實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范1范圍本規(guī)范適用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析儀（以下簡(jiǎn)稱qPCR儀）的校準(zhǔn)。其他基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理，通過實(shí)時(shí)熒光信號(hào)采集實(shí)現(xiàn)靶核酸片段定量或定性分析的裝置，可參照本規(guī)范執(zhí)行。2引用文件下列文件對(duì)于本規(guī)范的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本規(guī)范。JJF1071-2010國(guó)家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范編寫規(guī)則JJF1001-2011通用計(jì)量術(shù)語(yǔ)及定義JJF1059.1-2012測(cè)量不確定度評(píng)定與表示JJF1527-2015聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范YY/T1173-2010聚合酶鏈反應(yīng)分析儀GB/T42753-2022實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀性能評(píng)價(jià)通則3術(shù)語(yǔ)和定義JJF1001-2011、JJF1527-2015、YY/T1173-2010及GB/T42753-2022界定的術(shù)語(yǔ)和定義適用于本規(guī)范。此外，補(bǔ)充下列術(shù)語(yǔ)和定義：3.1溫度示值誤差：溫度控制模塊（如均熱塊）的設(shè)定值與所有采樣孔實(shí)際溫度平均值之差。3.2溫度均勻度：儀器恒溫階段中，各孔位之間的溫度一致性。3.3溫度波動(dòng)度：儀器恒溫階段中，孔位的溫度變化幅度。3.4熒光強(qiáng)度精密度：對(duì)多個(gè)檢測(cè)孔在同一熒光條件下重復(fù)熒光強(qiáng)度檢測(cè)，其檢測(cè)值的一致性。3.5閾值循環(huán)數(shù)精密度：均熱塊不同測(cè)量孔在同一熒光條件下，閾值循環(huán)數(shù)重復(fù)測(cè)量的一致性。3.6熔解溫度漂移：根據(jù)熔解曲線計(jì)算的熔解溫度值與光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器熔解溫度設(shè)定值之差。4計(jì)量特性4.1溫度相關(guān)特性4.1.1溫度示值誤差：在30℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃等典型溫度點(diǎn)，允許誤差為±0.5℃。4.1.2溫度均勻度：≤1.0℃。4.1.3溫度波動(dòng)度：≤±0.2℃。4.1.4溫度最大過沖量：≤3.0℃。4.1.5平均升溫速率：50℃→90℃區(qū)間，≥1.5℃/s。4.2熒光檢測(cè)相關(guān)特性4.2.1熒光強(qiáng)度精密度：變異系數(shù)（CV）≤5%。4.2.2閾值循環(huán)數(shù)精密度：CV≤2%。4.2.3熔解溫度漂移：±0.5℃。4.2.4線性靈敏系數(shù)（LSF）：0.80~1.20。4.2.5熔解溫度比（RTm）：0.80~1.20。4.3定量分析特性樣本示值誤差：測(cè)得的DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度對(duì)數(shù)值與標(biāo)稱濃度對(duì)數(shù)值的誤差≤±0.3。5校準(zhǔn)條件5.1環(huán)境條件5.1.1環(huán)境溫度：15℃~30℃，且溫度變化≤2℃/h。5.1.2相對(duì)濕度：45%~75%。5.1.3供電電源：電壓220V±10%，頻率50Hz±1Hz，接地電阻≤4Ω。5.1.4環(huán)境要求：無強(qiáng)磁場(chǎng)、強(qiáng)電磁干擾、劇烈振動(dòng)及腐蝕性氣體；遠(yuǎn)離熱源、水源及陽(yáng)光直射。5.2標(biāo)準(zhǔn)器及輔助設(shè)備5.2.1高精度溫度傳感器：精度±0.01℃，測(cè)量范圍0℃~100℃，經(jīng)計(jì)量校準(zhǔn)合格。5.2.2熱成像儀：溫度分辨率≤0.1℃，測(cè)量誤差±0.3℃。5.2.3標(biāo)準(zhǔn)熒光染料：包括FAM、SYBRGreen等常用染料，濃度不確定度≤2%。5.2.4DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：濃度范圍101~10?copies/μL，定值不確定度≤5%，經(jīng)有證認(rèn)可。5.2.5光譜儀：波長(zhǎng)范圍400nm~700nm，波長(zhǎng)精度±1nm。5.2.6空白反應(yīng)板：與儀器適配的無熒光污染PCR反應(yīng)板。6校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法6.1溫度相關(guān)項(xiàng)目校準(zhǔn)6.1.1溫度示值誤差、均勻度及波動(dòng)度校準(zhǔn)6.1.1.1將高精度溫度傳感器插入空白反應(yīng)板的代表性孔位（包括中央孔、邊緣孔，共不少于9個(gè)孔），傳感器探頭與孔底緊密接觸。6.1.1.2儀器分別設(shè)置30℃、60℃、95℃三個(gè)典型溫度點(diǎn)，每個(gè)溫度點(diǎn)升溫至設(shè)定值后，進(jìn)入恒溫階段（恒溫時(shí)間≥10min）。6.1.1.3恒溫階段內(nèi)，每10s記錄一次各孔溫度值，共記錄30組數(shù)據(jù)。6.1.1.4計(jì)算各溫度點(diǎn)的示值誤差（設(shè)定值與各孔平均溫度之差）、均勻度（各孔最高溫度與最低溫度之差）、波動(dòng)度（單孔溫度最大值與最小值之差）。6.1.2溫度最大過沖量校準(zhǔn)按6.1.1.1方法布置傳感器，儀器設(shè)置95℃溫度點(diǎn)，記錄升溫過程中各孔溫度的最大值，計(jì)算最大值與設(shè)定值的差值，即為過沖量，取各孔最大值作為校準(zhǔn)結(jié)果。6.1.3平均升溫速率校準(zhǔn)儀器設(shè)置從50℃升溫至90℃的程序，記錄各孔溫度從55℃上升至85℃的時(shí)間，計(jì)算平均升溫速率（速率=溫度變化量/時(shí)間），取各孔平均值作為校準(zhǔn)結(jié)果。6.2熒光檢測(cè)相關(guān)項(xiàng)目校準(zhǔn)6.2.1熒光強(qiáng)度精密度校準(zhǔn)6.2.1.1向空白反應(yīng)板各孔加入等濃度（100nM）的標(biāo)準(zhǔn)熒光染料溶液（如FAM），每孔加樣量符合儀器要求。6.2.1.2儀器設(shè)置熒光檢測(cè)程序，激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)匹配所選染料（如FAM：激發(fā)488nm，發(fā)射520nm）。6.2.1.3重復(fù)檢測(cè)5次，記錄各孔每次的熒光強(qiáng)度值。6.2.1.4計(jì)算各孔熒光強(qiáng)度的變異系數(shù)，取最大值作為校準(zhǔn)結(jié)果。6.2.2閾值循環(huán)數(shù)精密度校準(zhǔn)6.2.2.1配制梯度濃度（101~10?copies/μL）的DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)PCR反應(yīng)體系，加入空白反應(yīng)板，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。6.2.2.2設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增程序（變性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃30s，共40個(gè)循環(huán)），同時(shí)開啟實(shí)時(shí)熒光采集。6.2.2.3擴(kuò)增結(jié)束后，儀器自動(dòng)計(jì)算各孔Ct值，計(jì)算同濃度組Ct值的變異系數(shù)。6.2.3熔解溫度漂移校準(zhǔn)6.2.3.1向反應(yīng)板加入熒光染料-標(biāo)準(zhǔn)DNA復(fù)合物溶液，設(shè)置熔解曲線程序（95℃10s，然后從60℃升溫至95℃，升溫速率0.5℃/s，全程采集熒光信號(hào)）。6.2.3.2儀器自動(dòng)計(jì)算熔解溫度（Tm值），與標(biāo)準(zhǔn)器設(shè)定的Tm值比較，計(jì)算漂移量。6.3定量分析特性校準(zhǔn)6.3.1采用6.2.2.1中的梯度濃度DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)反應(yīng)體系，完成PCR擴(kuò)增并記錄各孔Ct值。6.3.2以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。6.3.3選取3個(gè)驗(yàn)證濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按相同方法進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)回歸方程計(jì)算測(cè)得濃度對(duì)數(shù)值，與標(biāo)稱濃度對(duì)數(shù)值比較，得到樣本示值誤差。7校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá)校準(zhǔn)完成后，應(yīng)出具校準(zhǔn)證書，證書內(nèi)容應(yīng)符合JJF1071-2010的要求，至少包括以下信息：7.1儀器基本信息：儀器名稱、型號(hào)規(guī)格、出廠編號(hào)、生產(chǎn)廠家、使用單位。7.2校準(zhǔn)依據(jù)：本規(guī)范編號(hào)及名稱。7.3校準(zhǔn)條件：環(huán)境溫度、相對(duì)濕度、標(biāo)準(zhǔn)器信息。7.4校準(zhǔn)結(jié)果：各校準(zhǔn)項(xiàng)目的實(shí)測(cè)值、允許誤差及合格判定。7.5測(cè)量不確定度：給出主要校準(zhǔn)項(xiàng)目的測(cè)量不確定度。7.6校準(zhǔn)日期、復(fù)校時(shí)間間隔及校準(zhǔn)人員、核驗(yàn)人員簽字。8復(fù)校時(shí)間間隔復(fù)校時(shí)間間隔一般為1年。若儀器出現(xiàn)維修（如更換溫控元件、光源、濾光片等）、移動(dòng)或檢測(cè)結(jié)果異常時(shí)，應(yīng)提前進(jìn)行校準(zhǔn)。日常使用中，建議每3~6個(gè)月對(duì)溫度示值誤差、熒光強(qiáng)度精密度進(jìn)行期間核查。9校準(zhǔn)注意事項(xiàng)9.1校準(zhǔn)前，儀器應(yīng)開機(jī)預(yù)熱30min以上，確保運(yùn)行狀態(tài)穩(wěn)定。9.2標(biāo)準(zhǔn)器及輔助設(shè)備應(yīng)經(jīng)計(jì)量校準(zhǔn)合格，且在有效期內(nèi)。9.3校準(zhǔn)過程中，應(yīng)避免觸碰