呼吸道病毒標(biāo)本采集運輸、保存與實驗室結(jié)果判讀相關(guān)呼吸道病毒概況呼吸道病毒

呼吸道病毒是指一大類能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病變，或僅以呼吸道為入侵門戶，主要引起呼吸道外組織器官病變的病毒。拒統(tǒng)計，90%以上的急性上呼吸道感染由病毒引起。呼吸道病毒的分類正粘病毒科流感病毒（A、B、C）副粘病毒科副流感病毒（I-IV）、呼吸道合胞病毒、偏肺炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒小RNA病毒科腸道病毒（脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、?？刹《荆?、鼻病毒、心病毒腺病毒科腺病毒冠狀病毒科SARS-CoV,229E,OC43,NL63,HKU1細小病毒博卡病毒（1-4）呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬皰疹病毒科單純皰疹病毒、巨細胞病毒、EB病毒水痘－帶狀皰疹病毒、披膜病毒科風(fēng)疹病毒多瘤病毒W(wǎng)U、KI呼吸道病毒感染的特點病毒的多樣性和變異性；在引起成人感冒的病毒群中：鼻病毒占30%-35%，冠狀病毒占20%-30%，其他病毒占10%-15%。大部分情況下，病毒入侵部位、入侵后繁殖部位、由此引發(fā)的組織和免疫病理改變以及表現(xiàn)出的臨床癥狀和體征的部位基本在呼吸道，表現(xiàn)的病情較輕；一般無病毒血癥；有些病毒還可引起腸道感染；免疫力不持久；正粘病毒的基本特征流行性感冒病毒（簡稱流感病毒）：是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，在分類學(xué)上，流感病毒屬于正黏液病毒科理化特性：

對熱敏感,56℃30min可滅活；最適pH為7.0～8.0，＜3.0和＞10.0感染力很快被破壞；對紫外線敏感；對乙醚、氯仿、丙酮等有機溶劑均敏感。

流行性感冒概述流行性感冒（簡稱流感）：

是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒分別引起的急性呼吸道傳染病。臨床表現(xiàn)：起病急、高熱（38～40℃）、肌痛、頭痛伴有嚴(yán)重不適、干咳、咽喉痛或鼻炎，多數(shù)患者可在一到兩周內(nèi)恢復(fù)。潛伏期短（1-

3天）、經(jīng)呼吸道飛沫傳播，傳播迅速，抗原易變異，人群對變異株普遍易感，控制難度大，流感流行呈一定季節(jié)性。流感病毒概述分型與命名◆

根據(jù)流感病毒感染的對象，可以將病毒分為人類流感病毒、豬流感病毒、馬流感病毒以及禽流感病毒等類群?！舾鶕?jù)病毒粒核蛋白（NP）和膜蛋白（MP)抗原特性及其基因特性的不同，可以將病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。◆甲型流感病毒根據(jù)其表面結(jié)構(gòu)（H和N）及其基因特性的不同可分為多種亞型。

目前已從甲型流感病毒的天然宿主水禽中分離到16種HA與9種NA亞型的甲型流感病毒。禽流感病毒H5N1、H9N2、H7N7以及H10N7等均有感染人的報道。血清學(xué)的證據(jù)表明H4、H6以及H11亞型AIVs也可能感染過人。根據(jù)禽流感病毒對雞致病性的不同，AIVs可以分為低致病性禽流感病毒（LPAIV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV）。近幾十年，不斷有HPAIV和LPAIV感染人的報道，均是由禽直接傳給了人，并沒有病毒能在人群中有效傳播的證據(jù)。H7亞型AIVs也可按照地域不同分為兩個基因譜系：北美譜系和歐亞譜系，且均有感染人的報道副粘病毒的基本特征副粘病毒科(Paramyxoviridae)擁有2個病毒亞科6個屬。副粘病毒的基因組為單股負(fù)鏈RNA，不分節(jié)段。基因組約15~20kb，編碼的蛋白8~11個或更多。副粘病毒毒粒直徑約150~350nm，含有螺旋狀核殼。病毒顆粒呈多形性，但通常為圓形，均有包膜。即使在同一種病毒，毒粒的大小也不相同。細胞漿內(nèi)復(fù)制。小RNA病毒的基本特征小RNA病毒(Picornavirus)小RNA病毒有9個屬，其中已知5個含有人類病原。小RNA病毒顆粒每個含有4種蛋白（VP1-VP4），各有60個拷貝，呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑大約30nm，無包膜。小RNA病毒基因組為單股正鏈RNA分子，大小約8kb，能夠在細胞漿內(nèi)翻譯出病毒復(fù)制所需的所有病毒蛋白，因此具有感染性。Cox腸道病毒感染特點非脊髓灰質(zhì)炎腸道病毒（NPEV），主要包括Cox、ECHO和一些新型腸道病毒；感染廣泛，僅在美國每年癥狀性感染達500萬～1000萬。感染主要發(fā)生在夏秋季節(jié)，發(fā)病率和嚴(yán)重程度與年齡成反比，幼兒是主要受害者；可引起普通感冒、心肌炎、無菌性腦膜炎、腦炎等多種疾病。絕大部分感染是無癥狀性的，很難與鼻病毒感染區(qū)分。在液體中穩(wěn)定；腦脊液、血清、全血、尿可以放在原始采集管中送交實驗室；直腸或咽拭子、鼻洗液等放入VTM；樣本采集腸道病毒鼻病毒病毒復(fù)制及癥狀特征主要在鼻部，人普通感冒有1/3～1/2由鼻病毒引起；1960年代分離成功，至1987年已經(jīng)鑒別了>100血清型；根據(jù)基因特征可將這些血清型分為A、B兩屬；2007年發(fā)現(xiàn)C屬，目前不能培養(yǎng)溫帶地區(qū)感染高峰為每年9月，春天有第二次感人那高峰，夏天可持續(xù)發(fā)生；無組特異性抗原，型見可有交叉，血清型變化頻繁；病毒經(jīng)呼吸道分泌物從人傳播到人；潛伏期2～3d,病毒排出高峰期與急性鼻炎一致；4～5d時檢測不到病毒或維持低滴度達2周，癥狀一般維持7d;下呼吸道感染也常發(fā)生。尤其是對于嬰幼兒、老年人、慢性病患者或原有肺病患者，常與RSV感染不易區(qū)分；沒有胞膜，對有機溶劑有抵抗力。感染特點癥狀出現(xiàn)后1～6d均可分離到病毒，病毒排泌1～3d明顯；標(biāo)本應(yīng)在鼻部采集而不是咽部采集；鼻洗液是鼻病毒分離最好的標(biāo)本；樣本4℃可保存24～48h。鼻病毒樣本采集線型雙鏈DNA，不分節(jié)段，基因組長30000~42000bp，編碼約30種蛋白；病毒無包膜，二十面立體對稱，直徑約70~90nm，具12個頂角和纖維刺突。腺病毒潛伏期5~8d；通常為局部感染；約5%的兒童急性呼吸道疾病及約10%的嬰幼兒腹瀉由腺病毒引起；咽炎，急性呼吸系統(tǒng)疾?。?，4，7，21，1，2，5，6），濾泡性結(jié)膜炎，流行性角膜結(jié)膜炎，咽結(jié)膜熱，尿路感染（子宮頸炎、尿道炎、出血性膀胱炎）以及無癥狀持續(xù)感染；腦膜腦炎可為腺病毒呼吸道感染的并發(fā)癥。腺病毒感染特點鼻咽拭子或抽出物、鼻拭子或抽出物、眼分泌物拭子、糞便或直腸拭子、尿、尿道或?qū)m頸拭子以及活檢或尸檢組織都是可根據(jù)病人癥狀獲得的合適標(biāo)本。疾病早期正確收集樣品并立即冷凍送往實驗室可大大提高病毒檢出率。用血清學(xué)方法建立或證實診斷需要配對的血樣。第一份樣品在癥狀出現(xiàn)后應(yīng)立即盡快收集，第二份應(yīng)在2-4周后收集。樣本采集腺病毒冠狀病毒

單股正鏈RNA，27-31KD,5’端甲基化“帽子”，3’端polyA尾。

根據(jù)基因序列和血清學(xué)，分成三組，感染人類的分屬于I和II組，包括229E、NL63、OC43、HKU1和SARS-CoV。Woo,etal.ExpBiolMed.2009,234:1117–1127可引起呼吸道、腸道感染，也可能引起神經(jīng)癥狀。非SARS-CoV病毒，通過呼吸道飛沫傳播，尚無動物模型，多數(shù)感染較輕，為自限性，可加重慢阻肺等疾病。分布廣泛，主要發(fā)生在冬季和早春，美國數(shù)據(jù)表明，占成人上呼吸道感染的10~24%。病毒分離可用人胚腎細胞或器官培養(yǎng)。冠狀病毒感染特點呼吸道病毒標(biāo)本采集、運輸、保存流感樣病例定義是指發(fā)熱（體溫大于等于38℃），伴咳嗽或咽痛之一者。不明原因肺炎病例定義同時具備以下4條,不能明確診斷為其它疾病的肺炎病例:(1)發(fā)熱(腋下體溫≥38℃);(2)具有肺炎的影像學(xué)特征;(3)發(fā)病早期白細胞總數(shù)降低或正常,或淋巴細胞分類計數(shù)減少;(4)經(jīng)規(guī)范抗菌藥物治療3-5天，病情無明顯改善或呈進行性加重。呼吸道癥候群病例定義（一）急性感染表現(xiàn)（至少符合下列的一項）：

發(fā)熱（從發(fā)病開始有報告和記錄），WBC升高或降低，或WBC分布異常，寒戰(zhàn)，體溫降低（考慮年齡）（二）呼吸道臨床表現(xiàn)（至少符合下列的一項）：

咽部不適、咽干或咽痛，鼻塞、流涕，鼻/咽/喉明顯充血、水腫，咳嗽（新發(fā)或咳嗽加重），咳痰，氣短，聽診呼吸音異常（濕啰音，干啰音，哮鳴音，濁音），胸痛其中肺炎病例具有上述(一)和(二),并具備----（三）肺炎癥狀：

胸部X線片提示肺部炎性改變注:從肺炎病例采集的標(biāo)本數(shù)比例不少于所承擔(dān)發(fā)熱呼吸道癥候群總?cè)蝿?wù)量的20%。針對各種標(biāo)本的病毒與細菌檢測項目的流程圖如下：病例標(biāo)本采集全血鼻/咽拭子尿液鼻咽抽吸物支氣管肺泡灌洗液細菌培養(yǎng)和鑒定急性期/恢復(fù)期血清可疑病毒抗體檢測（備選項）、肺炎支原體和肺炎衣原體抗體檢測（備選項）病毒核酸檢測（陽性者部分繼續(xù)進行病毒分離）、肺炎支原體和肺炎衣原體DNA檢測嗜肺軍團菌、肺炎鏈球菌快速抗原檢測痰液肺炎支原體及肺炎衣原體DNA檢測；細菌培養(yǎng)和鑒定（鼻咽抽吸物和支氣管肺泡灌洗液陰性者進行細菌DNA檢測）；病毒核酸檢測（陽性者部分繼續(xù)進行病毒分離）胸腔穿刺液相關(guān)法律法規(guī)依據(jù)《中華人民共和國傳染病防治法》開展標(biāo)本的采集和檢測。標(biāo)本的采集和檢測應(yīng)嚴(yán)格遵守《病原微生物實

驗室生物安全管理條例》(國務(wù)院424號令2004

年11月12日起實施)，并嚴(yán)格做好個人防護標(biāo)本的保存與運輸嚴(yán)格遵守《可感染人類的高

致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理

規(guī)定》（衛(wèi)生部45號令2006年2月1日起施行）具體依據(jù)《人間傳染的病原微生物名錄》（衛(wèi)科教發(fā)[2006]15號2006年1月11日發(fā)布）病原微生物標(biāo)本的采集條件具有與采集病原微生物樣本所需要的生物安全防護水平相適應(yīng)的設(shè)備，包括個人防護用品（隔離衣、帽、口罩、鞋套、手套、防護眼鏡等）、防護材料、器材和防護設(shè)施等具有掌握相關(guān)專業(yè)知識和操作技能的工作人員具有有效的防止病原微生物擴散和感染的措施具有保證病原微生物樣本質(zhì)量的技術(shù)方法和手段采集過程中應(yīng)對標(biāo)本的來源、采集過程和方法等作詳細記錄。病原微生物標(biāo)本采集原則早、快、近（病變部位）、多、凈應(yīng)根據(jù)病例的臨床表現(xiàn)采集不同時期、不同種類的標(biāo)本死亡病例最好采集尸檢標(biāo)本，并盡可能地收集醫(yī)院已檢的臨床標(biāo)本沒有條件進行尸體解剖的，可根據(jù)檢測目的采集呼吸道灌洗液、肛拭子或經(jīng)皮穿刺采集胸水、腹水、肺組織標(biāo)本等病原微生物標(biāo)本的種類呼吸道樣品：上呼吸道樣品：咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、鼻洗液、咽漱液、深咳痰液、鼻咽抽取物。最佳采集時間為發(fā)病后3天內(nèi)，一般不超過7天。下呼吸道樣品：呼吸道抽取物、呼吸道灌洗液、胸水、肺組織標(biāo)本。下呼吸道標(biāo)本最有利于病毒分離。消化道樣品：糞便、肛拭子、胃內(nèi)容物。其他樣品：血液、腦脊液、尿液、皰疹液、瘀斑或出血點、皮膚潰瘍分泌液、體液標(biāo)本、膿或傷口標(biāo)本、尸檢標(biāo)本。標(biāo)本采集的器材和容器標(biāo)本采集的器材和容器應(yīng)是無菌的，在有效期內(nèi)使用。標(biāo)本容器最好使用可耐深低溫的塑料制品。如外螺旋蓋帶密封墊圈的無菌螺口塑料管或瓶。采集好的標(biāo)本應(yīng)規(guī)范標(biāo)識獨立包裝在帶密封條的塑料袋中。標(biāo)本容器采咽拭子的器材和容器采鼻拭子的器材和容器采集血標(biāo)本的器材和容器BDSST血清分離膠管

BDSST管內(nèi)壁均勻噴涂促凝劑加速血液凝固，縮短周轉(zhuǎn)時間（TAT）。惰性分離膠用于離心后分隔血細胞和血清，可提高血清產(chǎn)量，較長時間保持血清成分的穩(wěn)定，利于樣本的復(fù)檢。分離膠穩(wěn)定性強，不易吸附血清中的蛋白質(zhì)，對藥物檢測及普通的生化檢測可得出真實的結(jié)果。

BDPST血漿分離膠管

BDPST管內(nèi)含有惰性分離膠，可分隔血細胞和血漿，提高血漿產(chǎn)量，保持血漿成分的穩(wěn)定。用于采集血漿樣本，消除凝血時間，縮短周轉(zhuǎn)時間(TAT)。通常用于重癥監(jiān)護和急診檢測。

BD血清管

BD血清管用于采集靜脈血后分離出血清，應(yīng)用于臨床化學(xué)、血清學(xué)、免疫學(xué)、治療藥物監(jiān)測、微量元素測定。促凝劑的作用是加速血液凝固。采用促凝管可以縮短周轉(zhuǎn)時間。

BD血漿管

BD血漿管用于采集靜脈血后分離出血漿，應(yīng)用于臨床生化等檢驗。血漿管內(nèi)壁均勻噴涂肝素鋰或肝素鈉用于血液抗凝，適于大多數(shù)臨床生化檢測，可以作為那些不用分離膠管而又需要血漿標(biāo)本的實驗室的主要采血管。

BD血糖管

BD血糖管用于血糖測定或糖耐量檢測，管壁均勻噴涂抗凝劑（草酸鉀）及糖原穩(wěn)定劑（氟化鈉），糖原穩(wěn)定劑可以使血糖濃度在室溫條件下保持24小時穩(wěn)定。

BDEDTA血常規(guī)管

血常規(guī)管含有EDTA的二鉀鹽或三鉀鹽，其中二鉀鹽呈霧狀均勻噴涂于管壁。該管主要用于血細胞學(xué)檢測如血象，血紅蛋白，糖化血紅蛋白，環(huán)胞素，紅細胞葉酸及輸血前檢測（血型、抗體篩查、交叉配型）。

BD血凝管

BD血凝管主要用于凝血四項檢測（凝血酶原時間、凝血酶時間、活化部分凝血活酶時間、纖維蛋白原），指導(dǎo)臨床如口服華法林治療的監(jiān)控、靜脈輸注肝素治療的監(jiān)控以及“特殊凝血研究”（凝血因子檢測、如第VIII因子或血友病因子、血小板功能檢測）。

BDVacutainer?血沉管（ESR管）

血沉管用于紅細胞沉降率的測定，含有3.2%枸櫞酸鈉溶液抗凝，抗凝劑與血液的比例為1:4。玻璃管可配合血沉架或全自動血沉儀聯(lián)合使用，該方法為封閉系統(tǒng)，無需打開管帽，采血后直接操作。-BDPAXgeneTM

全血RNA管能穩(wěn)定血細胞內(nèi)的RNA水平，延長血液標(biāo)本體外放置的時間，利于批量采集，細胞轉(zhuǎn)錄水平保真性好可用于與血細胞RNA相關(guān)的RT-PCR檢測，人類疾病基因轉(zhuǎn)錄譜的研究及其他RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)的檢測標(biāo)本采集方法

咽拭子：用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時檫拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。標(biāo)本采集方法

鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動退出；取另1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔；將上述2根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。標(biāo)本采集方法鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。先將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液3ml涮洗收集器1次（可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來代替收集）吸取過程正確錯誤錯誤不要觸摸病人的臉!標(biāo)本采集方法咽漱液：用10ml不含抗菌素的采樣液漱口（漱時讓患者頭部微后仰，發(fā)“噢”聲，讓洗液在咽部轉(zhuǎn)動），然后將咽漱液收集于50ml無菌的螺口塑料管中。無條件的可用平皿或燒杯收集咽漱液并轉(zhuǎn)入10ml螺口采樣管中。標(biāo)本采集方法深咳痰液：肺部感染應(yīng)采取痰標(biāo)本，以清晨第一口痰為最佳。采集前要求患者用清水漱口數(shù)次，以除去口腔內(nèi)的大量雜菌，患者深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的50ml無菌螺口采樣管中。呼吸道灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器1次（可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來代替收集）。標(biāo)本采集方法胸水：在B超定位下進行胸腔穿刺，抽取胸水5ml，置于無菌的塑料螺口管中。肺組織活檢標(biāo)本：在超聲或X線定位下，經(jīng)皮穿刺取肺組織活檢標(biāo)本，置于含3ml采樣液的塑料螺口管中。尸檢標(biāo)本：在嚴(yán)格按照生物安全防護的條件下，進行尸檢，根據(jù)檢測目的可采集肺、肝、腎、脾、心臟、腦、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本。病人死亡后應(yīng)依法盡早進行解剖，無菌采集，每一采集部位分別使用不同消毒器械，以防交叉污染；每組織應(yīng)多部位取材，各組織應(yīng)取20～50g，淋巴取2個。標(biāo)本采集方法糞便標(biāo)本：對黏液膿血便應(yīng)挑取黏液或膿血部分，液狀糞便采集水樣便或含絮狀物的液狀糞便2～5ml；成形糞便至少取5g糞便置于無菌螺口管中，最好加有保存液或增菌液。肛拭子：若無法獲得糞便時，可用保存液或增菌液濕潤過的棉拭子插入肛門4～5cm深處（小兒2～3cm）輕輕轉(zhuǎn)動一圈，取直腸表面的黏液后取出，用于病毒檢測的肛拭子立即放入含3ml病毒保存液的帶外螺旋蓋的試管中，用于細菌檢測的肛拭子需將樣品接種到增菌液中，或?qū)?biāo)本插入Cary-Blair運送半固體培養(yǎng)基中，但不得冷凍。

標(biāo)本采集方法血清標(biāo)本：用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于2ml無菌螺口塑料管中。每一例病人須采集急性期、恢復(fù)期雙份血清。第一份血清應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）采集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3～4周采集。以空腹血為佳。病例診斷需雙份血清。全血：用一次性真空抗凝采血管采集病人5ml靜脈血，立即緩慢地顛倒采血管3-5次，4℃條件下立即送至有關(guān)實驗室。不同疾病標(biāo)本的采集

流行性感冒：采發(fā)病3天內(nèi)流感樣病例（T≥38℃、伴有咽痛或咳嗽癥狀之一者,缺乏其它實驗室確定診斷依據(jù)）的咽拭子或鼻咽拭子放入3-5ml采樣液中或采集病人的含漱液10ml，冷藏運送至實驗室。最好沒有服用過抗病毒藥物。

麻疹：作病毒分離的樣品，要在前驅(qū)期或出疹初期（T≥38℃、3天內(nèi)）采病人的咽拭子放入3-5ml采樣液中冷藏送至實驗室；作血清學(xué)診斷的樣品，則在出疹后４-１５天采集靜脈血，必要時間隔1周再采1次。不同疾病標(biāo)本的采集SARS/人禽流感/MERS：應(yīng)在發(fā)病不同時期分別采集住院病人的不同標(biāo)本，早期可采集病人的咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液等上呼吸道標(biāo)本；病人上呼吸機后，可采集呼吸道抽取物、支氣管灌洗液等下呼吸道標(biāo)本；如果病例有腹瀉癥狀，可采集糞便標(biāo)本；有胸水者可采集胸水標(biāo)本；須采集急性期、恢復(fù)期雙份血清；必要時還可采集全血。51標(biāo)本的采集（一）注意事項確認(rèn)符合病例定義后盡早采集（盡量在采取治療措施前）采集時嚴(yán)格無菌操作，減少或避免機體正常菌群及其它雜菌污染采集后應(yīng)盡快送檢。床旁接種可提高病原菌檢出率。送檢標(biāo)本應(yīng)貼條形碼，并附送檢單，送檢單上應(yīng)注明姓名、(編號)、標(biāo)本來源、檢驗?zāi)康暮蜆?biāo)本采集具體時間。填寫病例信息調(diào)查表。嚴(yán)格按生物安全規(guī)范操作。52（二）各種標(biāo)本的采集要求病毒檢測：（檢測一類標(biāo)本即可）鼻/咽拭子（必采項）痰液（盡量采集）鼻咽抽吸物（盡量采集）胸腔穿刺液（盡量采集）支氣管肺泡灌洗液（盡量采集）血液（盡量采集）細菌檢測：血液（必采項）痰液（必采項）胸腔穿刺液（盡量采集）支氣管肺泡灌洗液（盡量采集）尿液：軍團菌、肺炎鏈球菌快速抗原檢測（必采項）聯(lián)合國對感染性物質(zhì)的運輸分類根據(jù)其所運輸病原體的傳染性和感染后對個體或群體的危害程度不同，分為A類和B類。A類指人感染后發(fā)病的可能性大，傳染性強，對人群危害性大的烈性感染性物質(zhì)。高度懷疑具有嚴(yán)重危害性的感染性物質(zhì)也屬于A類。A類之外，僅具有一般危險性，引起感染的機會較少的感染性物質(zhì)感染性物質(zhì)為B類感染性物質(zhì)運輸?shù)陌b系統(tǒng)感染性及潛在感染性物質(zhì)的運輸應(yīng)使用三層包裝系統(tǒng)：內(nèi)層容器、中層包裝、外層包裝將樣品采用防水、防漏的內(nèi)層容器包裝并貼上指示內(nèi)容物的標(biāo)簽后裝入中層容器內(nèi)層容器和中層容器間應(yīng)放置足量的吸水性材料，以便內(nèi)層容器打破或泄漏時能吸收溢出的所有液體。然后將中層容器固定在硬質(zhì)外層容器中以免中層容器在運輸過程中受到物理性損壞。標(biāo)本的包裝A類包裝，符合UN2814要求容器或包裝材料應(yīng)達到國際民航組織《危險物品航空安全運輸技術(shù)細則》（Doc9284包裝說明PI602）規(guī)定的A類包裝標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本的包裝三層包裝第一層為離心管第二層為防水、防漏的安全殼容器第三層為運輸包裝包裝要求樣本應(yīng)用吸水紙等包裹，固定在自封袋或離心管內(nèi)在堅固、防水、防漏的第二層安全殼容器中，用吸水紙等填充物將內(nèi)有標(biāo)本的自封袋或離心管固定好，裝入第三層包裝第二層和第三次包裝之間應(yīng)放置冰排等制冷材料安全殼容器和外包裝須與IATA危險物品條例包裝制度650相符合57標(biāo)本的運送血液標(biāo)本、鼻/咽拭子、痰液、鼻咽抽吸物、支氣管肺泡灌洗液、胸腔穿刺液、尿液標(biāo)本采集后應(yīng)該盡快送檢。血培養(yǎng)瓶須在24小時內(nèi)送檢，送檢前置于常溫環(huán)境（15-30℃）保存。其他標(biāo)本送檢前應(yīng)保存在4-8℃，如24小時內(nèi)無法檢測的標(biāo)本則應(yīng)置于-70℃或以下保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)本運送過程中，血培養(yǎng)瓶應(yīng)置于15-30℃環(huán)境中,其他標(biāo)本應(yīng)置4-8℃運送。收取標(biāo)本由醫(yī)院所在地的疾病預(yù)防控制機構(gòu)到醫(yī)院收取標(biāo)本。標(biāo)本運輸之前，應(yīng)按相關(guān)生物安全規(guī)定，與樣本接收單位生物安全管理部門聯(lián)系，辦理相關(guān)手續(xù)運送日期確定后，立即將運送時間和運輸方式通知接收單位，做好接收準(zhǔn)備59標(biāo)本的保存（一）檢測標(biāo)本的存放血清、呼吸道標(biāo)本、尿液標(biāo)本、胸腔穿刺液標(biāo)本抵達檢測實驗室后，原則上應(yīng)盡早進行病毒和細菌檢測；進行病毒檢測的標(biāo)本，24小時內(nèi)能進行檢測的可置于4℃保存，24小時內(nèi)不能進行檢測的則應(yīng)置于-70℃或以下保存；用于細菌培養(yǎng)的標(biāo)本，應(yīng)立即分離，不應(yīng)存放后分離。標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。（二）標(biāo)本的長期保存所采標(biāo)本抵達實驗室后，血清、呼吸道標(biāo)本、尿液標(biāo)本、胸腔穿刺液標(biāo)本按需要分裝成所需份數(shù)，置-70℃冰箱或以下保存。60（二）標(biāo)本的處理（一）呼吸道標(biāo)本用于病毒檢測前需進行分裝分裝鼻/咽拭子標(biāo)本時，注意充分?jǐn)D壓拭子頭，保證細胞充分脫落分裝管中用于核酸檢測的標(biāo)本，如粘液成分較重，可進行液化等處理（二）血清標(biāo)本從血標(biāo)本中分離血清，分裝后按方案要求儲存呼吸道病原譜（1）流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒、冠狀病毒、博卡病毒和鼻病毒8種病毒以及肺炎支原體和肺炎衣原體的核酸檢測。進行細菌培養(yǎng)和鑒定，培養(yǎng)的重點是肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、A組乙型鏈球菌、流感嗜血桿菌。呼吸道病原譜（2）對所有細菌分離培養(yǎng)陰性的胸腔穿刺液和支氣管肺泡灌洗液，進行針對所檢測細菌和肺炎支原體、肺炎衣原體的核酸檢測。對全部尿標(biāo)本進行肺炎鏈球菌和嗜肺軍團菌的快速抗原檢測。凡從無菌部位（全血、支氣管肺泡灌洗液、胸腔穿刺液）采集標(biāo)本證實一種病原體感染，即可視為檢測終點，不要求繼續(xù)進行其它病原體檢測。63（三）檢測程序檢測病毒：人流感病毒、呼吸道合胞病毒、人腺病毒、人副流感病毒、人偏肺病毒、人冠狀病毒、人博卡病毒、人鼻病毒檢測方法：核酸PCR檢測/Real-timePCR（逐步完善）

分離培養(yǎng)和免疫熒光/PCR鑒定血清學(xué)檢測：各實驗室視情況和條件選擇實施。64呼吸道病毒的核酸檢測1.核酸的提?。鹤詣踊怂崽崛∩唐坊暮怂崛斯ぬ崛≡噭┖泄J(rèn)的傳統(tǒng)方法：如《分子克隆》。2.核酸的檢測：RT-PCR，PCRReal-timePCR3.結(jié)果的確證和記錄：膠回收克隆和測序65病毒的分離培養(yǎng)（1）1.進行病毒分離的標(biāo)本選擇原則：我國目前尚缺乏或存量較少，且具有較大的研究意義的病毒，包括人偏肺病毒，人冠狀病毒。在常規(guī)監(jiān)測研究時，某種病毒核酸檢測陽性比例的異常增高時或非常規(guī)的聚集性病例時，從中選擇適當(dāng)數(shù)量病例分離5-10株病毒。鼓勵建立人博卡病毒的細胞培養(yǎng)分離體系。2.分離得到的病毒，應(yīng)采用核酸檢測、免疫熒光等方法鑒定病毒種類。3.細胞株：應(yīng)有明確的生物學(xué)背景，來源清楚，并已排除病原體的污染。66病毒的分離培養(yǎng)（2）實驗室生物安全要求實驗室檢測相關(guān)活動嚴(yán)格按照《人間傳染的病原微生物名錄》的要求，在相應(yīng)的生物安全級別實驗室開展病毒培養(yǎng)在BSL-x實驗室動物感染實驗在ABSL-x實驗室未經(jīng)培養(yǎng)的感染材料的操作在BSL-x實驗室滅活材料的操作在BSL-x實驗室按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》等相關(guān)規(guī)定要求，做好生物安全工作標(biāo)本上送要求根據(jù)要求，應(yīng)將陽性和部分陰性標(biāo)本送省疾控中心、中國控中心進行復(fù)核檢測實驗室檢測結(jié)果應(yīng)及時反饋標(biāo)本送檢單位，并盡快上報上級主管部門A類標(biāo)本運輸?shù)纳锇踩笥蓪Ｈ藢＼囘\送，運送人員須有相關(guān)資質(zhì)，且不得少于兩人申請單位對與運送人員進行相關(guān)的生物安全培訓(xùn)在運送過程中采取相應(yīng)的防護措施運輸前仔細檢查容器，要符合安全要求按照規(guī)定進行標(biāo)本運輸前的包裝和送達后的開啟呼吸道病毒檢測實驗室結(jié)果判讀核酸檢測技術(shù)的原理PCR的基本工作原理就是以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補的DNA片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。特異性：引物序列靈敏度：擴增100萬倍1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1～3步25～35輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍RT-PCR和real-timePCRRT-PCR：即逆轉(zhuǎn)錄PCR，擴增的模板為RNA，增加RNA→DNA過程。Real-timePCR：即實時熒光定量PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程。RT-PCR/Real-timeRT-PCR的基本步驟需要主要設(shè)備：高速冷凍離心機，PCR儀或熒光定量PCR儀，電泳儀，水平電泳槽，凝膠電泳成像系統(tǒng)，可調(diào)加樣槍（10ul，200ul，1000ul）。裂解細胞或病毒釋放核酸純化核酸反應(yīng)管中加入提取的核酸PCR試劑盒混合反應(yīng)體系反應(yīng)管放入PCR儀，自動完成擴增程序反應(yīng)管中的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳電泳拍照結(jié)果分析裂解細胞或病毒釋放核酸純化核酸反應(yīng)管中加入提取的核酸PCR試劑盒混合反應(yīng)體系反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，自動完成擴增程序PCR檢測結(jié)果判讀熒光PCR結(jié)果判讀結(jié)果解釋－陰性樣品結(jié)果解釋－試驗失敗結(jié)果解釋－可疑樣品結(jié)果解釋－可疑樣品陽性樣品擴增曲線病毒分離結(jié)果-采用的細胞系MDCK細胞：流感病毒LLCMK2細胞：副流感病毒，偏肺病毒，冠狀病毒CoV-OC43Hep-2細胞：腺病毒，RSVHela細胞：腺病毒，RSV，冠狀病毒CoV-229E，副流感病毒HEL細胞：冠狀病毒CoV-229EBSC-1細胞：冠狀病毒CoV-OC43MDCKLLCMK2Hep-2檢測流程標(biāo)本敏感細胞系收獲培養(yǎng)2-7天PCR、免疫熒光等方法篩選/檢測分型InfluenzaAInfluenzaBScreeningScreeningRSVNegative尼基氏小體（Negribody）神經(jīng)細胞熒光染色照片血凝和血凝抑制實驗結(jié)果判斷雞或火雞紅細胞陽性(淚滴)陰性豚鼠或人O型血紅細胞陽性（環(huán)狀）陰性陽性陰性陽性陰性中東呼吸綜合征冠狀病毒實驗室檢測參考標(biāo)準(zhǔn)MERS-CoV感染標(biāo)本采集對象中東呼吸綜合征冠狀病毒感染疑似病例、臨床診斷病例及需要進一步研究的確診病例；其它需要進行MERS-CoV感染診斷或鑒別診斷者。標(biāo)本采集要求從事MERS-CoV檢測標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)，培訓(xùn)合格且具備相應(yīng)的實驗技能。在標(biāo)本采集過程中，采樣人員進行安全防護。住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院醫(yī)護人員在當(dāng)?shù)丶部貦C構(gòu)專業(yè)人員指導(dǎo)下采集。密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶部貦C構(gòu)負(fù)責(zé)采集。根據(jù)實驗室檢測工作的需要，結(jié)合病程再次采樣。采集標(biāo)本種類和要求呼吸道（上、下呼吸道）和其他樣品（血清、尿液和糞便）、尸檢標(biāo)本。每個病例應(yīng)盡可能同時采集上、下呼吸道標(biāo)本，下呼吸道標(biāo)本最佳，建議同時采集糞便和尿液標(biāo)本。應(yīng)盡可能采取發(fā)病初期和恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本以確定是否感染，雙份血清樣品間隔14~21天采集比較理想，第一份血清應(yīng)在發(fā)病第一周內(nèi)采集。但單份樣品的檢測對于確定疑似病例也有價值，如果只能采集一份樣品，應(yīng)該在出現(xiàn)癥狀后至少14天采集。標(biāo)本的保存樣品采集后應(yīng)盡快送至實驗室，運輸過程需合理。若呼吸道樣品72小時以上才能到達實驗室，強烈推薦將樣品儲存在-80℃并使用干冰進行運輸，應(yīng)避免樣品反復(fù)凍融。從全血分離的血清應(yīng)4℃儲存并運輸，或用干冰、液氮冷凍并運輸。由于無霜冰柜溫度波動較大，應(yīng)避免使用無霜冰柜儲存呼吸道和血清樣品。院內(nèi)轉(zhuǎn)運時，標(biāo)本應(yīng)該放置在耐用、防滲透的二級容器中進行轉(zhuǎn)運。為減少任何標(biāo)本破、漏的風(fēng)險，不要使用任何氣動傳輸系統(tǒng)來轉(zhuǎn)運任何可能疑似患者標(biāo)本。轉(zhuǎn)運至CDC的MERS-CoV標(biāo)本應(yīng)該充分包裹，轉(zhuǎn)運時不能開蓋或分裝標(biāo)本。標(biāo)本轉(zhuǎn)運應(yīng)該符合三重包裝系統(tǒng)要求：內(nèi)層是主要的容器（一個可密封的標(biāo)本袋纏繞以可吸收材料），第二層是防水、防滲漏的容器，外層是用于轉(zhuǎn)運的包裝。MERS-CoV感染標(biāo)本包裝和運輸

MERS-CoV感染實驗室檢測方法核酸檢測：為目前早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)MERS-CoV感染病例的主要檢測方法，采用Real-timePCR進行病毒核酸檢測和診斷，患者呼吸道樣本中擴增到特異性核酸，可確診MERS-CoV感染。傳統(tǒng)RT-PCR因易出現(xiàn)污染使用受限，但可以獲得病毒基因序列?？乖贵w檢測:IgM捕獲法ELISA檢測血清特異性IgM抗體間接法ELISA或免疫熒光方法檢測IgG抗體利用假病毒進行中和抗體檢測MERS-CoV的實驗室檢測靶標(biāo)目前病毒核酸的檢測方法主要有：檢測E蛋白上游基因（upE）、ORF1b、ORF1a

、N2基因四種。這些方法均高度敏感，推薦upE檢測用于初篩;檢測ORF1b基因的方法不如針對ORF1a的方法敏感，但比其更加特異;N2基因檢測具有較高的靈敏性。另外，已確定了中東呼吸綜合征冠狀病毒基因組中位于RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）和衣殼蛋白（N）基因的幾個適合測序驗證的靶序列。巢式PCR普通PCRPCR產(chǎn)物電泳或測序逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA核酸提取標(biāo)本采集PCR檢測熒光定量PCR實驗方案待檢樣品upE

特異性RT-PCR檢測陽性陰性O(shè)RF1aRT-PCR檢測陽性陰性確診RdRp測序或N測序陰性抗原檢測抗體檢測病毒分離陽性實驗流程繼續(xù)采樣，如有必要應(yīng)送樣至有MERS-CoV檢測經(jīng)驗的參比實驗室進行檢測入選病例rRT-PCRupE基因進行篩查實驗陽性陰性rRT-PCRORF1a、ORF1b或N基因區(qū)進行確證實驗陰性，但如果臨床和流行病學(xué)證據(jù)充分，繼續(xù)采樣重復(fù)檢測陰