激光捕獲顯微切割Lasercapturemicrodissection(LCM)

technology是在不破壞組織構(gòu)造，保存要捕獲的細胞和其四周組織

形態(tài)完整的前提下，干脆從冰凍或石蠟包埋組織切片中獲得目標細

胞，通常用于從組織中精確地別離一個單一的細胞。

背景：機體組織包含有上白種不同的細胞，這些細胞各自與四周的細

胞、基質(zhì)、血管、腺體、炎癥細胞或免疫細胞相互粘附。在正?；虬l(fā)

育中的組織器官內(nèi)，細胞內(nèi)信號、相鄰細胞的信號以及體液刺激作用

于特定的細胞，使這些細胞表達不同的基因并且發(fā)生困難的分子變

更。在病理狀態(tài)下，假如同一類型的細胞發(fā)生了一樣的分子變更，那

么這種分子變更對于疾病的發(fā)生可能起著關(guān)鍵性的作用。然而，發(fā)生

一樣分子變更的細胞可能只占組織總體積的很小一局部；同時，探討

的目標細胞往往被其它組織成分所環(huán)繞。為了對疾病發(fā)生過程中的組

織損害進展分子水平分析，別離出純凈的目標細胞就顯得特別必要。

1996年，美國國立衛(wèi)生院(NIH)國家腫瘤探討所的［2］開發(fā)出激光

捕獲顯微切割技術(shù)(Lasercapturemicrodissection,LCM),次

年，美國ArcturusEngineering公司勝利研制激光捕獲顯微切割系

統(tǒng)，并實現(xiàn)商品化鐺售。應(yīng)用該技術(shù)可以在顯微鏡直視下快速、精確

獲得所需的單一細胞亞群，甚至單個細胞，從而勝利解決了組織中細

胞異質(zhì)性問題。這項技術(shù)現(xiàn)已成為美國“腫瘤基因組解剖方案〃的一

項支撐技術(shù)⑴。

原理：LCM的根本原理是通過一低能紅外激光脈沖激活熱塑膜------

乙烯乙酸乙烯酯(ethylenevinylacetate,EVA)膜(其最大汲取峰

接近紅外激光波長），在直視下選擇性地將目標細胞或組織碎片粘到

該膜上⑵。LCM系統(tǒng)包括倒置顯微鏡、固態(tài)紅外激光二極管、激光限

制裝置、限制顯微鏡載物臺（固定載玻片）的操縱桿、電耦合相機及

彩色顯示器。用于捕獲目標細胞的熱塑膜直徑通常為6mm,覆在透亮

的塑料帽上，后者恰與后繼試驗所用的標準0.5ml離心管相匹配。

機械臂懸掛限制覆有熱塑膜的塑料帽，放到脫水組織切片上的目

標部位。顯微鏡直視下選擇目標細胞，放肘激光脈沖，瞬間升溫使

EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜滲透到切片上極微小的組織間隙中，

并在幾毫秒內(nèi)快速凝固。組織與膜的粘合力超過了其與載玻片間的粘

合力，從而可以選擇性地轉(zhuǎn)移目標細胞。激光脈沖通常持續(xù)0.5%.0

毫秒，并且可在整個塑料帽外表進展屢次重復，從而可以快速別離大

量的目標細胞。將塑料帽蓋在裝有緩沖液的離心管上，將所選擇的細

胞轉(zhuǎn)移至離心管中，從而可以別離出感愛好的分子進展試驗⑶。

EVA膜約100~200uni厚，能夠汲取激光產(chǎn)生的絕大局部能量，在

瞬間將激光束照耀區(qū)域的溫度提高到9003保持數(shù)毫秒后又快速冷

卻，保證了生物大分子不受損害。采納低能量紅外激光的同時也可防

止損傷性光化學反響的發(fā)生。

優(yōu)缺點：LCM最顯著的優(yōu)點在于其快速、精確和多用途的特性。結(jié)合

組織構(gòu)造特點以及所需的切割精確度，通過選擇激光束的直徑大小，

可以快速獲得大量的目標細胞。LCM與以顯微操作儀為根底的顯微切

割技術(shù)相比⑷，具有以下優(yōu)點：（1）別離細胞速度快，無需精致的操

作技能；（2）捕獲細胞和剩余組織的形態(tài)學特征均保持完好，可以較

好地限制捕獲細胞的特異性；（3）捕獲細胞與塑料帽結(jié)合嚴密，削減

了組織損失的風險。相比而言，除了激光切割彈射微別離系統(tǒng)⑸以經(jīng)

染色的用于存檔的切片也可被勝利進展顯微切割。

盡管LCM應(yīng)用廣泛，但對于常規(guī)染色、固定且不加蓋玻片的組織

切片，其視覺辨別率受到很大限制。而對于那些本身缺乏肯定構(gòu)造特

點的困難組織（如淋巴組織，廣泛浸潤的腺癌等），要精確別離出某

一類細胞幾乎是不行能的。Fend等⑹通過采納特別染色，尤其是免疫

組化方法，使目標細胞或想要去除的細胞變得更加醒目，從而解決了

上述難題。

應(yīng)用LCM,間或會出現(xiàn)無法將選擇的細胞從切片上移走的狀況，

出現(xiàn)這種結(jié)果有兩種緣由：（1）細胞與熱塑膜之間的粘合力缺乏，通

常是由于組織未完全脫水或激光的能量設(shè)置過低造成的；（2）組織切

片與載玻片間的粘合力過強，通常發(fā)生在顯微切割枯燥時間過長的冰

凍切片。針對不同樣本組織（包括免疫組化染色的組織切片），一些

探討小組分別詳盡報道了采納適合的處理方法，以到達最正確的顯微

切割條件⑺。

應(yīng)用：LCM較以往的顯微切割技術(shù)有了突破性的進展，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用

于腫瘤探討，包括前列腺癌⑻、腎癌、肺癌、甲狀腺癌⑼、食管癌、

胃癌、肝癌、膽管癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、惡性胸膜間皮瘤、

淋巴瘤、卵巢癌等。此外，LCM還勝利應(yīng)用于其它一些疾病的探討中，

如Crohn病口”肌萎縮性側(cè)索硬化癥?、子宮內(nèi)膜異位癥、獲得性

免疫缺陷綜合征、結(jié)核病、丙型肝炎等。而應(yīng)用LCM所別離的組織也

多種多樣，包括單個細胞、單一細胞群（主要是癌巢）、血管等類型。

展望：LCM勝利解決了組織異質(zhì)性問題，且具有快速、精確等諸多優(yōu)

點，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤等疾病基因水平的探討中，并顯示出了良好

的應(yīng)用前景⑴。但今后可能還須要以下幾個主要方面的開展和完善：

理論上，除上述組織及細胞以外，LCD還可應(yīng)用于其他全部組織細胞

（如脾臟巨噬細胞、肝臟Kuffer細胞等）的別離，但其各自的切片

制備、染色等技術(shù)方法尚須要進展探究；開發(fā)相應(yīng)的應(yīng)用程序，僅需

輸入目標細胞或組織的特異性參數(shù)即可實現(xiàn)計算機自動限制LCD1⑵，

從而大大縮減所需的人力和時間；提高捕獲單個細胞的精確度，以削

減非目標組織的沾染；進一步優(yōu)化快速免疫組化染色的步驟，改良

DNA和RNA抽提技術(shù)，實現(xiàn)從少量捕獲細胞或組織中獲得高質(zhì)量的核

酸。

變性高效液相色譜分析（denaturinghighperformanceliquid

chromatography,DHPLC）

原理：在局部變性的條件下，通過雜合與純合二倍體在柱中保存時間

的差異，發(fā)覺DNA突變。異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不

同，在局部變性條件下，異源雙鏈因有錯配區(qū)的存在而更易變性，在

色譜柱中的保存時間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來，在色譜圖中表

現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。

用離子對反向高效液相色譜法：⑴在不變性的溫度條件下，檢測并

別離分子量不同的雙鏈DNA分子或分析具有長度多態(tài)性的片段，類似

RFLP分析，也可進展定量RT—PCR及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性測定(MSI)；

⑵在充分變性溫度條件下，可以區(qū)分單鏈DNA或RNA分子，適用于

寡核甘酸探針合成純度分析和質(zhì)量限制；⑶在局部變性的溫度條件

下，變異型和野生型的PCR產(chǎn)物經(jīng)過變性復性過程，不僅分別形成同

源雙鏈，同時也錯配形成異源雙鏈，依據(jù)柱子保存時間的不同將同源

雙鏈和異源雙鏈別離，從而識別變異型。依據(jù)這一原理，可進展基因

突變檢測、單核甘酸多態(tài)性分析SNPs等方面的探討。

優(yōu)點：近年來建立并快速開展的DHPLC是一種新型基因突變篩查技

術(shù)，既能夠自動化、高通量進展，且除PCR之外，勿需進展PCR引物

修飾、購置特別試劑、檢測標記信號或作其它的樣品處理。而目前已

有的很多DNA突變分析技術(shù)諸如單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand

conformationpolymorphism,SSCP)、變性梯度凝膠電泳法

(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)等均不能滿意

此要求。DHPLC具有高通量檢測、自動化程度高、靈敏度和特異性較

高、檢測DNA片段和長度變動范圍廣、相對價廉等優(yōu)點。與傳統(tǒng)的

SSCP、DGGE等方法相比,DHPLC有較多的優(yōu)點。SSCP的結(jié)果受血樣

質(zhì)量、提取方法等因素的影響，并且須要跑膠、電泳；DGGE那么須

要標記引物，存在放射性污染，這兩種方法都比擬費時費勁。而DHPLC

那么高度自動化，可以自動取樣，檢測每個樣品只須要8分鐘左右。

DHPLC與其他檢測DNA突變方法的最大不同在于，它能夠純化DNA片

斷。當然，只能檢測雜合突變是DHPLC的缺乏之處，但是這可以利用

混合的方法(即將純合突變樣品和野生型樣品混合)來解決。

多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex1igation-dependentprobe

amplification,MLPA)于2002年由Schouten等首先報道，是近幾

年開展起來的一種針對待檢DNA序列進展定性和半定量分析的新技

術(shù)。該技術(shù)高效、特異，在一次反響中可以檢測45個核甘酸序列拷

貝數(shù)的變更，目前已經(jīng)應(yīng)用于多個領(lǐng)域、多種疾病的探討。

原理：MLPA的根本原理包括探針和靶序列DNA進展雜交，之后通過

連接、PCR擴增，產(chǎn)物通過毛細管電泳別離及數(shù)據(jù)收集，分析軟件對

收集的數(shù)據(jù)進展分析最終得出結(jié)論。每個MLPA探針包括兩個熒光標

記的寡核甘酸片段，一個由化學合成，一個由M13噬菌體衍生法制備;

每個探針都包括一段引物序列和一段特異性序列。在MLPA反響中，

兩個寡核甘酸片段都與靶序列進展雜交，之后運用連接酶連接兩局部

探針。連接反響高度特異，只有當兩個探針與靶序列完全雜交，即靶

序列與探針特異性序列完全互補，連接酶才能將兩段探針連接成一條

完整的核酸單鏈；反之，假如靶序列與探針序列不完全互補，即使只

有一個堿基的差異，就會導致雜交不完全，使連接反響無法進展°連

接反響完成后，用一對通用引物擴增連接好的探針，每個探針的擴增

產(chǎn)物的長度都是唯一的，范圍在130?480bp。最終，通過毛細管電

泳別離擴增產(chǎn)物，Genemarker軟件分析，得出結(jié)論。只有當連接反

響完成，才能進展隨后的PCR擴增并收集到相應(yīng)探針的擴增峰，假如

檢測的靶序列發(fā)生點突變或缺失、擴增突變，那么相應(yīng)探針的擴增峰

便會缺失、降低或增加，因此，依據(jù)擴增峰的變更就可推斷靶序列是

否有拷貝數(shù)的異樣或點突變存在。

應(yīng)用：

檢測染色體亞端粒的基因重排智力低下是普及全世界的嚴峻危害

兒童身心安康的一類疾患，其中一局部是由可知緣由引起的，包括感

染、中毒、腦疾病等，但是很大一局部患兒的病因不明。近幾年的探

討發(fā)覺，包括亞端粒在內(nèi)的基因重排是引起智力低下的重要緣由

[M,N],因為亞端粒的基因特別豐富，微小的變更就會累及眾多的基

因，從而導致疾病的發(fā)生。目前，應(yīng)用較多的檢測染色體亞端粒的方

法包括染色體核型分析，熒光原位雜交（FISH）,但是前者不能檢出

亞端粒微小的基因重排，而后者費時、費勁、又特別昂貴，不易推廣。

MLPA-P036和MLPA-P070試劑盒，針對每一個染色體的末端都設(shè)計有

一個特異性探針，它經(jīng)濟、高效、快速，可以用于檢測亞端粒的基因

重排[P,Q],提示局部智障患兒的發(fā)病緣由。

檢測染色體的非整倍性變更[S,T]目前，檢測染色體的非整倍性變

更的方法主要為染色體核型分析，但是它在檢測羊水細胞、絨毛或是

其他胎兒細胞時，須要進展體外細胞培育，假設(shè)培育失敗、細胞過少

或染色體形態(tài)較差時，經(jīng)常影響試驗結(jié)果。應(yīng)用MLPA檢測這類標本

時，不須要體外培育，少量標本即可進展檢測，針對易發(fā)生非整倍性

變更的染色體（13,18,21,X,Y）上的幾個熱點基因設(shè)計特異性探

針，依據(jù)特定基因拷貝數(shù)的變更，即可確定染色體數(shù)目的異樣。

檢測單核甘酸的多態(tài)性（SNP）和點突變依據(jù)MLPA的原理可知，靶

序列DNA只要有一個堿基的變更，便可導致雜交不完全，使其擴增產(chǎn)

物缺失，因此，MLPA高度特異性的檢測可用于多種SNP和點突變。

幾種常見的兒童遺傳性疾病的檢測

1)智力低下綜合征多種的智力低下綜合征與染色體特定區(qū)域

的基因變更相關(guān)。這些患兒臨床表現(xiàn)困難，個體差異大，缺乏特征性

表現(xiàn)，醫(yī)生很難作出精確診斷。MLPA-P064試劑盒，針對特定的染色

體區(qū)域設(shè)計了43個探針，可以明確幾種疾病的診斷[A],包括：Ip-

缺失綜合征，Williams綜合征，Sniith-Magenis綜合征，

Miller-Dieker綜合征,Digeorge綜合征[W],Alagille綜合征，Setos

綜合征。依據(jù)同樣的原理，MLPA-P096試劑盒可檢測的疾病包括：

Wolf-Hirschhorn綜合征，CriduChat綜合征，WAGR綜合征，Dcwns

綜合征等。

2)X連鎖型智力低下[C]X連鎖型智力低下可以分為綜合征型

和非綜合征型，前者具備特征性的臨床表現(xiàn)，而后者沒有特異性病癥,

智力低下經(jīng)常為患兒的唯一表現(xiàn)。目前已經(jīng)發(fā)覺19個基因與X連鎖

型智力低下相關(guān)，MLPA-P106可以檢測其中14個相關(guān)基因的變更。

3)假肥大型肌養(yǎng)分不良癥[D,E,F]假肥大型肌養(yǎng)分不良癥包括

Duchenne型肌養(yǎng)分不良(DMD)和Becker型肌養(yǎng)分不良，臨床表現(xiàn)

主要為骨盆帶肌和下肢近端肌肉無力，腓腸肌假性肥大等，致病基因

位于Xp21.2,包括70多個外顯子。疾病的發(fā)生與DMD基因的缺失、

重復或點突變相關(guān)。MLPA-P034和MLPA-P035試劑盒設(shè)計了80多個

探針可以檢測每一個外顯子的缺失或重復突變，及局部點突變。

4)Prader-Willi綜合征(PWS)和Angelman綜合征(AS)[H,I]

PWS和AS都是由染色體15qll-13缺失或同源二倍體所致。假如是父

源性染色體15qll-13缺失或母源性同源二倍體那么引起PWS,假如

是母源性染色體15ql-13缺失或父源性同源二倍體那么引起AS,在

人類，父源15qllT3區(qū)域存在非甲基化的SNRPN印跡基因，母源性

15qll-13區(qū)域存在完全甲基化的SNRPN印跡基因。甲基化特異性的

MLPA試劑盒ME028采納半定量式的方式可以檢測基因拷貝數(shù)的變更,

探針所識別的DNA序列包括甲基化敏感的核酸內(nèi)切酶HhaI位點，因

此可以分析CpG島的甲基化狀態(tài)，從而區(qū)分PWS和ASo

5〕其他疾病的檢測MLPA還可以用于成神經(jīng)細胞瘤［J］、a-地中

海貧血［K］等疾病的診斷。成神經(jīng)細胞瘤是兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生的

腫瘤，明確特征性基因的變更對確認神經(jīng)腫瘤發(fā)生的過渡階段、治療

和預(yù)后都有重要意義，為臨床供應(yīng)極大的幫助。

優(yōu)缺點：MLPA結(jié)合了DNA探針雜交和PCR技術(shù)，具有以下優(yōu)點1、高

效：一次反響可以校測45個靶序列拷貝數(shù)的變更。2、特異：可以檢

測點突變。3、快速：一次試驗可以在24小時內(nèi)完成。4、簡便：不

同的試劑盒操作根本一樣，簡單駕馭。

MLPA雖然具有很大優(yōu)點，但也有其局限性1、須要精確測量3NA

的濃度，樣本簡單被污染。2、不能用于單個細胞的檢測。3、MLPA

用于檢測基因的缺失或重復，不適合檢測未知的點突變類型。4、不

能檢測染色體的平衡易位。

單核甘酸多態(tài)性SNP

全稱SingleNucleotidePolymorphisms,是指在基因組上單個核計

酸的變異，包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入，形成的遺傳標記，其數(shù)量

很多，多態(tài)性豐富。從理論上來看每一個SNP位點都可以有4種不

同的變異形式，但事實上發(fā)生的只有兩種，即轉(zhuǎn)換和顛換,二者之比為

2：1[1]oSNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，而且多是C轉(zhuǎn)換為T,

緣由是CG中的胞嚓咤常被甲基化,而后自發(fā)地脫氨成為胸腺喀咤。一

般而言,SNP是指變異頻率大于1%的單核甘酸變異。在人類基因組

中也許每1000個堿基就有一個SNP,人類基因組上的SNP總量也許

是3義10%個。因此,SNP成為第三代遺傳園已，人體很多表型差異、

對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關(guān)。

作用和成果：SNP探討是人類基因組方案走向應(yīng)用的重要步驟。這主

要是因為SNP將供應(yīng)一個強有力的工具，用于高危群體的發(fā)覺、疾病

相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計和測試以及生物學的根底探討等。SNP

在基因組中分布相當廣泛，探討說明在人類基因組中每300堿基對就

出現(xiàn)一次。大量存在的SNP位點，使人們有時機發(fā)覺與各種疾病，包

括腫瘤相關(guān)的基因組突變；從試驗操作來看，通過SNP發(fā)覺疾病相關(guān)

基因突變要比通過家系來得簡單；有些SNP并不干脆導致疾病基因的

表達，但由于它與某些疾病基因相鄰，而成為重要的標記。SNP在根

底探討中也發(fā)揮了巨大的作用，通過對Y染色體SNP的分析，使得在

人類進化、人類種群的演化和遷徙領(lǐng)域取得了一系列重要成果。

單核昔酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP),主要

是指在基因組水平上由單個核甘酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。

它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。與全部多態(tài)性的9096以上。

SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500-1000個堿基對中就有1

個，估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多。

SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單

個堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿

基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種狀況。

理論上講，SNP既可能是二等位多態(tài)性，也可能是3個或4個等

位多態(tài)性，但事實上，后兩者特別少見，幾乎可以忽視。因此，通常

所說的SNP都是二等位多態(tài)性的。這種變異可能是轉(zhuǎn)換(CT,在其互

補鏈上那么為GA),也可能是顛換(CA,GT,CG,AT)。轉(zhuǎn)換的

發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3,

其它幾種變異的發(fā)生幾率相像。Wang等的探討也證明白這一點。轉(zhuǎn)

換的幾率之所以高，可能是因為CpG二核甘酸上的胞喀咤殘基是人類

基因組中最易發(fā)生突變的位點，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫

去氨基而形成胸腺I密咤。

在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可

能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，

位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(codingSNP,cSNP)比擬少，因為在外顯子內(nèi)，

其變異率僅及四周序列的l/5o但它在遺傳性疾病探討中卻具有重要

意義，因此cSNP的探討更受關(guān)注。

從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種：一種是

同義cSNP(synonymouscSNP),即SNP所致的編碼序列的變更并不影

響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義一

樣；另一種是非同義cSNP(non-synonyniouscSNP),指堿基序列的變

更可使以其為藍本翻譯的蛋白