姜黃素誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(HEC-1-B)凋亡及其機(jī)制的研究一、研究背景子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性的健康。目前，其治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療等，但這些治療方法存在一定的局限性，如手術(shù)創(chuàng)傷大、放化療副作用明顯等。因此，尋找一種高效、低毒的治療方法具有重要意義。姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的一種酚性色素，是姜黃的主要有效成分。近年來，大量研究表明姜黃素具有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，尤其在抗腫瘤方面表現(xiàn)出良好的前景。它能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且毒副作用小，有望成為一種新型的抗腫瘤藥物。本研究旨在探討姜黃素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(HEC-1-B)凋亡的誘導(dǎo)作用及其潛在機(jī)制，為子宮內(nèi)膜癌的治療提供新的思路和理論依據(jù)。二、材料與方法（一）實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(HEC-1-B)購自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。主要試劑：姜黃素（純度≥98%）購自Sigma公司，用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成100mmol/L的儲(chǔ)存液，-20℃保存?zhèn)溆?；MTT試劑、DMSO、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶等均購自Gibco公司；Hoechest33258熒光染料購自Beyotime公司；Survivin抗體、caspase-3抗體、β-actin抗體及相應(yīng)的二抗均購自CellSignalingTechnology公司。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific）、倒置顯微鏡（Olympus）、酶標(biāo)儀（Bio-Tek）、熒光顯微鏡（Leica）、蛋白質(zhì)電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）等。（二）實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：將HEC-1-B細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)分組：將體外培養(yǎng)的HEC-1-B細(xì)胞隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組、姜黃素Ⅰ組（10μmol/L）、姜黃素Ⅱ組（20μmol/L）、姜黃素Ⅲ組（40μmol/L）和姜黃素Ⅳ組（80μmol/L）。MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEC-1-B細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的姜黃素溶液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h和72h后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），37℃孵育4h，棄去上清液，加入150μlDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%。Hoechest33258熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化：將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的姜黃素處理48h和72h。棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛固定15min，再用PBS洗滌3次。加入Hoechest33258熒光染料（1μg/ml），室溫避光孵育10min，PBS洗滌3次后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)變化并拍照。正常細(xì)胞核呈均勻藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)核固縮、核碎裂、熒光強(qiáng)度增強(qiáng)等特征。Westernblot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平：收集經(jīng)不同濃度姜黃素處理48h和72h的HEC-1-B細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入Survivin抗體、caspase-3抗體及β-actin抗體（內(nèi)參），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h，TBST洗滌3次后，采用化學(xué)發(fā)光法顯影，ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值，以反映蛋白表達(dá)水平。（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（一）姜黃素對(duì)HEC-1-B細(xì)胞增殖的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，姜黃素各濃度組細(xì)胞的吸光度值均顯著降低（P＜0.01），且在10-80μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著姜黃素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸升高，呈明顯的時(shí)間-劑量依賴性。表明姜黃素能夠有效抑制HEC-1-B細(xì)胞的體外增殖。（二）姜黃素對(duì)HEC-1-B細(xì)胞凋亡的影響Hoechest33258熒光染色結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核呈均勻藍(lán)色；而姜黃素各濃度組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征，如核固縮、核碎裂、熒光強(qiáng)度增強(qiáng)等，且隨著姜黃素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。這表明姜黃素可誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞凋亡。（三）姜黃素對(duì)HEC-1-B細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，不同濃度的姜黃素作用48h和72h后，HEC-1-B細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)水平顯著下降，且隨著姜黃素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Survivin蛋白表達(dá)逐漸減少，呈時(shí)間-劑量依賴性（P＜0.01）。同時(shí)，caspase-3蛋白表達(dá)水平在姜黃素作用后均較對(duì)照組有不同程度的升高，并隨姜黃素濃度及作用時(shí)間的增加而遞增，呈時(shí)間-劑量依賴性（P＜0.01）。四、討論本研究結(jié)果表明，姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人HEC-1-B細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且這種抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)呈時(shí)間-劑量依賴方式。通過Hoechest33258熒光染色觀察到姜黃素可誘導(dǎo)HEC-1-B細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，姜黃素可能通過下調(diào)HEC-1-B細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)，直接激活caspase-3蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的重要成員，其高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡抵抗及不良預(yù)后密切相關(guān)。在正常組織中，Survivin的表達(dá)水平極低，但在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)。本研究中，姜黃素能夠顯著降低HEC-1-B細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)水平，提示姜黃素可能通過抑制Survivin的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制與促進(jìn)的平衡，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，在凋亡信號(hào)的刺激下，caspase-3被激活，進(jìn)而啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果顯示，姜黃素作用后HEC-1-B細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明姜黃素可能通過激活caspase-3蛋白，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。綜上所述，姜黃素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1-B具有抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)Sur