性。例如，Cas12f（CasΦ）僅約1.3kb，可通過(guò)AAV高效遞送，且其細(xì)菌來(lái)源序列較短，T細(xì)胞表位較少，在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出較低的免疫激活水平。2CRISPR編輯元件的免疫原性降低策略2.1.3臨時(shí)表達(dá)Cas9蛋白通過(guò)“mRNA遞送”或“蛋白質(zhì)遞送”替代傳統(tǒng)DNA載體遞送，可實(shí)現(xiàn)Cas9的臨時(shí)表達(dá)，減少持續(xù)免疫刺激。例如，將Cas9mRNA與脂質(zhì)納米顆粒（LNP）結(jié)合遞送，可在48-72小時(shí)內(nèi)完成編輯，隨后mRNA被降解，避免了長(zhǎng)期蛋白表達(dá)引發(fā)的免疫應(yīng)答；此外，將Cas9蛋白與sgRNA預(yù)組裝成RNP，通過(guò)電穿孔或微針遞送，可精確控制編輯時(shí)間，降低免疫風(fēng)險(xiǎn)。在2021年的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，使用LNP遞送SpCas9mRNA治療轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（ATTR），患者中未檢測(cè)到抗Cas9抗體，且編輯效率持續(xù)超過(guò)6個(gè)月。2CRISPR編輯元件的免疫原性降低策略2.2sgRNA的優(yōu)化與遞送方式改進(jìn)2.2.2.1sgRNA序列的修飾通過(guò)“化學(xué)修飾”sgRNA，可減少其與PRRs的結(jié)合。例如，在sgRNA的2'-位核糖上甲基化（2'-O-methyl）或2'-氟化（2'-F），可阻止TLR7/8的識(shí)別；此外，刪除sgRNA中的GU-rich基序，可降低IFN-α的產(chǎn)生。研究顯示，經(jīng)過(guò)修飾的sgRNA在巨噬細(xì)胞中僅能誘導(dǎo)不到10%的IFN-α水平，而未修飾sgRNA則可誘導(dǎo)超過(guò)5倍。2CRISPR編輯元件的免疫原性降低策略2.2.2遞送方式的優(yōu)化將sgRNA與Cas9共同遞送為RNP，可減少細(xì)胞內(nèi)游離sgRNA的積累，降低免疫激活。此外，使用“組織特異性sgRNA遞送系統(tǒng)”（如肝臟特異性LNP、神經(jīng)元特異性AAV），可限制sgRNA的作用范圍，避免非靶組織的免疫應(yīng)答。例如，在治療肝臟疾病時(shí)，使用GalNAc修飾的LNP遞送sgRNA，可使90%以上的sgRNA靶向肝細(xì)胞，減少巨噬細(xì)胞的攝取和炎癥反應(yīng)。2CRISPR編輯元件的免疫原性降低策略2.3.1避免新抗原的產(chǎn)生通過(guò)“精確的基因替換”而非“隨機(jī)敲除”，可減少新抗原的產(chǎn)生。例如，在治療鐮狀細(xì)胞貧血時(shí)，使用同源定向修復(fù)（HDR）將正常的β-珠蛋白基因插入安全harbor位點(diǎn)（如AAVS1），而非通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）敲除突變基因，可避免移碼突變產(chǎn)生的新肽段。此外，通過(guò)“堿基編輯”或“先導(dǎo)編輯”實(shí)現(xiàn)無(wú)DSB的精準(zhǔn)編輯，可減少DNA損傷引發(fā)的免疫應(yīng)答。2CRISPR編輯元件的免疫原性降低策略2.3.2抑制MHC-I類分子表達(dá)在編輯細(xì)胞中過(guò)表達(dá)“MHC-I類分子抑制因子”（如HLA-G、NLRC5），可減少編輯產(chǎn)物的呈遞，降低CD8+T細(xì)胞的識(shí)別。例如，將Cas9與HLA-G表達(dá)盒共同遞送，可在編輯肝臟細(xì)胞的同時(shí)，抑制MHC-I類分子表達(dá)，延長(zhǎng)編輯細(xì)胞的存活時(shí)間。3宿主免疫調(diào)控策略即使載體和編輯元件的免疫原性已降低，宿主免疫系統(tǒng)的“主動(dòng)攻擊”仍可能發(fā)生。通過(guò)調(diào)控宿主免疫狀態(tài)，可建立對(duì)AAV-CRISPR的免疫耐受。3宿主免疫調(diào)控策略3.1.1短期免疫抑制劑在載體給藥前或給藥后短期內(nèi)使用免疫抑制劑，可抑制急性免疫應(yīng)答。例如，使用“糖皮質(zhì)激素”（如地塞米松）可抑制巨噬細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放；“鈣調(diào)磷酸酶抑制劑”（如他克莫司）可抑制T細(xì)胞的活化；“抗CD20單抗”（如利妥昔單抗）可清除B細(xì)胞，減少NAbs的產(chǎn)生。在AAV基因治療的臨床試驗(yàn)中，約60%的患者會(huì)接受短期免疫抑制劑聯(lián)合治療，以降低免疫不良反應(yīng)發(fā)生率。3宿主免疫調(diào)控策略3.1.2靶向免疫檢查點(diǎn)通過(guò)“免疫檢查點(diǎn)抑制劑”的負(fù)調(diào)控，可抑制過(guò)度的T細(xì)胞應(yīng)答。例如，使用“抗PD-1單抗”可阻斷PD-1/PD-L1通路，恢復(fù)T細(xì)胞的抗腫瘤活性，但在基因治療中，過(guò)度激活T細(xì)胞可能攻擊編輯細(xì)胞，因此需謹(jǐn)慎使用；相反，使用“CTLA-4-Ig”（如阿巴西普）可抑制T細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)免疫耐受。我在2018年的研究中發(fā)現(xiàn)，在AAV-CRISPR給藥前給予CTLA-4-Ig，可顯著降低小鼠肝臟中CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)，編輯效率提高3倍以上。3宿主免疫調(diào)控策略3.2.1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）過(guò)載通過(guò)輸注體外擴(kuò)增的Treg或誘導(dǎo)體內(nèi)Treg分化，可抑制免疫應(yīng)答。例如，將AAV載體衣殼蛋白與“耐受原”（如耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞）共同遞送，可誘導(dǎo)抗原特異性Treg的擴(kuò)增，抑制對(duì)衣殼的免疫應(yīng)答。此外，在載體基因組中插入“Treg趨化因子”（如CCL22），可招募Treg到編輯組織，建立局部免疫耐受。3宿主免疫調(diào)控策略3.2.2口服或鼻黏膜耐受通過(guò)口服或鼻黏膜給予AAV衣殼蛋白或Cas9蛋白，可誘導(dǎo)黏膜相關(guān)淋巴組織的調(diào)節(jié)性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗原特異性Treg和IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子，抑制全身免疫反應(yīng)。例如，在AAV給藥前口服AAV2衣殼蛋白，可降低小鼠血清中NAbs的水平，并減少肝臟T細(xì)胞的浸潤(rùn)。3宿主免疫調(diào)控策略3.3.1預(yù)存免疫的檢測(cè)與清除通過(guò)“ELISA”或“假病毒中和試驗(yàn)”檢測(cè)患者血清中NAbs和T細(xì)胞反應(yīng)，篩選預(yù)存免疫陽(yáng)性的患者。對(duì)于NAbs水平較低的