實(shí)驗(yàn)二十一血清肌酸激酶的測(cè)定

【目的要求】1、掌握血清CK測(cè)定的原理。2、熟悉半自動(dòng)生化分析儀的應(yīng)用。一、概述肌酸激酶（Creatinekinase，CK，EC2.7.3.2）全稱腺苷三磷酸：肌酸N-磷酸轉(zhuǎn)移酶，催化肌酸（Cr）和ATP或磷酸肌酸（CrP）和ADP之間磷酸轉(zhuǎn)移的可逆反應(yīng)。肌酸+ATP磷酸肌酸+ADP+H+CK偏堿pH有利于順向反應(yīng)進(jìn)行，中性pH傾向逆向反應(yīng)，一般逆向反應(yīng)較順向反應(yīng)快2~6倍；Mg2+是CK的必需激活劑，但過(guò)量反而抑制；肌酸激酶(CK)催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之間的磷酸轉(zhuǎn)移的可逆性反應(yīng)，所產(chǎn)生的磷酸肌酸含高能磷酸鍵，是肌肉收縮時(shí)能量的直接來(lái)源。CK廣泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦。

CK是由M和B兩類亞基組成的二聚體。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在3種同工酶，即CK-BB(CK1)，CK-MB(CK2)和CK-MM(CK3)。在細(xì)胞線粒體內(nèi)還存在另一CK同工酶，即所謂線粒體CK(CK-Mt)，也稱CK4。各種CK同工酶還可進(jìn)一步根據(jù)所帶電荷和等電點(diǎn)不同分離數(shù)目不等的亞型。CK測(cè)定方法比色法酶偶聯(lián)法熒光法比色法1、測(cè)磷法CrP在酸液中易水解成Cr及無(wú)機(jī)磷酸。（ATP與ADP在酸性條件下較穩(wěn)定）

2、酶偶聯(lián)-丙酮酸測(cè)定法

肌酸+ATP磷酸肌酸+ADP

ADP+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸+ATP丙酮酸+2，4-二硝基苯肼丙酮酸-2，4-二硝基苯腙CK丙酮酸激酶利用逆向反應(yīng)CrP+ADPCr+ATPCr+雙乙酰+α-萘酚紅色化合物Mg2+作激活劑；半胱氨酸供給巰基；氫氧化鋇和硫酸鋅沉淀蛋白并終止反應(yīng)。CK逆向反應(yīng)的速度較快，敏感性較高，成為目前國(guó)內(nèi)推薦的主要方法。必須用中性或偏堿的蛋白沉淀劑以防止底物CrP在酸性蛋白沉淀劑中非酶性水解成Cr。酶偶聯(lián)法多利用逆向反應(yīng)，是國(guó)際最常用方法CrP+ADPCr+ATPATP+GluADP+6-P-Glu6-P-Glu+NADP+6-P-GA+NADPH+H+

可在340nm波長(zhǎng)下測(cè)定NADPH生成速率而計(jì)算CK活性濃度。

CK己糖激酶G-6-PD全部反應(yīng)最適pH為6.8~6.9；主要干擾因素①谷光甘肽還原酶②腺苷酸激酶熒光法利用逆向反應(yīng)生成的Cr在強(qiáng)堿性溶液中與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生熒光復(fù)合物，測(cè)其熒光強(qiáng)度，經(jīng)與同樣處理的Cr標(biāo)準(zhǔn)管比較，可計(jì)算CK活力。優(yōu)點(diǎn)：快速、敏感，巰基化合物不產(chǎn)生干擾，試劑易得，操作條件易于掌握。缺點(diǎn)：需精密熒光分光光度計(jì)，不適宜基層單位使用。血清CK同工酶測(cè)定臨床常規(guī)測(cè)定CK同工酶多用電泳和免疫抑制法，但兩法均會(huì)受溶血和巨CK的干擾，免疫抑制法還會(huì)受到CK-BB的干擾。因此現(xiàn)在推薦用免疫化學(xué)方法直接測(cè)定CK—MBmass，可不受溶血和巨CK的干擾。CK同工酶亞型(CK-MM型和CK-MB型)多用瓊脂糖凝膠高壓電泳和等電聚焦電泳等?！驹怼?/p>

磷酸肌酸和ADP在CK的作用下生成肌酸和ATP，ATP與葡萄糖在己糖激酶的作用下生成ADP與6磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖與氧化型輔酶2在6磷酸葡萄糖脫氫酶的作用下生成6磷酸葡糖酸和還原性輔酶2。磷酸肌酸+ADP

CK

肌酸+ATPD-葡萄糖+ATPHKADP+葡萄糖-6-磷酸葡萄糖-6-磷酸+NADPG-6-PDH6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H

利用酶偶聯(lián)反應(yīng)原理連續(xù)監(jiān)測(cè)氧化型輔酶還原生成還原性輔酶，后者引起340nm吸光度的增高，在340nm監(jiān)測(cè)單位時(shí)間內(nèi)生成的還原性輔酶2的生成量（ΔA/min），可計(jì)算出CK的活性濃度?！静僮鳌?，吸應(yīng)用試劑1ml，加入測(cè)定管中，放入37度水浴至少5分鐘。2，加血清50ul，混勻。3，上機(jī)測(cè)定?！居?jì)算】CK＝ΔA/min*106/6220*2.1/0.1【參考范圍】男性：38-174，女性26-140臨床意義

CK及其同工酶和亞型是目前臨床上測(cè)定次數(shù)最多的酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和腦疾患的診斷和鑒別診斷及預(yù)后判斷。

心肌梗死會(huì)出現(xiàn)血清CK活性明顯變化。心肌梗死發(fā)病的早期，即發(fā)病后2-4小時(shí)此酶即開(kāi)始升高，12-48小時(shí)達(dá)高峰，可高達(dá)正常上限的10-12倍，在2-4天降至正常水平。此酶對(duì)診斷心肌梗死較其他的心肌酶譜AST、LD的陽(yáng)性率高，特異性強(qiáng)，是用于心肌梗死的早期診斷，估計(jì)病情和判斷預(yù)后的較好指標(biāo)。病毒性心肌炎時(shí)CK也有明顯升高。而且樣品溶血情況下不影響CK活性測(cè)定

CK極度升高(>3000U／L)主要見(jiàn)于全身疾病，特別是肌肉疾病，此時(shí)CK測(cè)定有助于肌萎縮病因的鑒別，如進(jìn)行性肌萎縮時(shí)可見(jiàn)CK顯著升高。此外，病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌炎、皮肌炎等)，都能引起CK升高。但神經(jīng)疾病引起的肌萎縮，CK活性一般正常。。CK-MM亞型測(cè)定對(duì)早期AMI的檢出更為敏感，一般以CK-MM3／CK-MM1>1.0作為診斷AMI的標(biāo)準(zhǔn)，但必須排除急性骨骼肌損傷。AMI發(fā)病2～4hCK-MM3／CK-MM1即開(kāi)始升高，8～12h達(dá)峰值。CK-MB2亞型在AMI早期診斷和判斷有無(wú)再灌注上有很高的靈敏度和特異性。一般CK-MB2>1.0U／L或CK-MB2／CK-MBl>1.5可作為AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一注意事項(xiàng)1、線性達(dá)300U/L，更高活性的血清用已知CK活性正常的血清稀釋后再用。試劑空白速率小于0.001。2、EDTA有利于試劑的穩(wěn)定。3、紅細(xì)胞及所有組織的AK的影響，標(biāo)本應(yīng)避免嚴(yán)重溶血。4、血清檢測(cè)。樣