葡萄糖氧化酶法測定血清葡萄糖及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

對于血糖的測定從50年代的Folin-吳憲法，60年代的鄰甲苯胺法發(fā)展為80年代的葡萄糖氧化酶法和已糖激酶法。【目的要求】1.掌握GOD-POD法血糖測定的基本原理、操作方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的基本原理與作法。2.熟悉GOD-POD血糖測定法的影響因素及控制方法。3.了解GOD-POD血糖測定法的臨床意義及應(yīng)用?！驹怼科咸烟茄趸?glucoseoxidase，GOD)利用氧和水將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，并釋放過氧化氫。過氧化物酶(peroxidase，POD)在色原性氧受體存在時(shí)將過氧化氫分解為水和氧，并使色原性氧受體4-氨基安替比林和酚去氫縮合為紅色醌類化合物，即Trinder反應(yīng)。紅色醌類化合物的生成量與葡萄糖含量成正比。取試管3支，按下表操作。

混勻，置37℃水浴中，保溫15min，在波長505nm處比色，以空白管調(diào)零，讀取標(biāo)準(zhǔn)管及測定管吸光度。

加入物(ml)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管血清－－0.02葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液－0.02－蒸餾水0.02－－酶酚混合試劑3.03.03.0標(biāo)準(zhǔn)曲線

用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)糖溶液，按測糖方法進(jìn)行光度法測定，讀出不同濃度糖溶液的相應(yīng)吸光度；以吸光度為縱座標(biāo)，以糖濃度為橫座標(biāo)，繪出一曲線，此曲線即稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。1、找出該方法的可測范圍2、標(biāo)準(zhǔn)曲線又叫工作曲線，當(dāng)用同一方法，同一光度計(jì)及波長時(shí)可用標(biāo)準(zhǔn)曲線直接求出末知樣品的含量[原理]

依據(jù)一定濃度范圍內(nèi)的葡萄糖溶液，在特定波長下的吸光度與其濃度成正比的關(guān)系，通過未知和已知濃度葡萄糖溶液的吸光度之比，可算出待測葡萄糖溶液的濃度；或通過繪制已知濃度系列的葡萄糖溶液與其相應(yīng)吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用待測葡萄糖溶液的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接查找出其相應(yīng)的濃度。[結(jié)果]標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(1)在方格坐標(biāo)紙上，以葡萄糖溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以各濃度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)用待測濃度的葡萄糖溶液的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接查得相應(yīng)的濃度數(shù)值。標(biāo)準(zhǔn)曲線法使用有哪些注意事項(xiàng)(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液一般為5-7個(gè)點(diǎn)，至少不少于4個(gè)。

(2)待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)同時(shí)同樣處理，吸光度應(yīng)取幾次測定值得平均值。

(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍應(yīng)在溶液吸光度與其濃度呈線性關(guān)系區(qū)間內(nèi)，且溶液的吸光度值控制在0.1～1.0之間。

(4)長時(shí)間不用后再次使用時(shí)，以及儀器維修調(diào)整后應(yīng)檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線，必要時(shí)應(yīng)重新繪制。【計(jì)算】【參考范圍】空腹血清葡萄糖為3.89～6.11mmol/L。【臨床意義】1．生理性高血糖可見攝入高糖食物后，或情緒緊張腎上腺分泌增加時(shí)。

2．病理性高血糖

(1)糖尿?。翰±硇愿哐浅Ｒ娪谝葝u素絕對或相對不足的糖尿病患者。

(2)內(nèi)分泌腺功能障礙：甲狀腺功能亢進(jìn)，腎上腺皮質(zhì)功能及髓質(zhì)功能亢進(jìn)。引起的各種對抗胰島素的激素分泌過多也會出現(xiàn)高血糖。注意升高血糖的激素增多引起的高血糖，現(xiàn)已歸入特異性糖尿病中。

(3)顱內(nèi)壓增高：顱內(nèi)壓增高刺激血糖中樞，如顱外傷、顱內(nèi)出血、腦膜炎等。

(4)脫水引起的高血糖：如嘔吐、腹瀉和高熱等也可使血糖輕度增高。

3．生理性低血糖見于饑餓和劇烈運(yùn)動(dòng)。4．病理性低血糖(特發(fā)性功能性低血糖最多見，依次是藥源性、肝源性、胰島素瘤等)

(1)胰島β細(xì)胞增生或胰島β細(xì)胞瘤等，使胰島素分泌過多。

(2)對抗胰島素的激素分泌不足，如垂體前葉功能減退、腎上腺皮質(zhì)功能減退和甲狀腺功能減退而使生長素、腎上腺皮質(zhì)激素分泌減少。

(3)嚴(yán)重肝病患者，由于肝臟儲存糖原及糖異生等功能低下，肝臟不能有效地調(diào)節(jié)血糖?！咀⒁馐马?xiàng)】

1．葡萄糖氧化酶對β-D葡萄糖高度特異，溶液中的葡萄糖約36%為α型，64%為β型。葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的變旋反應(yīng)。國外某些商品葡萄糖氧化酶試劑盒含有葡萄糖變旋酶，可加速這一反應(yīng)，但在終點(diǎn)法中，延長孵育時(shí)間可達(dá)到完成自發(fā)變旋過程。新配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液主要是α型，故須放置2h以上(最好過夜)，待變旋平衡后方可應(yīng)用。

2．葡萄糖氧化酶法可直接測定腦脊液葡萄糖含量，但不能直接測定尿液葡萄糖含量。因?yàn)槟蛞褐心蛩岬雀蓴_物質(zhì)濃度過高，可干擾過氧化物酶反應(yīng)，造成結(jié)果假性偏低。3．測定標(biāo)本以草酸鉀－氟化鈉為抗凝劑的血漿較好。取草酸鉀6g，氟化鈉4g。加水溶解至100ml。吸取0.1ml到試管內(nèi)，在80℃以下烤干使用，可使2～3ml血液在3～4天內(nèi)不凝固并抑制糖分解。4．本法用血量甚微，操作中應(yīng)直接加標(biāo)本至試劑中，再吸試劑反復(fù)沖洗吸管，以保證結(jié)果可靠。5．嚴(yán)重黃疸、溶血及乳糜樣血清應(yīng)先制備無蛋白血濾液，然后再進(jìn)行測定。本法測定葡萄糖非常特異，從原理反應(yīng)式中可知第一步是特異反應(yīng)，第二步特異性較差。誤差往往發(fā)生在反應(yīng)的第二步。一些還原性物質(zhì)如尿酸、維生素C、膽紅素和谷胱甘肽等，可與色原性物質(zhì)競爭過氧化氫，從而消耗反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的過氧化氫，產(chǎn)生競爭性抑制，使測定結(jié)果偏低。然而，在本法的測定條件下，溶血標(biāo)本血紅蛋白的濃度達(dá)10g/L，黃疸標(biāo)本膽紅素濃度達(dá)342μmol/L，維生素C小于30mg/L，均不影響測定結(jié)果。氟化鈉濃度達(dá)2g/L不干擾測定結(jié)果。標(biāo)本中含尿素濃度達(dá)46.7mmol/L，尿酸濃度達(dá)2.95mmol/L，肌酐濃度達(dá)4.42mmol/L。半胱氨酸濃度達(dá)3.30mmol/L，甘油三酯濃度達(dá)5.6mmol/L，膽固醇4.40mmol/L，對測定結(jié)果均