實驗十九血清堿性磷酸酶的磷酸苯二鈉法測定堿性磷酸酶是一組在堿性環(huán)境（PH為10左右）中水解磷酸酯的酶類，分子量隨不同組織來源不同，廣泛分布在人體的骨、腎、腸、血清、膽汁等部位，但以骨骼，牙齒、腎和肝中含量較多，正常人血清中的ALP主要來源于肝，少部分來自骨骼。

1964年，國際酶學(xué)委員會按堿性磷酸酶同工酶在淀粉膠電泳上的遷移率，從陽極至陰極依次命名為ALP1、ALP2、ALP3及ALP4，但一般習(xí)慣還是按同工酶的器官來源而命名的，分別稱為肝、骨、小腸、胎盤和膽汁等五種同工酶。正常成人血清ALP主要來自肝臟，而來自骨組織的ALP一般少于總活性一半。其各自含量與年齡密切相關(guān)，但也受性別的影響。血清ALP測定可用于肝膽系統(tǒng)及骨骼系統(tǒng)疾病的輔助診斷。是臨床常做的酶類檢驗項目之一。測定ALP的方法主要分為二種，一是測定底物解離下的磷酸根來計算酶活力，如β-甘油磷酸鈉法，但存在血清本身有磷酸根及磷酸化的缺點；二是測定底物解離磷酸根后的羥基化合物，這種方法又可分為：1，酚化合物在顯色劑的作用下顯色比色測定。2，生成的酚化合物本身在一定的條件下就可顯色，如磷酸對硝基酚法。磷酸對硝基苯酚（4-NPP）在堿性磷酸酶的作用下，將其磷酸基轉(zhuǎn)移到2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP）受體分子上，釋放出的對硝基苯酚（4-NP）在堿性溶液中分子重排形成黃色醌，可在405nm下檢測。黃色醌形成速率與ALP活力成正比。

ALP4-NPP+H2O→4-NP+磷酸

Mg2+,堿性

【目的要求】1、掌握磷酸苯二鈉法測血清ALP活性。2、熟悉ALP測定的臨床意義【實驗原理】堿性磷酸酶在堿性環(huán)境中作用于磷酸苯二鈉，使之水解釋放出酚和磷酸。酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化形成紅色醌類化合物，根據(jù)紅色的深淺確定ALP活性。【參考范圍】成人：3～13單位，兒童：5～28單位

ALP金氏單位定義是100ml血清，37℃與底物保溫15分鐘，產(chǎn)生1mg酚為1個金氏單位。操作步驟：1，校正曲線的制作按表操作加入物(ml)B

1

23

4

5酚標(biāo)準(zhǔn)液0.00.2

0.4

0.6

0.8

1.0蒸餾水1.10.90.70.50.30.1碳酸鹽緩沖液1.01.0

1.0

1.0

1.0

1.0鐵氰化鉀溶液3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0相當(dāng)于金氏單位010

203040

50立即混勻，于510nm波長處比色，比色杯光徑為1.0cm，用蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的酶活性單位為橫坐標(biāo)繪制校正曲線。2，標(biāo)本的測定按表操作加入物(ml)對照管測定管血清-0.1碳酸鹽緩沖液1.0

1.0

37度水浴5分鐘底物溶液(預(yù)溫至37度)1.01.0混勻,37度水浴15分鐘鐵氰化鉀溶液3.0

3.0

血清0.1-立即混勻，于510nm波長處比色，比色杯光徑為1.0cm，用蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度。以測定管與對照管吸光度之差值查校正曲線，得酶活性。【注意事項】1，底物溶液中不應(yīng)含有游離的酚，如有酚則空白管顯紅色，說明磷酸苯二鈉已經(jīng)開始分解，應(yīng)棄去不用。2，鐵氰化鉀溶液中加入硼酸有穩(wěn)定顯色的作用。該液應(yīng)避光保存，如出現(xiàn)藍綠色即應(yīng)廢棄。3,加入鐵氰化鉀溶液后必須應(yīng)即混勻，否則顯色不完全。4，黃疸血清及溶血血清應(yīng)分別作對照管，一般血清標(biāo)本可以共用對照管。【方法評價】磷酸苯二鈉比色法與更早的β-甘油磷酸鈉法相比具有較大的優(yōu)點，如水解速度快，保溫時間較短、靈敏度較高、顯色穩(wěn)定、不需去蛋白、操作簡單、快速。但與磷酸對硝基酚連續(xù)監(jiān)測法相比，準(zhǔn)確度、精密度較低；操作比較繁瑣,，靈敏度低。酶單位不是國際單位，受膽紅素和溶血的干擾?！九R床意義】1，升高：肝膽疾病。主要見于（1）阻塞性黃疸，急、慢性黃疸性肝炎，肝癌等均可引起血清ALP活力不同程度的升高，其中以癌性梗阻最明顯。（2）各種骨骼疾病如佝僂病、纖維性骨病、成骨不全癥、骨轉(zhuǎn)移癌和骨折修復(fù)愈合期等，由于骨損傷或病變使骨細胞內(nèi)高濃度的ALP釋放入血，引起血清ALP升高。2，降低：主要見于呆小癥，磷酸酶過少癥，維生素C缺乏癥。【思考題】1，血清ALP測定有何臨床意義。2，對于ALP水解的底物測定有哪些方法卡門氏單位：1.0ml血清在25℃，340nm，反應(yīng)體積3.0ml,光