CBJY-PCR-SOP-018室內(nèi)質(zhì)控品配制作業(yè)指導(dǎo)書1目的規(guī)范聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測實驗室室內(nèi)質(zhì)控品的配制流程，確保質(zhì)控品的均一性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，為PCR檢測結(jié)果的質(zhì)量控制提供可靠保障，保障檢測過程的規(guī)范性和結(jié)果的可信度。2范圍本作業(yè)指導(dǎo)書適用于CBJY-PCR實驗室所有常規(guī)PCR檢測項目對應(yīng)的室內(nèi)質(zhì)控品（包括陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、臨界值質(zhì)控品）的配制、分裝、儲存及使用前驗證等相關(guān)操作。3職責(zé)3.1實驗室負責(zé)人負責(zé)審批本作業(yè)指導(dǎo)書，確保配制所需的人員、設(shè)備、試劑等資源配備到位，監(jiān)督本SOP的嚴(yán)格執(zhí)行。3.2質(zhì)控人員負責(zé)按照本SOP要求執(zhí)行室內(nèi)質(zhì)控品的配制、分裝、標(biāo)識、儲存及驗證工作，及時記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)異常情況及時上報。3.3檢測人員負責(zé)正確使用配制好的室內(nèi)質(zhì)控品，配合質(zhì)控人員完成驗證相關(guān)的檢測工作，反饋質(zhì)控品使用過程中出現(xiàn)的問題。4定義與術(shù)語4.1室內(nèi)質(zhì)控品由實驗室自行配制或外購后分裝的，用于監(jiān)控PCR檢測全過程（包括核酸提取、擴增、檢測）質(zhì)量的物質(zhì)，分為陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和臨界值質(zhì)控品。4.2陽性質(zhì)控品含有目標(biāo)檢測核酸序列的質(zhì)控物質(zhì)，用于驗證PCR檢測體系的擴增效率和特異性，確保檢測過程中陽性樣本能夠被準(zhǔn)確檢出。4.3陰性質(zhì)控品不含有目標(biāo)檢測核酸序列的質(zhì)控物質(zhì)，用于監(jiān)控PCR檢測過程中的污染情況，確保檢測結(jié)果不會出現(xiàn)假陽性。4.4臨界值質(zhì)控品含有低濃度目標(biāo)檢測核酸序列（濃度接近檢測方法的臨界值）的質(zhì)控物質(zhì)，用于監(jiān)控PCR檢測方法的靈敏度和穩(wěn)定性。5作業(yè)流程5.1配制前準(zhǔn)備5.1.1人員準(zhǔn)備操作人員需經(jīng)過PCR實驗室相關(guān)培訓(xùn)并考核合格，熟悉本SOP要求，穿戴好個人防護裝備（PPE），包括實驗服、一次性手套、口罩、帽子，必要時佩戴護目鏡。5.1.2環(huán)境準(zhǔn)備配制操作需在PCR實驗室的試劑準(zhǔn)備區(qū)進行，提前對實驗臺面進行消毒（使用75%乙醇擦拭），確保環(huán)境清潔、無灰塵、無污染源，溫濕度控制在實驗要求范圍內(nèi)（溫度18-25℃，相對濕度40%-60%）。5.1.3設(shè)備與試劑準(zhǔn)備設(shè)備：檢查移液器（不同量程）、電子天平、離心機、渦旋振蕩器、冰箱（-20℃、-80℃）、超凈工作臺等設(shè)備是否正常運行，定期校準(zhǔn)的設(shè)備需在校準(zhǔn)有效期內(nèi)；試劑：根據(jù)質(zhì)控品類型準(zhǔn)備對應(yīng)的原料（如陽性模板、無核酸酶水、生理鹽水、胎牛血清等）、防腐劑（如疊氮鈉，按需添加），所有試劑需在有效期內(nèi)，儲存條件符合要求，打開后需標(biāo)注開啟日期；耗材：準(zhǔn)備無核酸酶離心管、吸頭，提前進行高壓滅菌或選用無菌無酶耗材，耗材外包裝完好無破損。5.2質(zhì)控品配制操作5.2.1陰性質(zhì)控品配制選取無核酸酶水或生理鹽水作為陰性質(zhì)控品基質(zhì)，若模擬臨床樣本（如血液、痰液），可選用不含目標(biāo)核酸的對應(yīng)臨床樣本基質(zhì)（需經(jīng)檢測確認(rèn)無目標(biāo)核酸）；在超凈工作臺內(nèi)，用經(jīng)消毒的移液器吸取適量基質(zhì)至無菌離心管中，如需添加防腐劑（如疊氮鈉終濃度0.02%-0.05%），準(zhǔn)確量取防腐劑溶液加入后，置于渦旋振蕩器上充分混勻1-2分鐘；配制完成后，標(biāo)記質(zhì)控品名稱、濃度（陰性）、配制日期、配制人。5.2.2陽性質(zhì)控品配制根據(jù)檢測項目的目標(biāo)核酸序列，選取對應(yīng)的陽性模板（如質(zhì)粒、體外轉(zhuǎn)錄RNA、陽性臨床樣本提取的核酸）；使用電子天平或移液器準(zhǔn)確量取陽性模板和稀釋液（無核酸酶水或?qū)?yīng)的樣本基質(zhì)），按照預(yù)設(shè)濃度進行梯度稀釋，例如：將高濃度陽性模板稀釋至1×10?copies/μL作為儲備液，再進一步稀釋至1×103-1×10?copies/μL作為工作液；稀釋過程中，每一步稀釋后均需渦旋混勻1-2分鐘，必要時離心（3000rpm，1分鐘）收集液體；若需長期儲存，可添加適量保護劑（如50%甘油），充分混勻后標(biāo)記質(zhì)控品名稱、目標(biāo)序列、濃度、配制日期、配制人。5.2.3臨界值質(zhì)控品配制以陽性質(zhì)控品儲備液為原料，采用無核酸酶水或?qū)?yīng)樣本基質(zhì)進行梯度稀釋；通過預(yù)實驗確定臨界值濃度范圍（通常為檢測方法檢出限的1-2倍），將陽性模板稀釋至該范圍內(nèi)，多次稀釋后混勻，確保濃度均勻；配制完成后，標(biāo)記質(zhì)控品名稱、目標(biāo)序列、臨界濃度、配制日期、配制人。5.3分裝與儲存將配制好的各類質(zhì)控品在超凈工作臺內(nèi)進行分裝，根據(jù)日常使用量，分裝至無菌無酶離心管中，每管體積建議為20-100μL，避免反復(fù)凍融；分裝完成后，立即加蓋密封，再次核對并完善標(biāo)簽信息（包括質(zhì)控品類型、名稱、濃度、配制日期、有效期、配制人、實驗室標(biāo)識）；將分裝后的質(zhì)控品置于-20℃冰箱短期儲存（1個月內(nèi)使用），長期儲存（超過1個月）需置于-80℃冰箱；陰性質(zhì)控品若為液體基質(zhì)，可根據(jù)需求冷藏（2-8℃）儲存，但需定期檢測穩(wěn)定性；儲存時需分類存放，避免與樣本、其他試劑混放，防止交叉污染，冰箱內(nèi)放置溫度計，定期記錄溫度。5.4配制后驗證5.4.1均一性驗證從分裝后的同一批次質(zhì)控品中隨機抽取3-5管，采用對應(yīng)的PCR檢測方法進行檢測，記錄檢測結(jié)果（如Ct值、熒光強度）。陽性質(zhì)控品和臨界值質(zhì)控品的檢測結(jié)果變異系數(shù)（CV）應(yīng)≤5%，陰性質(zhì)控品應(yīng)無擴增信號，確保質(zhì)控品均一性合格。5.4.2穩(wěn)定性驗證短期穩(wěn)定性：將質(zhì)控品在-20℃儲存1個月后，隨機抽取3管進行檢測，與配制完成時的檢測結(jié)果對比，陽性質(zhì)控品Ct值變化≤1.0，臨界值質(zhì)控品Ct值變化≤1.5，陰性質(zhì)控品無擴增；長期穩(wěn)定性：每3個月從-80℃儲存的質(zhì)控品中隨機抽取3管進行檢測，監(jiān)測結(jié)果變化，若出現(xiàn)Ct值顯著變化（超過上述范圍）或陰性質(zhì)控品出現(xiàn)擴增，需重新配制該批次質(zhì)控品；反復(fù)凍融穩(wěn)定性：將質(zhì)控品進行3-5次凍融循環(huán)后檢測，結(jié)果變化應(yīng)符合短期穩(wěn)定性要求，否則需優(yōu)化儲存方式（如增加分裝量，減少凍融次數(shù)）。5.4.3特異性驗證采用非目標(biāo)序列的PCR檢測體系對陽性質(zhì)控品進行檢測，應(yīng)無擴增信號；陰性質(zhì)控品在目標(biāo)序列檢測體系中無擴增信號，確保質(zhì)控品特異性合格。6注意事項配制過程中嚴(yán)格遵守PCR實驗室分區(qū)管理要求，試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增區(qū)嚴(yán)格分開，避免交叉污染；所有操作均需在超凈工作臺內(nèi)進行，移液器使用前需用75%乙醇消毒，吸頭一次性使用，避免重復(fù)使用導(dǎo)致污染；配制過程中需及時、準(zhǔn)確填寫《室內(nèi)質(zhì)控品配制記錄》，包括配制日期、質(zhì)控品類型、原料信息、濃度、分裝數(shù)量、儲存條件、驗證結(jié)果等，記錄需完整、清晰、可追溯；質(zhì)控品有效期需根據(jù)穩(wěn)定性驗證結(jié)果確定，超過有效期的質(zhì)控品禁止使用，需按實驗室廢棄物處理規(guī)定進行無害化處理；若配制過程中出現(xiàn)試劑污染、設(shè)備故障等異常情況，需立即停止操作，對環(huán)境、設(shè)備進行徹底消毒，排查原因并記錄，重新進行配制；防腐劑（如疊氮鈉）具有毒性，操作時需嚴(yán)格遵守安全規(guī)范，避免直接接觸皮膚和黏膜，若發(fā)生接觸，立即用大量清水沖洗；定期對配制的室內(nèi)質(zhì)控品進行回顧分析，總結(jié)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，優(yōu)化配制方案。7記錄與表單7.1《室內(nèi)質(zhì)控品配制記錄表》（附錄A）7.2《室內(nèi)質(zhì)控品驗證記錄表》（附錄B）7.3《冰箱溫度記錄表》8附錄附錄A《室內(nèi)質(zhì)控品配制記錄表》記錄編號質(zhì)控品名稱/類型目標(biāo)序列原料信息（名稱、批號、廠家）配制濃度配制體