第四章蛋白質天然界的生物多種多樣，因而蛋白質的

提要種類和功能也十分繁多。概括起來，蛋白質

一.概念主要有以下功能：

容易蛋白、結合蛋白、基本氨基酸、等1.催化功能生物體內的酶都是由蛋白

電點、甲醛滴定法、Edman降解、一級結構、質構成的，它們有機體新陳代謝的催化劑，

肽鍵、構型與構象、二面角、二級結構、超沒有酷，生物體內的各種化學反應就無法正

二級結構、結構域、三級結構、四級結構、常舉行。例如，沒有淀粉酶，淀粉就不能被

亞基、別構蛋白、分子病、水化層、雙電層、分解利用。

蛋白質的變性與復性、鹽析與鹽溶2.結構功能蛋白質可以作為生物體的

二.氨基酸結構成分。在高等動物里，膠原是主要的細

分類、基本氨基酸的結構、分類、名稱、胞外結構蛋白，參加結締組織和骨骼作為身

符號、化學反應、鑒定、蛋白質的水解體的支架，占蛋白總量的1/4。細胞里的片層

三.蛋白質的結構結構，如細胞膜、線粒體、葉綠體和內質網

一級結構結構特點、測定步驟、常用主等都是由不溶性蛋白與脂類組成的。動物的

意、酶毛發(fā)和指甲都是由角蛋白構成的。

二級結構四種結構特點、數(shù)據(jù)、超二3.運輸功能脊椎動物紅細胞中的血紅

級結構蛋白和無脊椎動物體內的血藍蛋白在呼吸過

三級結構主要靠疏水鍵維持程中起著運輸氧氣的作用。血液中的載脂蛋

四級結構變構現(xiàn)象白可運輸脂肪，轉鐵蛋白可轉運鐵。一些脂

結構與功能的適應、結構變化對功能的溶性激素的運輸也需要蛋白，如甲狀腺素要

影響、典型蛋白質與甲狀腺素結合球蛋白結合才干在血液中運

四.蛋白質的性質輸。

分子量的測定主意、酸堿性、溶解性、4.儲藏功能某些蛋白質的作用是儲藏

變性、色彩反應氨基酸作為生物體的養(yǎng)料和胚胎或幼兒生長

第一節(jié)蛋白質通論發(fā)育的原料。此類蛋白質包括蛋類中的卵清

一、蛋白質的功能多樣性蛋白、奶類中的酪蛋白和小麥種子中的麥醉

蛋白質是原生質的主要成分，任何生物溶蛋白等。肝臟中的鐵蛋白可將血液中多余

都含有蛋白質。天然界中最小、最容易的生的鐵儲存起來，供缺鐵時使用。

物是病毒，它是由蛋白質和核酸組成的。沒5.運動功能肌肉中的肌球蛋白和肌動

有蛋白質也就沒有生命。蛋白是運動系統(tǒng)的須要成分，它們構象的改

第21頁/共28頁

千里之行，始于足下

變引起肌肉的收縮，帶動機體運動。細菌中抗體等。球狀蛋白的長度與直徑之比普通小

的鞭毛蛋白有類似的作用，它的收縮引起鞭于10o

毛的擺動，從而使細菌在水中游動。2.纖維狀蛋白形狀細長，分子量大，大

6.防御功能高等動物的免疫反應是機都是結構蛋白，如膠原蛋白，彈性蛋白，角

體的一種防御機能，它主要也是通過蛋白質蛋白等。纖維蛋白按溶解性可分為可溶性纖

（抗體）來實現(xiàn)的。凝血與纖溶系統(tǒng)的蛋白維蛋白與不溶性纖維蛋白。前者如血液中的

因子、溶菌的、干擾素等，也擔負著防御和纖維蛋白原、肌肉中的肌球蛋白等，后者如

保護功能。膠原蛋白，彈性蛋白，角蛋白等結構蛋白，

7.調節(jié)功能某些激素、一切激素受體和（二）按分子組成分類

許多其他調節(jié)因子都是蛋白質。1.容易蛋白徹低由氨基酸組成，不含非

8.信息傳遞功能生物體內的信息傳遞蛋白成分。如血清清蛋白等。按照溶解性的

過程也離不開蛋白質。例如，視覺信息的傳不同，可將容易蛋白分為以下7類：清蛋白、

遞要有視紫紅質參加，感觸滋味需要味覺蛋球蛋白、組蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋

白。視桿細胞中的視紫紅質，只需1個光子白和硬蛋白。

即可被激發(fā)，產生視覺。2.結合蛋白由蛋白質和非蛋白成分組

9.遺傳調控功能遺傳信息的儲存和表成，后者稱為輔基。按照輔基的不同，可將

達都與蛋白質有關。DNA在儲存時是纏繞在結合蛋白分為以下7類：核蛋白、脂蛋白、

蛋白質（組蛋白）上的。有些蛋白質，如阻糖蛋白、磷蛋白、血紅素蛋白、黃素蛋白和

遏蛋白，與特定基因的表達有關。半乳金屬蛋白。

糖苜酶基因的表達受到種阻遏蛋白的抑三、蛋白質的元素組成與分了量

制，當需要合成B一半乳糖昔酶時經過去阻1.元素組成所有的蛋白質都含有碳氫

遏作用才干表達。氧氮四種元素，有些蛋白質還含有硫、磷和

10.其他功能某些生物能合成有毒的蛋一些金屬元素。

白質，用以襲擊或自衛(wèi)。如某些植物在被昆蛋白質平均含碳50%,氫7%,氧23%,

蟲咬過以后會產生一種毒蛋白。白喉毒素可氮16%。其中氮的含量較為恒定，而且在糖

抑制生物蛋白質合成。和脂類中不含氮，所以常通過測量樣品中氮

二、蛋白質的分類的含量來測定蛋白質含量。如常用的凱氏定

（一）按分子形狀分類氮：

1.球狀蛋白形狀近似球體，多溶于水，蛋白質含量=蛋白氮X6.25

大都具有活性，如酶、轉運蛋白、蛋白激素、

其中6.25是16%的倒數(shù)。

第22頁/共28頁

朽木易折，金石可鏤

2.蛋白質的分子量蛋白質的分子量變(-)基本氨基酸

化范圍很大,從6000至大00萬或更大。這個組成蛋白質的20種氨基酸稱為基本氮

范圍是人為規(guī)定的。普通將分子量:小于6000基酸。它們中除脯氨酸外都是。?氨基酸，即

的稱為肽。不過這個界限不是絕對的，如牛在Q-碳原子上有一個氨基。基本氨基酸都符

胰島素分子量為5700,普通仍認為是蛋白質。合通式，都有單字母和三字母縮寫符號。

蛋白質煮沸凝結，而肽不凝結。較大的蛋白按照氨基酸的側鏈結構，可分為三類：

質如煙草花葉病毒，分子量達400()萬。脂肪族氨基酸、芬芳族氨基酸和雜環(huán)氨基酸。

四、蛋白質的水解1.脂肪族氨基酸共15種。

氨基酸是蛋白質的基本結構單位，這個側鏈只是是鏈：Gly,Ala,Vai,Leu,He后

發(fā)現(xiàn)是從蛋白質的水解得到的。蛋白質的水三種帶有支鏈，人體不能合成，是必須氨基

解主要有三種主意：酸。

1.酸水解用6MH?；?MH2so4,105℃?zhèn)孺満辛u基：Ser,Thr許多蛋白酶的活

回流2()小時即可徹低水解。酸水解不引起氨性中央含有絲氨酸，它還在蛋白質與糖類及

基酸的消旋，但色氨酸徹低被破壞，絲氨酸磷酸的結合中起重要作用。

和蘇氨酸部分破壞，天冬酰胺和谷氨酰胺的側鏈含硫原子：Cys,Met兩個半胱氨酸

酰胺基被水解。如樣品含有雜質，在酸水解可通過形成二硫鍵結合成一個胱氨酸。二疏

過程中常產生腐黑質，使水解液變黑。川鍵對維持蛋白質的高級結構有重要意義。半

3moi/L對甲苯磺酸代替鹽酸，得到色氨酸較胱氨酸也常常浮上在蛋白質的活性中央里，

多，可像絲氨酸和蘇氨酸一樣用外推法求其甲硫氨酸的硫原子偶爾參加形成配位鍵。甲

含量。硫氨酸可作為通用甲基供體，參加多種分了

2.堿水解用5MNaOH,水解10—20小的甲基化反應。

時可水解徹低。堿水解使氨基酸消旋，許多側鏈含有竣基:Asp(D),Glu(E)

氨基酸被破壞，但色氨酸不被破壞。常用于側鏈含酰胺基:Asn(N),Gln(Q)

測定色氨酸含量?？蓞⒓拥矸垡苑乐寡趸孺滐@堿性：Arg(R),Lys(K)

3.酶水解酶水解既不破壞氨基酸，也不2.芬芳族氨基酸包括苯丙氨酸(Phe,F)

引起消旋。但酶水解時光長，反應不徹低。和酪氨酸(Tyr,Y)兩種。酪氨酸是合成甲狀腺

普通用于部分水解，若要徹低水解.，需要用素的原料。

多種酶協(xié)同作用。3.雜環(huán)氨基酸包括色氨酸(Trp,W)、組氨

第二節(jié)氨基酸酸(His)和脯氨酸(Pro)三種。其中的色氨酸與

一、氨基酸的結構與分類芬芳族氨基酸都含苯環(huán)，都有紫外吸收

第23頁/共28頁

千里之行，始于足下

(280nm)o所以可通過測量蛋白質的紫外吸收酸的中間產物，丙氨酸是遍多酸(泛酸，

來測定蛋白質的含量。組氨酸也是堿性氨基輔酶A前體)的前體，丫?氨基丁酸是傳遞神

酸，但堿性較弱，在生理條件下是否帶電與經沖動的化學介質。

周圍內環(huán)境有關。它在活性中央常起傳遞電二、氨基酸的性質

荷的作用。組氨酸能與鐵等金屬離子配位。(-)物理性質

脯氨酸是唯一的仲氨基酸，是螺旋的破壞a-氨基酸都是白色晶體，每種氨基酸都

者。有異常的結晶形狀，可以用來鑒別各種氨基

B是指Asx,即Asp或Asn；Z是指Glx,酸。除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中，

即Glu或Gino脯氨酸和羥膽氨酸還能溶于乙醇或乙醛中，

基本氨基酸也可按側鏈極性分類：除甘氨酸外，。?氨基酸都有旋光性，a

非極性氨基酸:Ala,Vai,Leu,He,Met,-碳原子具有手性。蘇氨酸和異鳧氨酸有兩個

Phe,Trp,Pro共八種手性碳原子。從蛋白質水解得到的氨基酸都

極性不帶電荷：Gly,Ser,Thr,Cys,Asn,是L-型。但在生物體內異常是細菌中，D-氨

Gin,Tyr共七種基酸也存在，如細菌的細胞壁和某些抗菌素

帶正電荷：Arg,Lys,His中都含有D-氨基酸。

帶負電荷：Asp.Glu三個帶苯環(huán)的氨基酸有紫外吸收，

(二)不常見的蛋白質氨基酸F:257nm,e=200;Y:275nm,￡=14(X);

某些蛋白質中含有一些不常見的氨基W:28()nm,e=5600。通常蛋白質的紫外吸收

酸，它們是基本氨基酸在蛋白質合成以后經主要是后兩個氨基酸決定的，普通在280nmo

羥化、瘦化、甲基化等修飾衍生而來的。也氨基酸分了中既含有氨基乂含有按基，

叫稀少氨基酸或異常氨基酸。如4-羥腑氨酸、在水溶液中以偶極離子的形式存在。所以氨

5-羥賴氨酸、鎖鏈素等。其中羥脯氨酸和羥基酸品體是離子晶體，熔點在200℃以上。

賴氨酸在膠原和彈性蛋白中含量較多。在甲氨基酸是兩性電解質，各個解離基的表觀解

狀腺素中還有3,5?二碘酪氨酸。離常數(shù)按其酸性強度遞降的順序，分離以

(三)非蛋白質氨基酸KI'、K2'來表示。當氨基酸分子所帶的凈

天然界中還有150多種不參加構成蛋白電荷為零時的pH稱為氨基酸的等電點(pl)。

質的氨基酸。它們大多是基本氨基酸的衍生等電點的值是它在等電點前后的兩個pK'值

物，也有一些是D-氨基酸或B、丫、3-氨基的算術平均值。

酸。這些氨基酸中有些是重要的代謝物前體氨基酸徹低質子化時可看作多元弱酸，

或中間產物，如瓜氨酸和鳥氨酸是合成精氨各解離基團的表觀解離常數(shù)按酸性削弱的順

第24頁/共28頁

朽木易折，金石可鏤

序，以pKI'、pK2'、pK3,表示。氨基在硝基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成相應

酸可作為緩沖溶液，在pK'處的緩沖能力最的苯乙內酰硫胭衍生物（PTH-AA）o這些衍

強，pl處的緩沖能力最弱。生物是無色的，可用層析法加以分離鑒定,

氨基酸的滴定曲線如圖。這個反應首先為Edman用來鑒定蛋白質的

（二）化學性質N.末端氨基酸，在蛋白質的氨基酸順序分析

1.氨基的反應方面占有重要地位。

（1）?；?）磺?；?/p>

氨基可與酰化試劑，如酰氯或酸酎在堿氨基酸與5-（二甲胺基）奈-1-磺酰氯

性溶液中反應，生成酰胺。該反應在多肽合（DNS-C1）反應，生成DNS-氨基酸。產物在酸

成中可用于保護氨基。性條件下（6NHCD100C也不破壞，因此可R]

（2）與亞硝酸作用于氨基酸末端分析。DNS-氨基酸有強熒光，

氨基酸在室溫下與亞硝酸反應，脫氨，激發(fā)波長在360nm左右，比較靈巧，可用于

生成羥基竣酸和氮氣。因為伯胺都有這個反微量分析。

應，所以賴氨酸的側鏈氨基也能反應，但速（6）與DNFB反應

度較慢。常用于蛋白質的化學修飾、水解程氨基酸與2,4?二硝基氟苯（口W8）在弱堿

度測定及氨基酸的定量。性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸（DNP

（3）與醛反應氨基酸）。這一反應是定量改變的，產物黃色,

氨基酸的a-氨基能與醛類物質反應，生可經歷酸性100C高溫。該反應曾被英國的

成西佛堿-C二N-。西佛堿是氨基酸作為底物的Sanger用來測定胰島素的氨基酸順序，也叫

某些酶促反應的中間物。賴氨酸的側鏈氨基桑格爾試劑，現(xiàn)在應用丁蛋白質N-末端測定。

也能反應。氨基還可以與甲醛反應，生成羥（7）轉氨反應

甲基化合物。因為氨基酸在溶液中以偶極離在轉氨酶的催化下，氨基酸可脫去氨芯,

子形式存在，所以不能用酸堿滴定測定含量。變成相應的酮酸。

與甲醛反應后，氨基酸不再是偶極離子，其2.竣基的反應

滴定盡頭可用普通的酸堿指示劑指示，因而峻基可與堿作用生成鹽，其中重金屬鹽

可以滴定，這叫甲醛滴定法，可用于測定氨不溶于水。粉基可與醇生成酯，此反應常用

基酸。于多肽合成中的陵基保護。某些酯有活化作

（4）與異硫銀酸苯酯（PIT。反應用，可增強竣基活性，如對硝基苯酯。將氨

a.氨基與PITC在弱堿性條件下形成相基保護以后，可與二氯亞碉或五氯化磷作用

應的苯氨基硫甲酰衍生物（PTCAA）,后者生成酰氯，在多肽合成中用于活化粉基。在

第25頁/共28頁

千里之行，始于足下

脫救酶的催化下，可脫去竣基，形成伯胺。含疏基的酶失活。

3瑋三酮反應5.以下反應常用于氨基酸的檢驗：

氨基酸與荀三酮在微酸性溶液中加熱，1酪氨酸、組氨酸能與重氮化合物反

最后生成藍色物質。而脯氨酸生成黃色化合應(Pauly反應)，可用于定性、定量測定。組

物。按照這個反應可通過二氧化碳測定氨基氨酸生成棕紇色的化合物，酪氨酸為桔黃色。

酸含量。1精氨酸在氫氧化鈉中與1-蔡酚和次

4.側鏈的反應浪酸鈉反應，生成深紅色，稱為坂口反應，

絲氨酸、蘇氨酸含羥基，能形成酯或昔。用于弧基的鑒定。

半胱氨酸側鏈筑基反應性高：1酪氨酸與硝酸、亞硝酸、硝酸汞和亞

(1)：硫鍵(disulfidebond)硝酸汞反應，生成白色沉淀，加熱后變紅，

半胱氨酸在堿性溶液中容易被氧化形成稱為米倫反應，是鑒定酚基的特性反應。

二硫鍵，生成胱氨酸。胱氨酸中的二硫鍵在1色氨酸中參加乙醛酸后再緩慢參加

形成蛋白質的構象上起很大的作用。氧化劑濃硫酸，在界面會浮上紫色環(huán)，用于鑒定口引

和還原劑都可以打開二硫鍵。在研究蛋白質口朵基。

結構時，氧化劑過甲酸可以定量地拆開二硫在蛋白質中，有些側鏈基團被包裹在蛋

鍵，生成相應的磺酸。還原劑如臻基乙醇、白質內部，因而反應很慢甚至不反應。

臻基乙酸也能拆開二硫鍵，生成相應的藻基三、色譜與氨基酸的分析分離

化合物。因為半胱氨酸中的疏基很不穩(wěn)定，1.色譜(chromatography)的發(fā)展史

極易氧化，因此利用還原劑拆開二硫鍵時，最早的層析實驗是俄國植物學家IIBe

往往進步用碘乙酰胺、氯化葦、N-乙基丁T在1903年用碳酸鈣分離葉綠素，屬丁吸附

烯二亞酰胺和對氯汞苯甲酸等試劑與疏基作層析。4()年代浮上了分配層析，50年代浮上

用，把它保護起來，防止它重新氧化。了氣相色譜，60年代浮上HPLC,80年代浮

(2)烷化上了超臨界層析，90年代浮上的超微量

半胱氨酸可與烷基試劑，如碘乙酸、碘HPLC可分凄ng級的樣品。

乙酰胺等發(fā)生烷化反應。2.色譜的分類：

半胱氨酸與丫丙咤反應，生成帶正電的按流動相可分為氣相、液相、超臨界色

側鏈，稱為S-氨乙基半胱氨酸(AECys)o譜等；

(3)與重金屬反應按介質可分為紙層析、薄層層析、柱層

極微量的某些重金屬離子，如Ag+、析等；

Hg2+,就能與臻基反應，生成硫醇鹽，導致按分離機制可分為吸附層析、分配層析、

第26頁/共28頁

朽木易折，金石可鏤

分子篩層析等肽鍵象酰胺鍵一樣，因為鍵內原子處于

3.色譜的應用共振狀態(tài)而表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。在肽鍵中

可用于分離、制備、純度鑒定等。C-N單鍵具有約40%雙鍵性質，而C=O雙

定性可通過保留值、內標、標準曲線等鍵具有40%單鍵性質。這樣就產生兩個重要

主意，定量普通用標準曲線法。結果：（1）肽鍵的亞氨基在pH0-14的范圍

氨基酸的分析分離是測定蛋白質結構的內沒有顯然的解離和質子化的傾向；（2）肽

基礎。在分配層析和離子交換層析法開始應鍵中的C-N單鍵不能自由旋轉，使蛋白質

用于氨基酸成分分析之后，蛋白質結構的研能折疊成各種三維構象。

究才取得了顯著的成就?，F(xiàn)在這些主意已自除了蛋白質部分水解可以產生各種容易

動化。的多肽以外，天然界中還有長短不等的小肽,

氨基酸從強酸型離子交換柱的洗脫順序它們具有異常的生理功能。

如下：動植物細胞中含有一種三肽，稱為谷胱

Asp,Thr,Ser,Glu,Pro,Gly,Ala,Cys,Val,Met,甘肽，即6-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。因其含

Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,（NH3）,Arg有筑基，故常以GSH來表示。它在體內的氧

第三節(jié)蛋白質的一級結構化還原過程中起重要作用。腦啡肽是天然止

蛋白質是生物大分子，具有顯然的結痛劑。肌肉中的鵝肌肽是一個二肽，即B■丙

構層次性，由低層到高層可分為一級結構、氨酰組氨酸。肌肽可作為肌肉中的緩沖劑，

二級結構、三級結構和四級結構。緩沖肌肉產生的乳酸對pH的影響。一種抗

一、肽鍵和肽菌素叫做短桿菌酪肽，由12種氨基酸組成，

個氨基酸的瘦基與另個氨基酸的氨其中有幾種是D?氨基酸。這些天然肽中的非

基縮水形成的共價鍵，稱為肽鍵。在蛋白質蛋白質氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。許

分子中，氨基酸借肽鍵銜接起來，形成肽鏈。多激素也是多肽，如催產素、加壓素、舒緩

最容易的肽由兩個氨基酸組成，稱為二激肽等。

肽。含有三、四、五個氨基酸的肽分離稱為二、肽的理化性質

三肽、四肽、五肽等。肽鏈中的氨基酸因為小肽的理化性質與氨基酸類似。許多小

形成肽鍵時脫水，已不是殘破的氨基酸，所肽已經結品。品體的熔點很高，說明是離子

以稱為殘基。肽的命名是按照組成肽的氨基品體，在水溶液中以偶極離子存在。肽鍵的

酸殘基來決定的。普通從肽的氨基端開始，亞氨基不解離，所以肽的酸堿性取決于肽的

稱為某氨基酰某氨基酰…某氨基酸。肽的書末端氨基、竣基和側鏈上的基團。在長肽或

寫也是從氨基端開始。蛋白質中，可解離的基團主要是側鏈上的,

第27頁/共28頁

千里之行，始于足下

肽中末端竣基的pK'比自由氨基酸的稍大，

而末端氨基的pK'則稍小。側鏈基團變化不3.肽鏈的一部分樣品舉行徹低水解，測

大。定其氨基酸組成和比例。

肽的滴定曲線和氨基酸的很相似。肽的4.肽鏈的另一部分樣品舉行N末端和C

等電點也可以按照它的pK'值決定。末端的鑒定。

普通小肽的旋光度等于各個氨基酸旋光5.拆開肽鏈內部的二硫鍵。

度的總和，但較大的肽或蛋白質的旋光度不6.肽鏈用酶促或化學的部分水解主意

等于其組成氨基酸的旋光度的容易加和。降解成一套大小不等的肽段，并將各個肽段

肽的化學性質和氨基酸一樣，但有一些分離出來。

異常的反應，如雙縮服反應。普通含有兩個7.測定每個肽段的氨基酸順序。

或兩個以上肽鍵的化合物都能與CuSO4堿8.從第二步得到的肽鏈樣品再用另一種

性溶液發(fā)生雙縮服反應而生成紫紅色或藍紫部分水解主意水解成另一套肽段，其斷裂點

色的復合物。利用這個反應可以測定蛋白質與第五步不同。分離肽段并測序。比較兩套

的含量。肽段的氨基酸順序，按照其重疊部分拼湊出

囪冏肽鏈的氨基酸順序。

三、一級結構的測定9.測定本來的多肽鏈中二硫鍵和酰胺

（-）一級結構基的位置。

蛋白質的一級結構是指肽鏈的氨基酸組（三）常用主意

成及其羅列順序。氨基酸序列是蛋白質分子1.末端分析

結構的基礎，它決定蛋白質的高級結構。（1）N木端

級結構可用氨基酸的三字母符號或單字母符蛋白質的末端氨基與2,4-二硝基氟苯

號表示，從N?末端向C-末端書寫。采用三字（DNFB）在弱堿性溶液中作用生成二硝基苯

母符號時，氨基酸之間用連字符（一）隔開?；鞍踪|（DNP-蛋白質）。產物黃色，可經

（二）測定步驟歷酸性100℃高溫。水解時，肽鏈斷開，但

測定蛋白質的一級結構，要求樣品必須DNP基并不脫落。DNP?氨基酸能溶于有機溶

是均一的（純度大于97%）而且是已知分子劑（如乙醛）中，這樣可與其他氨基酸和￡

量的蛋白質。普通的測定步驟是：-DNP賴氨酸分開。再經雙向濾紙層析或柱層

1.通過末端分析決定蛋白質分子山幾條析，可以鑒定黃色的DNP氨基酸。

肽鏈構丹磺酰氯法是更靈巧的主意。蛋白質的

2.將每條肽鏈分開，并分離提純。末端氨基與5-（二甲胺基）茶磺酰氯

第28頁/共28頁

朽木易折，金石可鏤

(DNS-C1)反應,生成DNS-蛋白質。DNS-氨C末端氨基酸的羅列順序。粉肽酶A水解除

基酸有強熒光，激發(fā)波長在36()nm左右，比精氨酸、賴氨酸和脯氨酸外所有肽鍵，裝肽

DNFB法靈巧100(go酶B水解精氨酸和賴氨酸。

目前應用最廣泛的是異硫制酸苯酯2.二硫鍵的拆開和肽鏈的分離

(PITC)法。末端氨基與PITC在弱堿性條件下普通情況下，蛋白質分子中肽鏈的數(shù)目

形成相應的苯氨基硫中酰衍生物，后者在硝應等于N末端氨基酸殘基的數(shù)目，可按照末

基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成相應的茉端分析來決定一種蛋白質由幾條肽鏈構成，

乙內酰硫眠衍生物而從肽鏈上掉下來。產物必須設法把這些肽鏈分離開來，然后測定每

可用氣-液色譜法舉行鑒定。這個主意最大的條肽鏈的氨基酸順序。倘若這些肽鏈之間不

優(yōu)點是剩下的肽鏈仍是殘破的，可依照此法是共價交聯(lián)的，可用酸、堿、高濃度的鹽或

重復測定新生的N末端氨基酸?，F(xiàn)在已經有其他變性劑史理蛋白質，把肽鏈分開。倘若

全自動的氨基酸順序分析儀，可測定含2()個肽鏈之間以二硫鍵交聯(lián)，或肽鏈中含有鏈為

以上氨基酸的肽段的氨基酸順序。缺點是不二硫鍵，則必須用氧化或還原的主意將二疏

如丹磺酰氯靈巧，可與之結合使用。鍵拆開。最普遍的主意是用過量的疏基乙醇

N末端氨基酸也可用酶學主意即氨肽酶處理，然后用碘乙酸保護生成的半胱氨酸的

法測定。筑基，防止重新氧化。二硫鍵拆開后形成的

(2)C末端個別肽鏈，可用紙層析、離子交換柱層析、

a)C末端氨基酸可用硼氫化鋰還原生成電泳等主意舉行分離。

相應的。氨基醇。肽鏈水解后，再用層析法3.肽鏈的徹低水解和氨基酸組成的測

鑒定。有斷裂干擾。定。

b)另一個主意是朋解法。多肽與肺在無在測定氨基酸順序之前，需要知道多肽

水條件下加熱，可以斷裂所有的肽鍵，除C鏈的氨基酸組成和比例。普通用酸水解，得

末端氨基酸外，其他氨基酸都改變?yōu)橄鄳牡桨被峄旌衔?，再分離測定氨基酸。目前

酰腫化合物。脫解下來的C末端氨基酸可用用氨基酸自罰分析儀，2—4小時即可完成。

紙層析鑒定。精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨蛋白質的氨基酸組成.，普通用每分子蛋

酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。白質中所含的氨基酸分子數(shù)表示。不同種類

c)也可用竣肽酶法鑒定。將蛋白質在pH的蛋白質，其氨基酸組成相差很大。

8.0,30℃與峻肽酶一起保溫，按一定時光間4.肽鏈的部分水解和肽段的分離

隔取樣，用紙層析測定釋放出來的氨基酸，當肽鏈的氨基酸組成及N末端和C末端

按照氨基酸的量與時光的關系，就可以知道已知后，隨后的步驟是肽鏈的部分水解。這

第29頁/共28頁

千里之行，始于足下

是測序工作的關鍵步驟。這一步通常用專一以.上主意中，酶不能水解脯氨酸參加形

性很強的蛋白酶來完成。成的肽鍵。

最常用的是胰蛋白酶（trypsin）,它專門多肽部分水解后，降解成長短不一的小

水解賴氨酸和精氨酸的竣基形成的肽鍵，所肽段，可用層析或電泳加以分離提純。常常

以生成的肽段之一的C末端是賴氨酸或精氨用雙向層析或電泳分離，再用苛三酮顯色.

酸。用丫丙咤處理，可增強酶切位點（半胱所得的圖譜稱為肽指紋譜。

氨酸）；用馬來酸酊（順丁烯二酸酎）保護賴5.多肽鏈中氨基酸順序的測定

氨酸的側鏈氨基，或用1,2.環(huán)己二酮修飾精從多肽鏈中部分水解得到的肽段可用化

氨酸的胭基，可減少酶切位點。學法或酶法測序，然后比較用不同主意獲得

常常使用的還有糜蛋白酶，水解苯丙氨的兩套肽段的氨基酸順序，按照它們彼此重

酸、酪氨酸、色氨酸等疏水殘基的竣基形成疊的部分，決定每個肽段的適當位置，拼湊

的肽鍵。其他疏水殘基反應較慢。出囪冏多肽鏈的氨基酸順序。

用漠化新處理，可斷裂甲硫氨酸的按基6.二硫鍵位置的決定

形成的肽鍵。水解后甲硫氨酸殘基改變?yōu)镃普通用蛋白酶水解帶有二硫鍵的蛋白

末端高絲氨酸殘基。以上三種主意常常使用。質，從部分水解產物中分離出含二硫鍵的肽

胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶。前者水解疏段，再拆開二硫鍵，將兩個肽段分離測序，

水殘基之間的肽鍵，后者水解疏水殘基的氨再與囪冏多肽鏈比較，即可決定二硫鍵的位

基形成的肽鍵。置。常用胃蛋白酶，因其專一性低，生成的

金葡菌蛋白酶，乂稱谷氨酸蛋白酶或V8肽段小，容易分離和鑒定，而且可在酸性條

蛋白酶，水解谷氨酸和天冬氨酸的瘦基形成

件下作用（PH2）,此時二硫鍵穩(wěn)定。肽段的

的肽鍵，但受緩沖液影響。在醋酸緩沖液中分離可用對角線電泳，將混合物點到濾紙的

只水解谷氨酸，在磷酸緩沖液中還可水解天中央，在pH6.5舉行第一次電泳，然后用過

冬氨酸。甲酸蒸汽斷裂二硫鍵，使含二硫鍵的肽段變

梭狀芽胞桿菌蛋白酶，水解精氨酸粉基成一對含半胱氨磺酸的肽段。將濾紙旋轉90

形成的肽鍵，乂稱精氨酸蛋白酶。耐變性劑,度后在相同條件下舉行第二次電泳，多數(shù)肽

可經歷6M尿素2小時。可用于水解不易溶段遷移率不變，處于對角線上，而含半胱氨

解的蛋白?；撬岬碾亩我蜇撾姾稍鰪姸x對角線。用

凝血酶，水解Arg-Gly肽鍵。前三酮顯色，分離，測序，與多肽鏈比較，

羥胺可水解Asn-Gly,但Asn-Leu和即可決定二硫鍵位置。

Asn-Ala也能部分裂解。四、多肽合成

第30頁/共28頁

朽木易折，金石可鏤

多肽的人工合成有兩種類型，一種是由保證氨基在自山狀態(tài)即可。

不同氨基酸按照一定順序羅列的控制合成，近年來因相多肽合成疾馳發(fā)展。在固相

另一種是由一種或兩種氨基酸聚合或共聚合成中，肽鏈的逐步延伸是在不溶的聚苯乙

合?？刂坪铣傻囊粋€艱難是舉行接肽反應所烯樹脂小圓珠上舉行的。合成多肽的按基端

需的試劑，能同時和其他官能團反應。因此先和氯甲基聚苯乙烯樹脂反應，形成節(jié)酯，

在按肽以前必須首先將這些基團加以封閉或第二個氨基酸的氨基用叔丁氧甲?；Ｗo

保護，肽鍵形成后再除去保護基。這樣每銜后，以DCCI為縮合劑，接在第一個氨基酸

接一個氨基酸殘基都要經過幾個步驟，要得的氨基上。重復這個主意，可使肽鏈按一定

到較長的肽鏈就必須每步都有較高的產率。順序延伸。最后把樹脂懸浮在無水三瓶乙酸

倘若每一步反應產率都是90%,那么3()次反中，通入干燥HBr,使多肽與樹脂分離，同

應后總產率惟獨4.24%。時除去保護基。囪冏合成過程現(xiàn)在已經可以

保護基必須在接肽時起保護作用，在接在自動化固相多肽合成儀上舉行。平均合成

肽后容易除去，又不引起肽鍵斷裂。最常用每個肽鍵只需三小時。此法可用于醫(yī)藥工業(yè)。

的氨基保護基Y是節(jié)氧甲?；?，可用催化加人工合成的催產素沒有混雜的加壓素，比提

氫或用金屬鈉在液氨中處理除去。其他還有取的天然藥品好。已經勝利合成含124個殘

三苯甲基、叔丁氧甲酰基等，可用稀鹽酸或基的蛋白。

乙酸在室溫下除去。第四節(jié)蛋白質的高級結構

竣基保護基Z通常用烷基，如乙基，可蛋白質的多肽鏈并不是線形舒展的，

在室溫下皂化除去。如用節(jié)基，可用催化加而是按一定方式折疊盤繞成特有的空間結

氫除去。構。蛋白質的三維構象，也稱空間結構或高

肽鍵不能自發(fā)形成，常用縮合劑促進肽級結構，是指蛋白質分子中原子和基團在三

鍵形成。接肽用的縮合劑最有效的是N,N'-維空間上的羅列、分布及肽鏈的走向。高級

二環(huán)己基碳二亞胺(DCCI)。DCCI從兩個氨結構是蛋白質表現(xiàn)其生物功能或活性所必須

基酸分子中奪取一分子水，自身變?yōu)椴蝗艿牡?，包括二級、三級和四級結構。Primary

N,N'一二環(huán)己基眼，從反應液中沉淀出來，structure,secondary,tertiary,quaternary

可過濾除去。接肽反應除用縮合劑以外，還structure

可用分離活化參加形成肽鍵的峻基和氨基的一、有關概念

主意。陵基活化可用疊氮化物法和活化酯法1.構型configration與構象conformation

(對硝基苯酯)等；氨基活化普通不需異常構型指立體異構體中取代原子或基團在

手段，通常在接肽時參加有機堿，如三乙胺,空間的取向，構型的改變必須通過共價鍵的

第31頁/共28頁

千里之行，始于足下

斷裂。構象是指這些取代基團當單鍵旋轉時La螺旋（a-helix）a螺旋模型是

可能形成的不同的立體結構，構象的改變不Pauling和Ccrey等研究a-角蛋白時于1951

涉及共價鍵的改變。年提出的。角蛋白是動物的不溶性纖維狀蛋

2.二面角白，是由動物的表皮衍生而來的。它包括皮

因為肽鍵不能自由旋轉，所以肽鍵的四膚的表皮以及毛發(fā)、鱗、羽、中、蹄、角、

個原子和與之相連的兩個o碳原子共處一個絲等。角蛋白可分為兩類，一類是Q角蛋白，

平面，稱肽平面。肽平面內的C=O與N-H胱氨酸含量豐盛，如角、甲、蹄的蛋白胱氨

呈反式羅列，各原子間的鍵長和鍵角都是固酸含量高達22%；另一類是B角蛋白，不含

定的。肽鏈可看作由一系列剛性的肽平面通胱氨酸，但甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸的含量

過。碳原子銜接起來的長鏈，主鏈的構象就很高，蠶絲絲心蛋白就屬于這一類。。角蛋

是由肽平面之間的角度決定的。主鏈上惟獨白，如頭發(fā)，裸露于濕熱環(huán)境中幾乎可以伸

a碳原子銜接的兩個鍵是單鍵，可自由旋轉。長一倍，冷去】干燥后又收縮到本來長度。B

繞CQ-N1旋轉的角稱①，而繞Ca-C2角蛋白則無此變化。

旋轉的角稱中。這兩個角稱為二面角。規(guī)定a角蛋白的X射線衍射圖案極其相似，

當旋轉鍵兩側的肽鏈成順式時為。度。取值沿長軸方向都有一個大周期結構或重復單

范闈是正負18（）度，當二面角都是180度時位,其長度為5—5.5埃。Pauling等考慮到肽

肽鏈徹低舒展。因為空間位阻，實際的取值平面向多肽鏈構象的限制作用，設計了多肽

范闈是很有限的。鏈折聳的各種可能模型，發(fā)現(xiàn)其中一種a螺

二、二級結構旋模型能很好地說明a角蛋白的X射線衍射

（）二級結構是肽鏈的空間走向圖案中的5-5.5埃重復單位。在這個模型口，

蛋白質的二級結構是指肽鏈主鏈的空間每隔3.6個氨基酸殘基螺旋升高一圈，相當

走向（折疊和盤繞方式），是有規(guī)矩重復的構于向上平移5.4埃。螺旋的直徑是11埃。螺

象。肽鏈主鏈具有重復結構，其中氨基是氫旋升而時，每個氨基酸殘基沿軸旋轉100°,

鍵供體，線基是氫鍵受體。通過形成鏈內或向上平移1.5埃，比徹低舒展的構象壓縮2.4

鏈間氫鍵可以使肽鏈卷蜿蜒疊形成各種二級倍。這與衍射圖案中的小周期徹低一致。其

結構單元。復雜的蛋白質分子結構，就由這二面角中二57度，甲=-48度。在a螺旋中氨

些比較容易的二級結構單元進一步組合而基酸殘基的側鏈伸向外側，相鄰的螺圈之間

成。形成鏈內氫鍵，氫鍵的取向幾乎與中央軸平

（二）肽鏈卷蜿蜒疊形成四種二級結構行。氫鍵是由肽鍵中氮原子上的氫與其N端

單元