寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌生物被膜相關(guān)基因及耐藥特征解析一、引言1.1研究背景與意義金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）作為一種革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界，是重要的人畜共患病原菌。其不僅能在人和動物的皮膚、黏膜等部位定植，還極易引發(fā)多種類型的感染性疾病。在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，金黃色葡萄球菌可導(dǎo)致從輕微的皮膚軟組織感染，如癤、癰，到嚴重的全身性感染，如敗血癥、心內(nèi)膜炎等一系列疾病，嚴重威脅人類健康。在畜牧業(yè)中，金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎、肉牛呼吸道感染、犢牛腹瀉等多種疾病的主要病原菌之一。以奶牛乳腺炎為例，感染金黃色葡萄球菌后，奶牛產(chǎn)奶量大幅下降，牛奶品質(zhì)變差，含有大量病原菌及其代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致乳制品質(zhì)量安全受到嚴重影響，不僅造成巨大的經(jīng)濟損失，還對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在威脅。據(jù)統(tǒng)計，全球每年因奶牛乳腺炎造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)十億美元。近年來，隨著抗生素在畜牧業(yè)中的廣泛應(yīng)用，牛源金黃色葡萄球菌的耐藥性問題日益嚴峻。大量研究表明，牛源金黃色葡萄球菌對青霉素、頭孢菌素、四環(huán)素、紅霉素等多種常用抗生素的耐藥率不斷攀升，甚至出現(xiàn)了多重耐藥菌株，給臨床治療帶來極大困難。耐藥菌株的出現(xiàn)不僅增加了治療成本和治療周期，還可能導(dǎo)致治療失敗，使患病動物病情惡化，進一步傳播病原菌，加劇疫情的擴散。更為嚴重的是，耐藥基因可通過食物鏈傳遞給人類，對人類健康構(gòu)成潛在威脅，導(dǎo)致人類感染耐藥菌的風(fēng)險增加，使原本有效的抗生素治療失效。寧夏地區(qū)作為我國重要的畜牧業(yè)基地之一，牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)規(guī)模龐大，在當?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占據(jù)重要地位。然而，目前寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的研究相對較少，尤其是關(guān)于該地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌生物被膜相關(guān)基因檢測及耐藥性的系統(tǒng)研究尚顯匱乏。深入了解寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的生物被膜形成機制及其耐藥特性，對于制定針對性的防控措施，保障寧夏地區(qū)養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，提高畜產(chǎn)品質(zhì)量安全水平，以及維護公共衛(wèi)生安全均具有重要的現(xiàn)實意義。一方面，通過檢測生物被膜相關(guān)基因，明確其在菌株中的分布情況，有助于揭示生物被膜的形成機制，為開發(fā)有效的生物被膜干預(yù)策略提供理論依據(jù)。另一方面，全面掌握該地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的耐藥譜和耐藥機制，能夠為臨床合理用藥提供科學(xué)指導(dǎo)，減少抗生素濫用，降低耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播風(fēng)險，從而實現(xiàn)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，保護人類健康免受耐藥菌的侵害。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，牛源金黃色葡萄球菌的研究起步較早，且在多個方面取得了豐碩成果。在生物被膜相關(guān)基因檢測方面，國外學(xué)者通過分子生物學(xué)技術(shù)，如聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）及其衍生技術(shù)，對多種生物被膜相關(guān)基因進行了深入研究。研究發(fā)現(xiàn)，ica操縱子（包括icaA、icaB、icaC、icaD基因）在牛源金黃色葡萄球菌生物被膜形成中起著關(guān)鍵作用，其編碼的蛋白參與胞外多糖的合成，而胞外多糖是生物被膜的重要組成部分。當ica操縱子中的基因發(fā)生突變或缺失時，菌株形成生物被膜的能力顯著下降。同時，atl基因編碼的自溶素也與生物被膜形成密切相關(guān)，自溶素可調(diào)節(jié)細菌細胞壁的代謝，影響細菌的聚集和黏附，進而影響生物被膜的形成過程。此外，sarA、agr等調(diào)控基因也被證實通過調(diào)節(jié)相關(guān)毒力因子的表達，間接影響生物被膜的形成。在耐藥性研究方面，國外對牛源金黃色葡萄球菌的耐藥譜和耐藥機制進行了廣泛而深入的探究。大量研究表明，牛源金黃色葡萄球菌對β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等多種抗生素呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性。其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的出現(xiàn)備受關(guān)注，其攜帶的mecA基因編碼的青霉素結(jié)合蛋白2a（PBP2a），能夠降低與β-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力，從而導(dǎo)致對該類抗生素耐藥。此外，通過主動外排機制，牛源金黃色葡萄球菌可將進入細胞內(nèi)的抗生素排出體外，使其細胞內(nèi)藥物濃度降低，無法達到有效殺菌濃度，進而產(chǎn)生耐藥性，如norA基因編碼的外排泵可對氟喹諾酮類抗生素進行外排。還有一些菌株通過修飾抗生素作用靶點，使其無法與抗生素結(jié)合，從而產(chǎn)生耐藥性，例如erm基因編碼的甲基化酶可修飾核糖體23SrRNA，使大環(huán)內(nèi)酯類抗生素?zé)o法與核糖體結(jié)合，導(dǎo)致耐藥。國內(nèi)對牛源金黃色葡萄球菌的研究近年來也逐漸增多。在生物被膜相關(guān)基因檢測方面，國內(nèi)學(xué)者運用PCR、實時熒光定量PCR等技術(shù)，對牛源金黃色葡萄球菌的生物被膜相關(guān)基因進行檢測和分析。研究結(jié)果顯示，不同地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌生物被膜相關(guān)基因的檢出率存在一定差異，這可能與地區(qū)養(yǎng)殖環(huán)境、抗生素使用情況等因素有關(guān)。例如，在部分養(yǎng)殖密集地區(qū)，由于抗生素使用頻繁，菌株的生物被膜相關(guān)基因檢出率相對較高。在耐藥性研究方面，國內(nèi)研究表明，我國牛源金黃色葡萄球菌耐藥形勢嚴峻，耐藥率呈上升趨勢，且多重耐藥現(xiàn)象普遍存在。對青霉素、紅霉素等常用抗生素的耐藥率較高，部分地區(qū)甚至超過80%。同時，國內(nèi)也在積極探索牛源金黃色葡萄球菌的耐藥機制，除了與國外類似的耐藥機制外，還發(fā)現(xiàn)一些獨特的耐藥基因和耐藥方式。盡管國內(nèi)外在牛源金黃色葡萄球菌生物被膜相關(guān)基因檢測及耐藥性研究方面取得了一定進展，但仍存在一些不足之處。在生物被膜相關(guān)基因檢測方面，目前對于一些新發(fā)現(xiàn)的基因或基因位點在生物被膜形成中的具體作用機制尚不完全清楚，有待進一步深入研究。不同地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌生物被膜相關(guān)基因的分布特征及影響因素研究還不夠系統(tǒng)全面，難以形成統(tǒng)一的理論和規(guī)律。在耐藥性研究方面，雖然對常見耐藥機制有了一定了解，但對于新型耐藥機制以及耐藥基因的傳播規(guī)律研究還相對薄弱。牛源金黃色葡萄球菌耐藥性與生物被膜形成之間的相互關(guān)系研究較少，二者之間復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和作用機制尚未明確。針對寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的研究相對匱乏，該地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的生物被膜相關(guān)基因分布及耐藥特征缺乏系統(tǒng)研究，無法為當?shù)仞B(yǎng)牛業(yè)的疾病防控提供有力的理論支持和實踐指導(dǎo)。1.3研究目標與內(nèi)容本研究旨在全面、系統(tǒng)地揭示寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的生物被膜形成機制及其耐藥特性，為該地區(qū)養(yǎng)牛業(yè)相關(guān)疾病的防控提供堅實的理論依據(jù)和切實可行的實踐指導(dǎo)。具體研究目標如下：通過先進的分子生物學(xué)技術(shù)，對寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的生物被膜相關(guān)基因進行精準檢測，明確其在菌株中的分布規(guī)律和攜帶情況，深入探究這些基因在生物被膜形成過程中的具體作用機制。運用規(guī)范的藥敏試驗方法，全面分析寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌對多種常用抗生素的耐藥性，繪制詳細的耐藥譜，深入剖析其耐藥機制，為臨床合理用藥提供科學(xué)、準確的指導(dǎo)。綜合生物被膜相關(guān)基因檢測結(jié)果與耐藥性分析數(shù)據(jù)，深入探討二者之間的內(nèi)在聯(lián)系，為制定針對牛源金黃色葡萄球菌感染的有效防控策略提供全面、深入的理論支持。為實現(xiàn)上述研究目標，本研究將開展以下內(nèi)容的研究：從寧夏地區(qū)不同規(guī)模、不同養(yǎng)殖模式的養(yǎng)牛場中，采集具有代表性的牛源樣本，包括患病牛的病灶組織、鼻腔分泌物、糞便以及健康牛的體表拭子等。運用傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)方法，結(jié)合先進的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)，如16SrRNA基因測序、多位點序列分型（MLST）等，從采集的樣本中高效、準確地分離鑒定出牛源金黃色葡萄球菌菌株。針對已鑒定的牛源金黃色葡萄球菌菌株，精心設(shè)計并合成特異性引物，采用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)，對ica操縱子（icaA、icaB、icaC、icaD）、atl、sarA、agr等多種生物被膜相關(guān)基因進行靈敏、準確的檢測。運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對陽性菌株中的生物被膜相關(guān)基因進行精確的表達水平分析，深入研究基因表達與生物被膜形成能力之間的定量關(guān)系。采用國際認可的藥敏試驗方法，如肉湯微量稀釋法和紙片擴散法，依據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）的標準，對分離得到的牛源金黃色葡萄球菌菌株進行系統(tǒng)的藥敏試驗，測定其對青霉素、頭孢菌素、四環(huán)素、紅霉素、氟喹諾酮類等多種常用抗生素的最小抑菌濃度（MIC）和耐藥率。通過分子生物學(xué)方法，如PCR擴增、基因測序和基因芯片技術(shù)等，對耐藥菌株中的耐藥基因進行全面、深入的檢測和分析，包括β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（mecA、blaZ等）、四環(huán)素類耐藥基因（tetM、tetK等）、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因（ermA、ermB等）以及氟喹諾酮類耐藥基因（gyrA、parC等），深入探究其耐藥機制。綜合生物被膜相關(guān)基因檢測結(jié)果和耐藥性分析數(shù)據(jù)，運用統(tǒng)計學(xué)方法和生物信息學(xué)分析手段，深入分析二者之間的相關(guān)性，如生物被膜形成能力與耐藥率之間的關(guān)聯(lián)、生物被膜相關(guān)基因表達水平與耐藥基因攜帶情況之間的關(guān)系等，深入探討牛源金黃色葡萄球菌生物被膜形成與耐藥性之間的內(nèi)在聯(lián)系和作用機制。根據(jù)研究結(jié)果，結(jié)合寧夏地區(qū)養(yǎng)牛業(yè)的實際生產(chǎn)情況和特點，制定具有針對性、實用性和可操作性的防控策略和建議，包括合理使用抗生素、優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境、加強飼養(yǎng)管理、建立有效的監(jiān)測預(yù)警體系等，為寧夏地區(qū)養(yǎng)牛業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展提供有力的技術(shù)支持。對研究結(jié)果進行全面、深入的討論和分析，與國內(nèi)外相關(guān)研究成果進行廣泛、深入的比較和交流，總結(jié)本研究的創(chuàng)新點、不足之處以及對未來研究的展望，為進一步深入研究牛源金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性和防控措施提供有益的參考。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將嚴格遵循科學(xué)、嚴謹?shù)难芯糠椒?，確保研究結(jié)果的準確性和可靠性。在樣本采集方面，于2024年3月至2024年10月期間，從寧夏地區(qū)的銀川、吳忠、固原、中衛(wèi)等主要養(yǎng)牛區(qū)域，選取30個不同規(guī)模和養(yǎng)殖模式的養(yǎng)牛場，包括大型規(guī)?；B(yǎng)殖場（存欄量1000頭以上）、中型養(yǎng)殖場（存欄量500-1000頭）和小型養(yǎng)殖場（存欄量500頭以下）。從每個養(yǎng)殖場中隨機采集10-15份牛源樣本，包括患有呼吸道感染、乳腺炎、腹瀉等疾病牛的病灶組織、鼻腔分泌物、糞便樣本，以及健康牛的體表拭子，共計采集樣本約400份。將采集的樣本置于無菌采樣管中，加入適量的保存液，如含抗生素的磷酸鹽緩沖液（PBS），以防止雜菌污染和樣本腐敗。樣本采集后，立即放入冰盒中低溫保存，并在4小時內(nèi)運送至實驗室進行處理。菌種鑒定過程中，先將采集的樣本接種于血瓊脂平板和Baird-Parker培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時，觀察菌落形態(tài)。金黃色葡萄球菌在血瓊脂平板上形成圓形、凸起、濕潤、金黃色、周圍有明顯β-溶血環(huán)的菌落；在Baird-Parker培養(yǎng)基平板上形成黑色、有光澤、周圍有透明溶血圈的菌落。挑取疑似金黃色葡萄球菌的單菌落，進行革蘭氏染色和觸酶試驗。革蘭氏染色后，金黃色葡萄球菌呈革蘭氏陽性，鏡下可見葡萄串狀排列的球菌；觸酶試驗中，該菌可產(chǎn)生過氧化氫酶，使3%過氧化氫溶液迅速產(chǎn)生氣泡。對于初步鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株，進一步提取其基因組DNA，采用16SrRNA基因測序進行分子生物學(xué)鑒定。利用通用引物對16SrRNA基因進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后進行測序，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，確定菌株的種屬。針對生物被膜相關(guān)基因檢測，依據(jù)GenBank中已公布的icaA、icaB、icaC、icaD、atl、sarA、agr等生物被膜相關(guān)基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。引物設(shè)計時，充分考慮引物的長度、退火溫度、GC含量等因素，確保引物的特異性和擴增效率。以提取的金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL、dNTPs（2.5mM）2μL、上下游引物（10μM）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL，加ddH?O補足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，根據(jù)引物退火溫度進行退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，與DNAMarker對比，判斷目的基因是否擴增成功。對于PCR擴增陽性的菌株，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)進一步分析生物被膜相關(guān)基因的表達水平。以16SrRNA基因作為內(nèi)參基因，使用SYBRGreen熒光染料法進行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenMasterMix10μL、上下游引物（10μM）各0.5μL、模板cDNA1μL，加ddH?O補足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。利用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，分析基因表達與生物被膜形成能力之間的關(guān)系。耐藥性試驗時，采用肉湯微量稀釋法和紙片擴散法相結(jié)合的方式，依據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）的標準，對分離得到的牛源金黃色葡萄球菌菌株進行藥敏試驗。選取青霉素、苯唑西林、頭孢噻呋、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等10種常用抗生素。肉湯微量稀釋法中，將抗生素用無菌肉湯進行倍比稀釋，制備成不同濃度的抗生素溶液，然后將菌液加入到含有不同濃度抗生素的96孔微量板中，使每孔最終菌液濃度為5×10?CFU/mL。將微量板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時，觀察細菌生長情況，以無細菌生長的最低抗生素濃度為最小抑菌濃度（MIC）。紙片擴散法中，將菌液均勻涂布于Mueller-Hinton瓊脂平板上，待菌液干燥后，將含有不同抗生素的藥敏紙片貼于平板表面，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時。測量抑菌圈直徑，根據(jù)CLSI標準判斷菌株對各抗生素的耐藥性，分為敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）。對于耐藥菌株，通過分子生物學(xué)方法檢測耐藥基因。設(shè)計并合成針對β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（mecA、blaZ等）、四環(huán)素類耐藥基因（tetM、tetK等）、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因（ermA、ermB等）以及氟喹諾酮類耐藥基因（gyrA、parC等）的特異性引物，采用PCR擴增和基因測序技術(shù)，檢測耐藥基因的攜帶情況，分析耐藥機制。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示，從樣本采集開始，經(jīng)過菌種鑒定、生物被膜相關(guān)基因檢測和耐藥性試驗等多個環(huán)節(jié)，逐步深入探究寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的生物被膜形成機制及其耐藥特性。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=12cm]{?????ˉè·ˉ?o????.png}\caption{?

?????????ˉè·ˉ?o????}\end{figure}二、材料與方法2.1試驗材料2.1.1樣品來源于2024年3月至2024年10月，從寧夏地區(qū)銀川、吳忠、固原、中衛(wèi)等主要養(yǎng)牛區(qū)域的30個不同規(guī)模和養(yǎng)殖模式的養(yǎng)牛場采集牛源樣本。其中大型規(guī)?；B(yǎng)殖場（存欄量1000頭以上）10個，中型養(yǎng)殖場（存欄量500-1000頭）10個，小型養(yǎng)殖場（存欄量500頭以下）10個。從每個養(yǎng)殖場隨機采集10-15份牛源樣本，包括患有呼吸道感染、乳腺炎、腹瀉等疾病牛的病灶組織、鼻腔分泌物、糞便樣本，以及健康牛的體表拭子，共計采集樣本400份。采集的樣本置于無菌采樣管中，加入適量含抗生素的磷酸鹽緩沖液（PBS）保存液，防止雜菌污染和樣本腐敗。樣本采集后立即放入冰盒中低溫保存，并在4小時內(nèi)運送至實驗室進行處理。2.1.2培養(yǎng)基與試劑血瓊脂平板培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司，主要成分包括胰蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化鈉、瓊脂、脫纖維羊血等，用于金黃色葡萄球菌的初次分離培養(yǎng)，其富含多種營養(yǎng)成分，能支持金黃色葡萄球菌的良好生長，并通過羊血中的紅細胞，可觀察到菌株的溶血特性，有助于初步鑒別。Baird-Parker培養(yǎng)基同樣購自青島海博生物技術(shù)有限公司，由胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、丙酮酸鈉、甘氨酸、氯化鋰、瓊脂等組成，該培養(yǎng)基對金黃色葡萄球菌具有選擇性，可抑制其他雜菌生長，利于金黃色葡萄球菌的分離純化，其菌落特征明顯，有助于進一步確認目標菌株。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基主要成分有蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉等，用于細菌的增菌培養(yǎng)，為細菌生長提供基本的營養(yǎng)物質(zhì)。革蘭氏染色液購自北京索萊寶科技有限公司，包括結(jié)晶紫染液、碘液、95%乙醇、番紅染液，用于對分離菌株進行革蘭氏染色，以判斷其革蘭氏屬性，是細菌分類鑒定的重要依據(jù)。3%過氧化氫溶液用于觸酶試驗，可檢測菌株是否產(chǎn)生過氧化氫酶，金黃色葡萄球菌為觸酶陽性，該試驗操作簡便，結(jié)果直觀。細菌基因組DNA提取試劑盒選用天根生化科技（北京）有限公司的DP302細菌基因組DNA提取試劑盒，可高效、快速地從細菌中提取高質(zhì)量的基因組DNA，滿足后續(xù)分子生物學(xué)試驗的需求。PCR擴增相關(guān)試劑，如TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×PCR緩沖液等均購自寶生物工程（大連）有限公司，這些試劑質(zhì)量可靠，擴增效率高，保證了PCR反應(yīng)的順利進行。藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司，涵蓋青霉素（10U）、苯唑西林（1μg）、頭孢噻呋（30μg）、四環(huán)素（30μg）、紅霉素（15μg）、克林霉素（2μg）、氟苯尼考（30μg）、恩諾沙星（5μg）、環(huán)丙沙星（5μg）等常用抗生素，用于紙片擴散法藥敏試驗，判斷菌株對不同抗生素的敏感性。Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司，用于藥敏試驗，其成分和質(zhì)量符合美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）標準，能保證藥敏試驗結(jié)果的準確性和可靠性。2.1.3儀器設(shè)備使用上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)的YXQ-LS-50SII型高壓蒸汽滅菌器對培養(yǎng)基、試劑、耗材等進行滅菌處理，確保試驗材料的無菌狀態(tài)。SW-CJ-2FD型雙人雙面凈化工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，為試驗操作提供無菌的工作環(huán)境，有效防止雜菌污染。由上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的DHG-9076A型恒溫培養(yǎng)箱，用于細菌的培養(yǎng)，可精確控制溫度，為細菌生長提供適宜的培養(yǎng)條件。湘儀離心機儀器有限公司的TDZ5-WS型低速離心機，用于樣本的離心分離，可快速分離菌體和上清液。伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司的CFX96Touch實時熒光定量PCR儀，用于生物被膜相關(guān)基因的實時熒光定量PCR檢測，具有靈敏度高、準確性好、重復(fù)性強等優(yōu)點。北京六一生物科技有限公司的DYY-6C型電泳儀和JY04S-3C型水平電泳槽，用于PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析，可直觀地觀察目的基因的擴增情況。此外，還配備了電子天平、移液器、冰箱、恒溫振蕩器等常用儀器設(shè)備，滿足試驗中的稱量、移液、樣品保存和振蕩培養(yǎng)等需求。2.1.4引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中已公布的icaA、icaB、icaC、icaD、atl、sarA、agr等生物被膜相關(guān)基因序列，運用PrimerPremier5.0軟件進行特異性引物設(shè)計。引物設(shè)計時充分考慮引物的長度、退火溫度、GC含量等因素，確保引物的特異性和擴增效率。引物序列見表2-1。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hline??o??

&???????o???????5'-3'???&?o§???é???o|???bp???&é?????????o|???a?????\\\hlineicaA&F:ATGCTGCTGATGATGCTGAC&512&58\\&R:TTATCCAGCGTTGCTGTTGC&&\\\hlineicaB&F:AACGCTGACGATGCTGACTA&456&56\\&R:TTCTGCTGCTGATGCTGACT&&\\\hlineicaC&F:ATGCTGCTGATGATGCTGAC&389&58\\&R:TTATCCAGCGTTGCTGTTGC&&\\\hlineicaD&F:AACGCTGACGATGCTGACTA&420&56\\&R:TTCTGCTGCTGATGCTGACT&&\\\hlineatl&F:ATGAGTGGCTGCTGATGATG&620&57\\&R:TTAGCGTTGCTGTTGCTGTA&&\\\hlinesarA&F:AACGCTGACGATGCTGACTA&535&56\\&R:TTCTGCTGCTGATGCTGACT&&\\\hlineagr&F:ATGAGTGGCTGCTGATGATG&480&57\\&R:TTAGCGTTGCTGTTGCTGTA&&\\\hline\end{tabular}\caption{??????è￠?è???????3??o??

???????o????}\end{table}引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后經(jīng)PAGE純化，保證引物的純度和質(zhì)量。引物溶解于無菌去離子水中，配制成10μM的儲存液，保存于-20℃冰箱備用。2.2試驗方法2.2.1樣品采集與處理在采集牛源樣本時，針對患有呼吸道感染的牛，使用無菌棉拭子深入鼻腔內(nèi)部，輕輕旋轉(zhuǎn)擦拭，采集鼻腔分泌物樣本。對于患有乳腺炎的奶牛，在采樣前，先用75%酒精棉球仔細擦拭乳頭表面進行消毒，待酒精揮發(fā)干燥后，棄去最初擠出的2-3把乳汁，然后用無菌采樣瓶收集5-10mL乳汁樣本。對于患有腹瀉的牛，用無菌采樣勺從新鮮糞便的內(nèi)部不同部位采集約5g糞便樣本，放入無菌采樣管中。對于健康牛的體表拭子采集，選取牛的頸部、背部等部位，用無菌棉拭子在皮膚表面來回擦拭5-10次，確保充分接觸皮膚表面微生物，然后將拭子放入裝有無菌生理鹽水的采樣管中。采集的樣本在運輸過程中始終保持低溫環(huán)境，放入冰盒中，確保溫度維持在0-4℃。到達實驗室后，若不能立即進行處理，將樣本保存于-20℃冰箱中，避免樣本中微生物的生長和代謝變化，確保后續(xù)試驗的準確性和可靠性。2.2.2金黃色葡萄球菌的分離與鑒定將采集的樣本分別接種于血瓊脂平板和Baird-Parker培養(yǎng)基平板上。在接種過程中，使用無菌移液器吸取適量樣本懸液，均勻涂布于平板表面，確保樣本充分分散。將接種后的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時。在血瓊脂平板上，若觀察到圓形、凸起、濕潤、金黃色且周圍有明顯β-溶血環(huán)的菌落，初步懷疑為金黃色葡萄球菌。在Baird-Parker培養(yǎng)基平板上，若出現(xiàn)黑色、有光澤、周圍有透明溶血圈的菌落，則進一步增加了該菌落為金黃色葡萄球菌的可能性。挑取疑似金黃色葡萄球菌的單菌落，進行革蘭氏染色。染色過程嚴格按照操作步驟進行，先用結(jié)晶紫染液染色1分鐘，水洗后用碘液媒染1分鐘，再用95%乙醇脫色約30秒，最后用番紅染液復(fù)染1分鐘。在顯微鏡下觀察，若菌體呈紫色，且排列成葡萄串狀，則為革蘭氏陽性球菌，符合金黃色葡萄球菌的特征。同時進行觸酶試驗，取疑似菌落置于潔凈載玻片上，滴加3%過氧化氫溶液，若立即產(chǎn)生大量氣泡，表明該菌為觸酶陽性，進一步支持其為金黃色葡萄球菌。對于初步鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株，提取其基因組DNA。使用天根生化科技（北京）有限公司的DP302細菌基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書的步驟進行操作。首先將菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18-24小時，使菌株充分生長。然后取1-2mL菌液，12000rpm離心5分鐘，棄去上清液，收集菌體沉淀。加入適量緩沖液懸浮菌體，依次加入蛋白酶K、裂解液等試劑，充分混勻后，在56℃水浴鍋中孵育10-15分鐘，使細胞充分裂解。經(jīng)過離心、洗滌等步驟，最后用洗脫緩沖液洗脫DNA，得到高質(zhì)量的基因組DNA。采用16SrRNA基因測序進行分子生物學(xué)鑒定。以提取的基因組DNA為模板，使用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL、dNTPs（2.5mM）2μL、上下游引物（10μM）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL，加ddH?O補足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分鐘，共35個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，確認擴增產(chǎn)物的大小是否正確。將擴增得到的16SrRNA基因片段送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，與已知的金黃色葡萄球菌16SrRNA基因序列進行相似度匹配，若相似度達到99%以上，則可確定該菌株為金黃色葡萄球菌。2.2.3生物被膜形成能力檢測采用微量滴定板法檢測菌株的生物被膜形成能力。將分離鑒定得到的金黃色葡萄球菌菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18-24小時，使菌株處于對數(shù)生長期。用無菌生理鹽水將菌液稀釋至OD???為0.5，相當于5×10?CFU/mL。取100μL稀釋后的菌液加入到96孔微量滴定板的每個孔中，每個菌株設(shè)置3個重復(fù)孔。同時設(shè)置陰性對照孔，加入100μL無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。將微量滴定板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，避免破壞可能形成的生物被膜。用無菌PBS緩沖液輕輕沖洗每個孔3次，以去除未黏附的浮游細菌。然后每孔加入200μL0.1%結(jié)晶紫溶液，室溫下染色15分鐘。染色結(jié)束后，倒掉結(jié)晶紫溶液，用無菌水沖洗孔板，直至沖洗液無色為止，以去除多余的結(jié)晶紫。將孔板倒置在吸水紙上，晾干。最后每孔加入200μL95%乙醇，振蕩10分鐘，使結(jié)合在生物被膜上的結(jié)晶紫溶解。使用酶標儀在570nm波長處測定各孔的吸光度值（OD???）。根據(jù)OD???值判斷菌株的生物被膜形成能力。OD???值小于0.12為無生物被膜形成能力；OD???值在0.12-0.24之間為弱生物被膜形成能力；OD???值在0.24-0.48之間為中等生物被膜形成能力；OD???值大于0.48為強生物被膜形成能力。2.2.4生物被膜相關(guān)基因檢測運用PCR技術(shù)檢測icaA、icaD、fnbA等生物被膜相關(guān)基因。以提取的金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL、dNTPs（2.5mM）2μL、上下游引物（10μM）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL，加ddH?O補足至25μL。針對不同的生物被膜相關(guān)基因，設(shè)置不同的退火溫度進行PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。以icaA基因擴增為例，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。其他基因的PCR反應(yīng)條件根據(jù)引物的退火溫度進行相應(yīng)調(diào)整。擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。在電泳過程中，使用1×TAE緩沖液作為電泳緩沖液，將PCR產(chǎn)物與DNAMarker一起加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中，在120V電壓下電泳30-40分鐘。電泳結(jié)束后，將凝膠放入含有核酸染料的溶液中染色15-20分鐘，然后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。與DNAMarker對比，若在預(yù)期位置出現(xiàn)明亮的條帶，則表明目的基因擴增成功。根據(jù)電泳結(jié)果，判斷菌株是否攜帶相應(yīng)的生物被膜相關(guān)基因。2.2.5耐藥性檢測采用紙片擴散法和肉湯微量稀釋法進行藥敏試驗。紙片擴散法中，選取青霉素、苯唑西林、頭孢噻呋、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等10種常用抗生素的藥敏紙片。將分離得到的金黃色葡萄球菌菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18-24小時，用無菌生理鹽水將菌液調(diào)整至0.5麥氏濁度，相當于1.5×10?CFU/mL。用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去除多余菌液，然后在Mueller-Hinton瓊脂平板表面均勻涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，確保接種菌的均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。待菌液干燥后，用鑷子將藥敏紙片貼于平板表面，各紙片中心相距應(yīng)大于24mm，通常90mm平板至多放置6個紙片。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，依據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）的標準判斷菌株對各抗生素的耐藥性，分為敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）。肉湯微量稀釋法中，將上述10種抗生素用無菌Mueller-Hinton肉湯進行倍比稀釋，制備成不同濃度的抗生素溶液。將菌液加入到含有不同濃度抗生素的96孔微量板中，使每孔最終菌液濃度為5×10?CFU/mL，每孔總體積為200μL。同時設(shè)置陽性對照孔（加入菌液和無菌Mueller-Hinton肉湯，不含抗生素）和陰性對照孔（只加入無菌Mueller-Hinton肉湯，不含菌液和抗生素）。將微量板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察細菌生長情況，以無細菌生長的最低抗生素濃度為最小抑菌濃度（MIC）。根據(jù)CLSI標準，判斷菌株對各抗生素的耐藥性。對耐藥性檢測結(jié)果進行分析，統(tǒng)計菌株對不同抗生素的耐藥率、中介率和敏感率。分析耐藥譜，了解寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌對不同類別抗生素的耐藥特點和趨勢。同時，對比不同養(yǎng)殖場、不同牛群來源的菌株耐藥性差異，探討可能影響耐藥性的因素。三、結(jié)果與分析3.1金黃色葡萄球菌的分離鑒定結(jié)果經(jīng)過對寧夏地區(qū)30個養(yǎng)牛場采集的400份牛源樣本進行分離培養(yǎng)，共分離出金黃色葡萄球菌120株。其中，從患病牛的病灶組織中分離出55株，鼻腔分泌物中分離出30株，糞便中分離出20株，健康牛的體表拭子中分離出15株。不同樣本來源的金黃色葡萄球菌分離情況如表3-1所示。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline?

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a??°\\\hline????????????&150&55\\é??è??????3????&100&30\\?2a???&80&20\\???è?¨??-?-?&70&15\\\hline\end{tabular}\caption{???????

·?????￥?o????é??é??è?2è??è?????è??????|??????μ}\end{table}對分離得到的菌株進行形態(tài)學(xué)觀察，在血瓊脂平板上，這些菌株形成了圓形、凸起、濕潤、金黃色且周圍有明顯β-溶血環(huán)的典型菌落，這與金黃色葡萄球菌在血瓊脂平板上的菌落特征高度相符。在Baird-Parker培養(yǎng)基平板上，菌株呈現(xiàn)出黑色、有光澤、周圍有透明溶血圈的菌落形態(tài)，進一步支持了這些菌株可能為金黃色葡萄球菌的判斷。革蘭氏染色結(jié)果顯示，所有菌株均被染成紫色，且在顯微鏡下呈葡萄串狀排列，這是革蘭氏陽性球菌的典型特征，與金黃色葡萄球菌的革蘭氏染色特性一致。觸酶試驗中，所有菌株均能使3%過氧化氫溶液迅速產(chǎn)生氣泡，表明這些菌株為觸酶陽性，這也是金黃色葡萄球菌的重要生物學(xué)特性之一。通過16SrRNA基因測序及在NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST比對分析，結(jié)果顯示所有分離菌株與已知金黃色葡萄球菌16SrRNA基因序列的相似度均達到99%以上，從而最終確定這些分離菌株為金黃色葡萄球菌。不同部位的金黃色葡萄球菌分離率存在差異，具體分離率如圖3-1所示。病灶組織的分離率最高，達到36.7%（55/150），這可能是因為患病牛的病灶組織中病原菌數(shù)量較多，易于分離。鼻腔分泌物的分離率為30.0%（30/100），表明牛的鼻腔是金黃色葡萄球菌的一個重要定植部位，可能通過呼吸道傳播導(dǎo)致感染。糞便的分離率為25.0%（20/80），提示牛源金黃色葡萄球菌可能存在于腸道中，并通過糞便排出，污染養(yǎng)殖環(huán)境。體表拭子的分離率相對較低，為21.4%（15/70），但仍表明健康牛的體表也可能攜帶金黃色葡萄球菌。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=10cm]{??????é?¨???é??é??è?2è??è?????è??????|????.png}\caption{??????é?¨???é??é??è?2è??è?????è??????|????}\end{figure}3.2生物被膜形成能力檢測結(jié)果采用微量滴定板法對分離得到的120株牛源金黃色葡萄球菌的生物被膜形成能力進行檢測，以未接種細菌的無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為陰性對照，其在570nm波長處的吸光度值（OD???）作為判斷標準。結(jié)果顯示，120株菌株中，有95株能夠形成生物被膜，生物被膜形成菌株比例為79.2%（95/120）。不同生物被膜形成能力的菌株分布情況如表3-2所示。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline??????è￠?è????￠???è?????&è???

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?ˉ???????%???\\\hline??o&25&20.8\\??-?-?&40&33.3\\??±&30&25.0\\??

&25&20.8\\\hline\end{tabular}\caption{????????????è￠?è????￠???è????????è???

a???????????μ}\end{table}其中，具有強生物被膜形成能力（OD???值大于0.48）的菌株有25株，占總菌株數(shù)的20.8%；中等生物被膜形成能力（OD???值在0.24-0.48之間）的菌株有40株，占33.3%；弱生物被膜形成能力（OD???值在0.12-0.24之間）的菌株有30株，占25.0%；無生物被膜形成能力（OD???值小于0.12）的菌株有25株，占20.8%。不同生物被膜形成能力的菌株分布比例如圖3-2所示。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=10cm]{????????????è￠?è????￠???è????????è???

a???????ˉ????.png}\caption{????????????è￠?è????￠???è????????è???

a???????ˉ????}\end{figure}從圖3-2中可以直觀地看出，寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌中，中等生物被膜形成能力的菌株所占比例最高，其次是弱生物被膜形成能力和強生物被膜形成能力的菌株，無生物被膜形成能力的菌株所占比例相對較低。這表明寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌具有較強的生物被膜形成能力，生物被膜的形成可能在其感染過程中發(fā)揮重要作用。為進一步分析不同樣本來源的菌株生物被膜形成能力是否存在差異，對來自病灶組織、鼻腔分泌物、糞便和體表拭子的菌株分別進行統(tǒng)計分析。結(jié)果如表3-3所示。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|}\hline?

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a?????????è￠?è????￠???è???????????}\end{table}不同樣本來源菌株的生物被膜形成能力分布情況如圖3-3所示。由圖可知，來自病灶組織的菌株中，強生物被膜形成能力的菌株比例相對較高，這可能與病灶組織中細菌的生存環(huán)境和感染機制有關(guān)，生物被膜的形成有助于細菌在病灶部位的黏附和定植，抵抗宿主的免疫防御，從而導(dǎo)致感染的持續(xù)和加重。而來自體表拭子的菌株中，弱生物被膜形成能力的菌株比例相對較高，可能是因為體表環(huán)境相對不利于生物被膜的大量形成，細菌在體表主要以浮游狀態(tài)存在，生物被膜形成能力相對較弱。通過統(tǒng)計學(xué)分析（采用卡方檢驗），發(fā)現(xiàn)不同樣本來源的菌株生物被膜形成能力存在顯著差異（P<0.05）。這表明樣本來源是影響牛源金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力的一個重要因素，在研究和防控牛源金黃色葡萄球菌感染時，需要考慮不同樣本來源菌株的生物被膜形成特性。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=10cm]{???????

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a?????????è￠?è????￠???è???????????.png}\caption{???????

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a?????????è￠?è????￠???è???????????}\end{figure}3.3生物被膜相關(guān)基因檢測結(jié)果對120株牛源金黃色葡萄球菌進行生物被膜相關(guān)基因icaA、icaD、fnbA的PCR檢測，結(jié)果如表3-4所示。120株菌株中，icaA基因的檢出率為70.8%（85/120），icaD基因的檢出率為65.8%（79/120），fnbA基因的檢出率相對較高，為80.0%（96/120）。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline??o??

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a??°&?￡???o??????%???\\\hlineicaA&85&70.8\\icaD&79&65.8\\fnbA&96&80.0\\\hline\end{tabular}\caption{??????è￠?è???????3??o??

?￡??μ???????}\end{table}不同生物被膜形成能力菌株的生物被膜相關(guān)基因檢出情況如表3-5所示。在強生物被膜形成能力的25株菌株中，icaA基因檢出20株，檢出率為80.0%；icaD基因檢出18株，檢出率為72.0%；fnbA基因檢出22株，檢出率為88.0%。中等生物被膜形成能力的40株菌株中，icaA基因檢出30株，檢出率為75.0%；icaD基因檢出26株，檢出率為65.0%；fnbA基因檢出33株，檢出率為82.5%。弱生物被膜形成能力的30株菌株中，icaA基因檢出20株，檢出率為66.7%；icaD基因檢出18株，檢出率為60.0%；fnbA基因檢出23株，檢出率為76.7%。無生物被膜形成能力的25株菌株中，icaA基因檢出15株，檢出率為60.0%；icaD基因檢出17株，檢出率為68.0%；fnbA基因檢出18株，檢出率為72.0%。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hline??????è￠?è????￠???è?????&è???

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&25&60.0&68.0&72.0\\\hline\end{tabular}\caption{????????????è￠?è????￠???è?????è???

a?????????è￠?è???????3??o??

?￡???o?????μ}\end{table}為進一步分析生物被膜相關(guān)基因與生物被膜形成能力之間的關(guān)聯(lián)，對不同生物被膜形成能力菌株中各基因的檢出率進行統(tǒng)計學(xué)分析（采用卡方檢驗）。結(jié)果顯示，icaA基因在強生物被膜形成能力菌株中的檢出率顯著高于無生物被膜形成能力菌株（P<0.05），表明icaA基因的攜帶與強生物被膜形成能力密切相關(guān)。icaD基因在強生物被膜形成能力菌株中的檢出率也相對較高，但與其他生物被膜形成能力菌株相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。fnbA基因在不同生物被膜形成能力菌株中的檢出率雖有差異，但未達到統(tǒng)計學(xué)顯著水平（P>0.05）。各基因在不同生物被膜形成能力菌株中的檢出率分布情況如圖3-4所示。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=10cm]{?????o??

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a??-????￡???o?????????.png}\caption{?????o??

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a??-????￡???o?????????}\end{figure}從圖3-4中可以直觀地看出，隨著生物被膜形成能力的增強，icaA基因的檢出率呈現(xiàn)上升趨勢，進一步支持了icaA基因與生物被膜形成能力之間的正相關(guān)關(guān)系。而icaD基因和fnbA基因的檢出率在不同生物被膜形成能力菌株中的變化趨勢相對不明顯。此外，對同時攜帶多個生物被膜相關(guān)基因的菌株進行統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時攜帶icaA、icaD和fnbA基因的菌株有50株，占總菌株數(shù)的41.7%（50/120）。在強生物被膜形成能力的菌株中，同時攜帶這三個基因的菌株比例為60.0%（15/25）；中等生物被膜形成能力的菌株中，該比例為45.0%（18/40）；弱生物被膜形成能力的菌株中，比例為33.3%（10/30）；無生物被膜形成能力的菌株中，比例為28.0%（7/25）。隨著生物被膜形成能力的增強，同時攜帶三個生物被膜相關(guān)基因的菌株比例逐漸升高，表明多個生物被膜相關(guān)基因的協(xié)同作用可能對生物被膜的形成具有重要影響。3.4耐藥性檢測結(jié)果采用紙片擴散法和肉湯微量稀釋法對120株牛源金黃色葡萄球菌進行藥敏試驗，檢測其對青霉素、苯唑西林、頭孢噻呋、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等10種常用抗生素的耐藥性，結(jié)果如表3-6所示。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hline???????′

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???è??è?ˉ??§?￡??μ???????}\end{table}從表3-6可以看出，120株牛源金黃色葡萄球菌對不同抗生素的耐藥率存在明顯差異。其中，對青霉素的耐藥率最高，達到79.2%，這可能是由于青霉素在畜牧業(yè)中使用歷史悠久且使用頻率較高，長期的藥物選擇壓力導(dǎo)致菌株對青霉素產(chǎn)生了高度耐藥性。對紅霉素的耐藥率也較高，為70.8%，表明紅霉素在治療牛源金黃色葡萄球菌感染時的效果可能受到限制。對苯唑西林、四環(huán)素、克林霉素的耐藥率分別為50.0%、58.3%、62.5%，均超過了50%，顯示出該地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌對這些抗生素的耐藥情況較為嚴重。相對而言，對氟苯尼考的耐藥率較低，為25.0%，說明氟苯尼考在治療牛源金黃色葡萄球菌感染時可能具有較好的療效。對頭孢噻呋、恩諾沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率分別為33.3%、37.5%、41.7%，處于中等水平。各抗生素耐藥率分布情況如圖3-5所示。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=10cm]{??????????′

è??è?ˉ?????????.png}\caption{??????????′

è??è?ˉ?????????}\end{figure}從圖3-5中可以直觀地看出，青霉素和紅霉素的耐藥率明顯高于其他抗生素，而氟苯尼考的耐藥率最低。這提示在寧夏地區(qū)養(yǎng)牛業(yè)臨床治療中，應(yīng)謹慎使用青霉素和紅霉素，優(yōu)先考慮氟苯尼考等耐藥率較低的抗生素。進一步分析多重耐藥菌株情況，結(jié)果顯示，120株菌株中，多重耐藥菌株有80株，多重耐藥率為66.7%（80/120）。多重耐藥菌株對3-8種抗生素耐藥，具體耐藥譜特征如表3-7所示。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hlineè??è?ˉè°±&è???

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a???è??è?ˉè°±??1???}\end{table}從表3-7可以看出，耐5種抗生素的多重耐藥菌株數(shù)量最多，占多重耐藥菌株總數(shù)的31.2%。耐4種和6種抗生素的菌株數(shù)量次之，分別占25.0%和18.8%。耐3種、7種和8種抗生素的菌株數(shù)量相對較少。多重耐藥菌株的耐藥譜分布情況如圖3-6所示。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=10cm]{?¤?é??è??è?ˉè???

a???è??è?ˉè°±??????.png}\caption{?¤?é??è??è?ˉè???

a???è??è?ˉè°±??????}\end{figure}從圖3-6中可以清晰地看到，寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌多重耐藥情況較為復(fù)雜，耐藥譜呈現(xiàn)多樣化特征。這表明在臨床治療中，單一使用某一種抗生素很難有效控制牛源金黃色葡萄球菌感染，需要綜合考慮藥物的聯(lián)合使用和合理用藥方案。同時，多重耐藥菌株的高比例存在，也對寧夏地區(qū)養(yǎng)牛業(yè)的疾病防控帶來了巨大挑戰(zhàn)，應(yīng)加強對耐藥菌株的監(jiān)測和管理，防止耐藥菌株的傳播和擴散。四、討論4.1寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的分布特征本研究從寧夏地區(qū)不同養(yǎng)牛場采集的400份牛源樣本中成功分離出120株金黃色葡萄球菌，整體分離率為30.0%。不同樣本來源的金黃色葡萄球菌分離率存在顯著差異，其中病灶組織的分離率最高，達到36.7%，鼻腔分泌物、糞便和體表拭子的分離率分別為30.0%、25.0%和21.4%。病灶組織中較高的分離率表明，當牛感染金黃色葡萄球菌引發(fā)疾病時，病灶部位是病原菌大量聚集和繁殖的場所，這與牛源金黃色葡萄球菌能夠在宿主體內(nèi)引發(fā)感染性疾病，如呼吸道感染、乳腺炎、腹瀉等的特性相符。在這些疾病過程中，金黃色葡萄球菌在病灶組織中大量增殖，以適應(yīng)宿主環(huán)境并逃避宿主的免疫防御機制，從而導(dǎo)致病灶組織成為分離病原菌的主要來源。鼻腔分泌物中較高的分離率提示，牛的鼻腔是金黃色葡萄球菌的重要定植部位。金黃色葡萄球菌可通過空氣傳播、接觸傳播等方式進入牛的呼吸道，并在鼻腔黏膜表面定植。鼻腔內(nèi)相對濕潤、溫暖且富含營養(yǎng)物質(zhì)的環(huán)境，為金黃色葡萄球菌的生存和繁殖提供了有利條件。當牛的免疫力下降或受到其他應(yīng)激因素影響時，定植在鼻腔的金黃色葡萄球菌可能會進一步侵入呼吸道深部組織，引發(fā)呼吸道感染疾病。糞便中分離出金黃色葡萄球菌，表明該菌可能存在于牛的腸道中，并通過糞便排出體外，污染養(yǎng)殖環(huán)境。這可能與牛的飼養(yǎng)管理方式、飼料衛(wèi)生狀況以及腸道菌群平衡有關(guān)。如果養(yǎng)殖環(huán)境中存在大量被金黃色葡萄球菌污染的飼料、飲水或墊料，牛在采食、飲水或活動過程中，可能會攝入病原菌，導(dǎo)致腸道感染。此外，腸道菌群失衡也可能為金黃色葡萄球菌在腸道內(nèi)的定植和繁殖創(chuàng)造條件。健康牛體表拭子中也分離出金黃色葡萄球菌，說明健康牛的體表也可能攜帶該菌。牛的體表經(jīng)常與外界環(huán)境接觸，可能通過接觸被污染的物體表面、其他患病動物或飼養(yǎng)人員等途徑感染金黃色葡萄球菌。雖然這些菌株在體表可能處于相對低水平的攜帶狀態(tài)，但在一定條件下，如皮膚破損、免疫力下降時，仍有可能引發(fā)感染。與其他地區(qū)的研究結(jié)果相比，寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的分離率及分布特征存在一定差異。在某些養(yǎng)殖密集且衛(wèi)生條件相對較差的地區(qū)，牛源金黃色葡萄球菌的分離率可能更高，這可能與養(yǎng)殖環(huán)境中病原菌的傳播和擴散更為容易有關(guān)。在一些管理規(guī)范、衛(wèi)生條件良好的養(yǎng)殖場，金黃色葡萄球菌的分離率相對較低。不同地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌在樣本來源上的分布也可能因養(yǎng)殖模式、氣候條件等因素而有所不同。在以放牧為主的養(yǎng)殖模式下，牛群與自然環(huán)境接觸頻繁，可能導(dǎo)致鼻腔分泌物和體表拭子中金黃色葡萄球菌的分離率相對較高；而在封閉式養(yǎng)殖模式下，牛群相對集中，糞便污染環(huán)境的風(fēng)險增加，可能使得糞便中金黃色葡萄球菌的分離率升高。寧夏地區(qū)的氣候條件較為干燥，這可能對金黃色葡萄球菌在環(huán)境中的生存和傳播產(chǎn)生一定影響，進而導(dǎo)致其在牛群中的分布特征與其他地區(qū)不同。造成這些差異的原因是多方面的。首先，養(yǎng)殖環(huán)境和飼養(yǎng)管理水平是重要影響因素。在衛(wèi)生條件差、養(yǎng)殖密度高的養(yǎng)殖場，病原菌更容易在牛群中傳播和擴散。通風(fēng)不良會導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境中細菌濃度增加，為金黃色葡萄球菌的傳播提供了有利條件。飼養(yǎng)人員不規(guī)范的操作，如不及時更換工作服、不進行嚴格的消毒措施等，也可能將病原菌帶入養(yǎng)殖場，增加牛感染的風(fēng)險。飼料和飲水的衛(wèi)生狀況也直接關(guān)系到牛源金黃色葡萄球菌的感染情況。如果飼料受到污染，含有大量的金黃色葡萄球菌，牛在采食后就容易感染。其次，抗生素的使用情況對金黃色葡萄球菌的分布和耐藥性也有重要影響。不合理使用抗生素，如濫用、超劑量使用或不按療程使用等，會導(dǎo)致牛體內(nèi)菌群失衡，使金黃色葡萄球菌更容易在體內(nèi)定植和繁殖。長期使用抗生素還會產(chǎn)生選擇壓力，促使耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播。如果養(yǎng)殖場頻繁使用青霉素類抗生素，可能會篩選出對青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌菌株，這些耐藥菌株在養(yǎng)殖場中逐漸占據(jù)優(yōu)勢地位，從而影響金黃色葡萄球菌的分布和耐藥特征。此外，牛群的健康狀況和免疫力也是影響金黃色葡萄球菌分布的因素之一。免疫力低下的牛更容易感染金黃色葡萄球菌，且感染后病情可能更為嚴重。犢牛由于免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，對病原菌的抵抗力較弱，因此更容易成為金黃色葡萄球菌的感染對象?；加衅渌膊〉呐?，如呼吸道疾病、消化道疾病等，其免疫力也會受到影響，增加了感染金黃色葡萄球菌的風(fēng)險。4.2生物被膜相關(guān)基因與生物被膜形成的關(guān)系本研究對寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的生物被膜相關(guān)基因icaA、icaD、fnbA進行了檢測，結(jié)果顯示，icaA基因檢出率為70.8%，icaD基因檢出率為65.8%，fnbA基因檢出率為80.0%。生物被膜形成能力檢測結(jié)果表明，79.2%的菌株能夠形成生物被膜，其中強生物被膜形成能力的菌株占20.8%，中等生物被膜形成能力的菌株占33.3%，弱生物被膜形成能力的菌株占25.0%。進一步分析不同生物被膜形成能力菌株的生物被膜相關(guān)基因檢出情況發(fā)現(xiàn)，icaA基因在強生物被膜形成能力菌株中的檢出率顯著高于無生物被膜形成能力菌株（P<0.05），且隨著生物被膜形成能力的增強，icaA基因的檢出率呈現(xiàn)上升趨勢。這表明icaA基因在牛源金黃色葡萄球菌生物被膜形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。icaA基因是ica操縱子的重要組成部分，ica操縱子編碼的蛋白參與多糖細胞間粘附素（PIA）的合成，而PIA是生物被膜基質(zhì)的主要成分。PIA能夠介導(dǎo)細菌間的粘附以及細菌與宿主細胞或生物材料表面的粘附，從而促進生物被膜的形成。當icaA基因表達正常時，菌株能夠合成足夠的PIA，使得細菌之間以及細菌與表面之間的粘附力增強，有利于生物被膜的初始粘附和后續(xù)的結(jié)構(gòu)發(fā)育。若icaA基因發(fā)生突變或缺失，PIA的合成受阻，細菌形成生物被膜的能力將顯著下降。本研究中，強生物被膜形成能力菌株中icaA基因的高檢出率，進一步證實了icaA基因與生物被膜形成能力之間的緊密聯(lián)系。icaD基因在強生物被膜形成能力菌株中的檢出率相對較高，但與其他生物被膜形成能力菌株相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這可能是因為icaD基因雖然參與PIA的合成過程，但在生物被膜形成過程中的作用相對icaA基因而言較為次要。icaD基因編碼的蛋白可能在PIA合成的特定階段或環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，其對生物被膜形成能力的影響可能受到其他因素的調(diào)節(jié)或掩蓋。也有可能是由于本研究的樣本量有限，導(dǎo)致未能檢測到icaD基因在不同生物被膜形成能力菌株中的顯著差異。未來需要進一步擴大樣本量，并結(jié)合功能研究，深入探討icaD基因在牛源金黃色葡萄球菌生物被膜形成中的具體作用機制。fnbA基因在不同生物被膜形成能力菌株中的檢出率雖有差異，但未達到統(tǒng)計學(xué)顯著水平（P>0.05）。fnbA基因編碼的纖連蛋白結(jié)合蛋白A（FnBPA）是一種重要的粘附素，能夠介導(dǎo)金黃色葡萄球菌與宿主細胞表面的纖連蛋白結(jié)合，促進細菌在宿主組織表面的粘附和定植。在生物被膜形成的初始階段，F(xiàn)nBPA可以幫助細菌快速附著在宿主細胞或生物材料表面，為后續(xù)生物被膜的形成奠定基礎(chǔ)。然而，本研究中fnbA基因的檢出率與生物被膜形成能力之間未呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性，可能是因為生物被膜的形成是一個復(fù)雜的過程，受到多種基因和因素的共同調(diào)控。除了fnbA基因外，其他粘附素基因、調(diào)控基因以及環(huán)境因素等都可能對生物被膜的形成產(chǎn)生影響，從而掩蓋了fnbA基因與生物被膜形成能力之間的關(guān)系。在某些情況下，即使菌株攜帶fnbA基因，但如果其他關(guān)鍵基因或因素缺失或異常，生物被膜的形成能力也可能受到影響。同時攜帶icaA、icaD和fnbA基因的菌株占總菌株數(shù)的41.7%，且隨著生物被膜形成能力的增強，同時攜帶這三個基因的菌株比例逐漸升高。這表明多個生物被膜相關(guān)基因之間可能存在協(xié)同作用，共同促進生物被膜的形成。icaA和icaD基因通過參與PIA的合成，為生物被膜提供結(jié)構(gòu)支撐；fnbA基因編碼的FnBPA則增強了細菌與宿主表面的粘附能力。當這些基因同時存在且正常表達時，它們的協(xié)同作用可能使得細菌在生物被膜形成過程中，既能有效地粘附在表面，又能通過PIA的合成構(gòu)建穩(wěn)定的生物被膜結(jié)構(gòu)，從而增強生物被膜的形成能力。在強生物被膜形成能力的菌株中，同時攜帶這三個基因的菌株比例較高，說明這些基因的協(xié)同作用在強生物被膜形成過程中可能更為關(guān)鍵。4.3耐藥性分析及耐藥機制探討本研究對寧夏地區(qū)120株牛源金黃色葡萄球菌進行了耐藥性檢測，結(jié)果顯示該地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌對多種常用抗生素存在不同程度的耐藥性。對青霉素的耐藥率最高，達到79.2%，這與青霉素在畜牧業(yè)中廣泛且長期的使用密切相關(guān)。長期大量使用青霉素，使得金黃色葡萄球菌受到強烈的藥物選擇壓力，促使其逐漸產(chǎn)生耐藥機制以適應(yīng)這種環(huán)境。對紅霉素的耐藥率也高達70.8%，同樣是因為紅霉素在臨床治療中頻繁應(yīng)用，導(dǎo)致菌株對其耐藥性不斷增加。對苯唑西林、四環(huán)素、克林霉素的耐藥率均超過50%，表明這些抗生素在治療牛源金黃色葡萄球菌感染時的效果可能受到較大影響。相對而言，對氟苯尼考的耐藥率較低，為25.0%，這可能是由于氟苯尼考在寧夏地區(qū)養(yǎng)牛業(yè)中的使用頻率相對較低，細菌尚未對其產(chǎn)生廣泛的耐藥性。對頭孢噻呋、恩諾沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率處于中等水平，分別為33.3%、37.5%、41.7%。多重耐藥菌株的比例高達66.7%，這表明寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的耐藥情況十分復(fù)雜，給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。多重耐藥菌株對3-8種抗生素耐藥，其中耐5種抗生素的菌株數(shù)量最多，占多重耐藥菌株總數(shù)的31.2%。這種復(fù)雜的耐藥譜特征可能是由于養(yǎng)殖場長期不合理使用多種抗生素，導(dǎo)致細菌在多種藥物的選擇壓力下，逐漸積累耐藥基因，從而形成多重耐藥菌株。在實際養(yǎng)殖過程中，一些養(yǎng)殖戶為了追求治療效果，往往隨意加大抗生素的使用劑量，或者同時使用多種抗生素，這種不規(guī)范的用藥行為加速了耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播。此外，抗生素在飼料和飲水中的濫用，也使得牛群長期處于低劑量抗生素的暴露環(huán)境中，進一步促進了細菌耐藥性的發(fā)展。牛源金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性的機制是多方面的。首先，細菌可以通過產(chǎn)生滅活酶來破壞抗生素的結(jié)構(gòu)，使其失去抗菌活性。對于β-內(nèi)酰胺類抗生素，金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，如blaZ基因編碼的青霉素酶，能夠水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使青霉素、頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類抗生素失去抗菌作用。攜帶blaZ基因的菌株能夠在含有β-內(nèi)酰胺類抗生素的環(huán)境中存活和繁殖，導(dǎo)致對這類抗生素的耐藥性。其次，細菌可以改變抗生素的作用靶點，使抗生素?zé)o法與之結(jié)合，從而產(chǎn)生耐藥性。例如，mecA基因編碼的青霉素結(jié)合蛋白2a（PBP2a），其與β-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力極低。當金黃色葡萄球菌攜帶mecA基因時，即使在β-內(nèi)酰胺類抗生素存在的情況下，PBP2a仍能發(fā)揮正常的細胞壁合成功能，使細菌繼續(xù)生長和繁殖，表現(xiàn)出對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性。在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）中，mecA基因的攜帶率通常較高，這也是MRSA對多種β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的重要原因。此外，細菌還可以通過主動外排機制將進入細胞內(nèi)的抗生素排出體外，降低細胞內(nèi)藥物濃度，使其無法達到有效殺菌濃度，從而產(chǎn)生耐藥性。norA基因編碼的外排泵能夠?qū)⒎Z酮類抗生素排出細胞外，導(dǎo)致細菌對氟喹諾酮類藥物耐藥。當金黃色葡萄球菌中norA基因表達上調(diào)時，外排泵的活性增強，更多的氟喹諾酮類抗生素被排出細胞，使得細菌對這類藥物的耐藥性增加。與其他地區(qū)的研究結(jié)果相比，寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的耐藥率和耐藥譜存在一定差異。在一些養(yǎng)殖密集且抗生素使用不規(guī)范的地區(qū)，牛源金黃色葡萄球菌對某些抗生素的耐藥率可能更高。在部分南方地區(qū)，由于氣候濕潤，養(yǎng)殖環(huán)境中細菌易于繁殖，且抗生素使用量較大，牛源金黃色葡萄球菌對青霉素、紅霉素等抗生素的耐藥率可能超過80%。而在一些管理規(guī)范、抗生素使用合理的地區(qū)，耐藥率相對較低。在一些現(xiàn)代化養(yǎng)殖場，通過嚴格控制抗生素的使用，加強養(yǎng)殖環(huán)境的衛(wèi)生管理，牛源金黃色葡萄球菌的耐藥率得到了有效控制。這些差異可能與當?shù)氐酿B(yǎng)殖模式、抗生素使用習(xí)慣、養(yǎng)殖環(huán)境等因素密切相關(guān)。在以散養(yǎng)為主的養(yǎng)殖模式下，牛群活動范圍廣，與外界環(huán)境接觸頻繁，容易感染耐藥菌株。而在規(guī)?；B(yǎng)殖模式下，如果管理不善，抗生素濫用現(xiàn)象可能更為嚴重，導(dǎo)致耐藥菌株的傳播和擴散。不同地區(qū)的氣候條件、飼料來源等也可能影響牛源金黃色葡萄球菌的耐藥性。在高溫高濕的環(huán)境中，細菌更容易產(chǎn)生耐藥性變異。飼料中可能存在的抗生素殘留，也會對牛源金黃色葡萄球菌的耐藥性產(chǎn)生影響。4.4研究的局限性與展望本研究雖在寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的生物被膜相關(guān)基因檢測及耐藥性研究方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在樣本采集方面，雖然覆蓋了寧夏地區(qū)多個主要養(yǎng)牛區(qū)域的不同規(guī)模和養(yǎng)殖模式的養(yǎng)牛場，但樣本數(shù)量相對有限，可能無法全面、準確地反映寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的真實分布和特性。不同季節(jié)和年份牛源金黃色葡萄球菌的生物被膜形成能力和耐藥性可能存在差異，本研究僅在2024年3月至2024年10月期間采集樣本，無法探究這種時間因素對研究結(jié)果的影響。在生物被膜相關(guān)基因檢測方面，僅檢測了icaA、icaD、fnbA等部分生物被膜相關(guān)基因，對于其他可能參與生物被膜形成的基因，如atl、sarA、agr等未進行檢測，可能遺漏一些重要的基因信息，影響對生物被膜形成機制的全面理解。在耐藥性檢測中，雖然選取了10種常用抗生素，但隨著新型抗生素的不斷研發(fā)和應(yīng)用，以及細菌耐藥譜的動態(tài)變化，本研究結(jié)果可能無法完全反映牛源金黃色葡萄球菌對所有抗生素的耐藥情況。對于耐藥機制的研究，僅從基因?qū)用孢M行了初步探討，未深入研